微波-超聲輔助雙水相提取藜麥皮皂苷工藝

楊潔*，高佳麗，辛燕花，鞠韜，趙二勞

1. 忻州師范學(xué)院化學(xué)系（忻州 034000）；2. 忻州師范學(xué)院生物系（忻州 034000）

藜麥（Chenopodium quinoɑWilld.）為藜科藜屬雙子葉一年生草本植物，其種子營(yíng)養(yǎng)全面而獨(dú)特，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織認(rèn)定的唯一一種單體植物即可滿足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的食物，譽(yù)為“未來的超級(jí)谷物”和“有機(jī)谷類之王”[1]。藜麥原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，中國(guó)1987年開始引種，現(xiàn)山西、青海、陜西、四川和寧夏等地已規(guī)?；N植[2]，資源較為豐富。藜麥皮是藜麥生產(chǎn)加工中的副產(chǎn)品，多被用作飼料或廢棄，既造成資源的浪費(fèi)，又污染環(huán)境。研究表明，藜麥皮中含有皂苷，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫[3]、抗炎性[4]、抗腫瘤[5]和抑菌[6-7]等多種功能活性，在醫(yī)藥、食品、保健品等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，研究藜麥皮中皂苷的提取，對(duì)于藜麥皮的高值化利用、有效拉長(zhǎng)藜麥產(chǎn)業(yè)鏈、提高藜麥的經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重要的實(shí)際意義。

已有一些藜麥皮中皂苷的提取研究報(bào)道，如許效群等[8]研究藜麥麩皮中皂苷的乙醇回流提取，楊潔等[9]研究藜麥皮皂苷的微波輔助乙醇提取，但相關(guān)研究很不充分，且未見超聲-微波聯(lián)合輔助提取的研究報(bào)道。基于雙水相體系提取皂苷優(yōu)勢(shì)，研究超聲-微波輔助雙水相提取藜麥皮中皂苷，采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，為藜麥皮中皂苷的有效開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥皮（山西華青藜麥產(chǎn)品開發(fā)有限公司）。石油醚脫脂后，烘箱中60 ℃烘干，粉碎過60目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

XH-200A電腦微波固液相合成/萃取工作站（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；V-1100D型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線曲線繪制

參考文獻(xiàn)[10]的方法，準(zhǔn)確稱取5.0 mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解定容至100 mL，得質(zhì)量濃度0.05 mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確移取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20和1.40 mL于10 mL具塞試管中，揮干溶劑，都加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸，加塞搖勻，于70℃水浴反應(yīng)15 min，取出后用冰水浴冷卻5 min，加入5 mL冰醋酸稀釋，搖勻，靜置10 min。以試劑空白為參比，波長(zhǎng)546 nm處測(cè)其吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，齊墩果酸濃度c（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=63.171 4c-0.037 7，R2=0.999 2。

1.3.2 藜麥皮中皂苷測(cè)定及測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.0 g藜麥皮，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行微波-超聲輔助雙水相提取，提取結(jié)束后靜置分層，取上清液定容為50 mL。

準(zhǔn)確移取一定體積提取液，按1.3.1中方法測(cè)定其皂苷濃度，并按式（1）計(jì)算皂苷提取率。

標(biāo)準(zhǔn)配送式變電站采用面向間隔與功能的模塊化設(shè)計(jì)原則，形成“預(yù)制艙式二次組合設(shè)備+預(yù)制式組合二次設(shè)備+預(yù)制式智能控制柜”的模塊化設(shè)計(jì)方案[1]。標(biāo)準(zhǔn)配送式變電站站內(nèi)二次設(shè)備模塊主要包括預(yù)制艙式二次組合設(shè)備、預(yù)制式智能控制柜、預(yù)制式組合二次設(shè)備，其中公用二次設(shè)備采用模塊化二次組合設(shè)備，布置于裝配式建筑物內(nèi)；各電壓等級(jí)及主變間隔二次設(shè)備采用預(yù)制艙式二次組合設(shè)備，布置于配電裝置場(chǎng)地；合并單元、智能終端等二次設(shè)備選用預(yù)制式智能控制柜，與匯控柜一體化布置于配電裝置場(chǎng)地[2]。

1.4 單因素試驗(yàn)

固定其他條件不變，分別考察醇水比值（0.65，0.70，0.75，0.80和0.85）、料液比（1︰30，1︰40，1︰50，1︰60和1︰70 g/mL）、加鹽（磷酸氫二鉀）量（1.5，2.5，3.5，4.5和5.5 g）、微波功率（400，50，500，550和600 W）、微波時(shí)間（1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 min）、微波溫度（30，40，50，60和70 ℃）、超聲功率（240，280，320，360和400 W）、超聲時(shí)間（5，10，15，20和25 min）和超聲溫度（20，30，40，50和60 ℃）對(duì)皂苷提取率的影響。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥皮皂苷提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)皂苷提取率影響較大的醇水比值、料液比、加鹽量、微波功率4個(gè)因素為自變量，以皂苷提取率（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 醇水比值對(duì)皂苷提取率的影響

醇水比值對(duì)皂苷提取率的影響見圖1。藜麥皮皂苷提取率隨醇水比值增加而先增后降。醇水比值0.75時(shí)，皂苷提取率達(dá)最大。這可能與藜麥皮皂苷的極性有關(guān)，醇水比值0.75時(shí)與藜麥皮皂苷極性相當(dāng)，有利于皂苷的溶出。因此，選擇醇水比值0.75。

2.1.2 料液比對(duì)皂苷提取率的影響

料液比對(duì)皂苷提取率的影響見圖2。藜麥皮皂苷提取率在一定范圍內(nèi)隨著料液比減小而增大，料液比1∶60（g/mL）時(shí)，藜麥皮皂苷提取率達(dá)最大；料液比小于后，隨料液比減小提取率略有減小。其原因可能是隨料液比減小，溶劑量增大，有利于皂苷的溶出，提取率增大；料液比達(dá)到一定值后，藜麥皮中皂苷已基本溶出，再增加溶劑量，也不能增加皂苷溶出量，導(dǎo)致提取率減小。因此選擇料液比1∶60（g/mL）。

圖1 醇水比值對(duì)提取率的影響

圖2 料液比對(duì)提取率的影響

2.1.3 加鹽（磷酸氫二鉀）量對(duì)皂苷提取率的影響

加鹽（磷酸氫二鉀）量對(duì)皂苷提取率的影響見圖3。隨加鹽量增加藜麥皮皂苷提取率先增后降。加鹽量3.5 g時(shí)，藜麥皮皂苷提取率達(dá)最；加鹽量大于3.5 g后，隨著加鹽量增大皂苷提取率減小。其原因可能是加鹽量增加，水相體積增加，使得上相乙醇相濃度增大，有利于皂苷溶出；加鹽量過大時(shí)，水相可能產(chǎn)生一定鹽析效應(yīng)使提取率下降[11]。因此，選擇加鹽量為3.5 g。

圖3 加鹽量對(duì)提取率的影響

2.1.4 微波功率對(duì)提取率的影響

微波功率對(duì)提取率的影響見圖4。微波功率小于450 W，隨微波功率增加皂苷提取率增加；微波功率450 W時(shí)，皂苷提取率達(dá)最大；微波功率大于450 W后，隨微波功率增大皂苷提取率下降。其原因可能是微波功率過小，皂苷溶出不完全，增加微波功率，有利于皂苷溶出，但微波功率過高會(huì)破壞皂苷結(jié)構(gòu)[12]，導(dǎo)致提取率降低。因此，選擇微波功率為450 W。

圖4 微波功率對(duì)提取率的影響

2.1.5 微波時(shí)間對(duì)皂苷提取率的影響

微波時(shí)間對(duì)皂苷提取率的影響見圖5。微波時(shí)間1.5 min時(shí)，藜麥皮皂苷提取率達(dá)最大。微波時(shí)間大于1.5 min后，隨微波時(shí)間增加皂苷提取率降低?？赡茉蚴请S微波時(shí)間增加，會(huì)使部分皂苷氧化降解，導(dǎo)致皂苷提取率降低[13]。因此，選擇微波時(shí)間為1.5 min。

圖5 微波時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.1.6 微波溫度對(duì)皂苷提取率的影響

微波溫度對(duì)皂苷提取率的影響見圖6。藜麥皮皂苷提取率隨微波溫度增加先增后降，微波溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，皂苷提取率最大，之后隨微波溫度增大而減小。其原因可能是微波溫度升高，有利于分子擴(kuò)散，加快皂苷的溶出，但溫度過高，會(huì)使部分皂苷分解，導(dǎo)致提取率下降[13]。因此選擇微波溫度為40 ℃。

圖6 微波溫度對(duì)提取率的影響

2.1.7 超聲功率對(duì)皂苷提取率的影響

超聲功率對(duì)皂苷提取率的影響見圖7。藜麥皮皂苷提取率隨超聲功率增加而增大，超聲功率的增加有利于皂苷的提取。但總體而言，在試驗(yàn)的超聲功率范圍內(nèi)，隨超聲功率增大，皂苷提取率變化不大。因此，選擇超聲功率為400 W。

圖7 超聲功率對(duì)提取率的影響

2.1.8 超聲時(shí)間對(duì)皂苷提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)皂苷提取率的影響見圖8。藜麥皮皂苷提取率隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)增加，超聲時(shí)間達(dá)到10 min時(shí)，皂苷提取率達(dá)最大；隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)而減小。可能是由于超聲時(shí)間短，皂苷溶出不完全，提取率低，但時(shí)間過程會(huì)破壞某些皂苷類成分結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率下降[13]。因此，選擇超聲時(shí)間為10 min。

圖8 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.1.9 超聲溫度對(duì)皂苷提取率的影響

超聲溫度對(duì)皂苷提取率的影響見圖9。藜麥皮皂苷提取率隨超聲溫度升高而增大，在超聲溫度50 ℃時(shí)，藜麥皮皂苷提取率達(dá)到最大，之后隨超聲溫度升高，過高溫度會(huì)破壞皂苷結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率降低。因此選擇超聲溫度為50 ℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定超聲功率400 W，超聲時(shí)間10 min，超聲溫度50 ℃，微波時(shí)間1.5 min，微波溫度40 ℃，選擇對(duì)提取影響較大的醇水比值、料液比、加鹽量和微波功率4因素，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2?；貧w方程的方差分析見表3。

圖9 超聲溫度對(duì)提取率的影響

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 二次多項(xiàng)回歸方程及方差分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得皂苷提取率（Y）與醇水比值（A）、料液比（B）、加鹽量（C）和微波功率（D）的回歸方程為：Y=5.43+0.020A-0.058B+0.19C+0.062D+0.060AB+0.035AC-0.15AD+0.035BC-0.12BD-5.000E-003CD-0.79A2-0.30B2-0.61C2-0.022D2。

由表3方差分析可知，模型回歸極顯著（p＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），且模型R2=0.988 1，調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.976 2，說明試驗(yàn)誤差小，該模型擬合程度良好，能很好地描述試驗(yàn)結(jié)果。變異系數(shù)CV=1.59%，說明試驗(yàn)操作穩(wěn)定，可信度高[14]。由各項(xiàng)方差分析結(jié)果可知影響藜麥皂苷提取率的因素大小順序?yàn)榧欲}量＞微波功率＞料液比＞醇水比值，且加鹽量的一次項(xiàng)達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），料液比、微波功率的一次項(xiàng)達(dá)到顯著水平（p＜0.05）；除微波功率外，其他因素的二次項(xiàng)對(duì)皂苷提取率的影響均為極顯著（p＜0.01）。表明各因素對(duì)皂苷提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表3 方差分析

2.2.3 各因素交互作用分析

利用Design Expert 8.0.6軟件作二因素響應(yīng)面圖，研究影響藜麥皮皂苷提取率的各因素交互作用，結(jié)果見圖10～圖15。響應(yīng)面曲面傾斜度越高，即坡度越陡，等高線越橢圓，交互作用越顯著[15]，顯見，醇水比值和微波功率、料液比和微波功率之間交互極顯著（p＜0.05），這與模型的方差分析結(jié)果一致。

圖10 料液比與醇水比值對(duì)藜麥皮皂苷提取率影響的交互作用曲面圖

圖11 加鹽量與醇水比值對(duì)藜麥皮皂苷提取率影響的交互作用曲面圖

圖12 微波功率與醇水比值對(duì)藜麥皮皂苷提取率影響的交互作用曲面圖

圖13 加鹽量與料液比對(duì)藜麥皮皂苷提取率影響的交互作用曲面圖

圖14 微波功率與料液比對(duì)藜麥皮皂苷提取率影響的交互作用曲面圖

圖15 微波功率與加鹽量對(duì)藜麥皮皂苷提取率影響的交互作用曲面圖

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

由Design Expert 8.0.6軟件求解回歸方程，得到微波-超聲協(xié)同輔助雙水相提取藜麥皮皂苷最佳工藝條件為：醇水比值0.75，料液比1∶58.30 g/mL，加鹽（磷酸氫二鉀）量3.63 g，微波功率496.23 W。此時(shí)藜麥皮皂苷理論預(yù)測(cè)提取率為5.51%?？紤]實(shí)際操作的方便性，將最佳工藝條件調(diào)整為：醇水比值0.75，料液比1︰58 g/mL，加鹽（磷酸氫二鉀）量3.63 g，微波功率500 W，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得藜麥皮皂苷平均提取率為5.53%，與理論預(yù)測(cè)值接近，無顯著性差異（p＞0.05），表明該工藝穩(wěn)定、可靠。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以皂苷提取率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析的方法優(yōu)化微波-超聲輔助雙水相提取藜麥皮皂苷的工藝條件。結(jié)果表明，影響藜麥皂苷提取率的因素大小順序?yàn)椋杭欲}量＞微波功率＞料液比＞醇水比值。且加鹽（磷酸氫二鉀）量對(duì)藜麥皂苷提取影響極顯著（p＜0.01），料液比和微波功率對(duì)藜麥皂苷提取影響顯著（p＜0.05）。響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳工藝條件為：醇水比值0.75，料液比1︰58.30（g/mL），加鹽（磷酸氫二鉀）量3.63 g，微波功率496.23 W。此工藝下，藜麥皮皂苷理論預(yù)測(cè)提取率為5.51%?？紤]試驗(yàn)操作的方便性，最終確定的最佳工藝條件為：醇水比值0.75，料液比1︰58（g/mL），加鹽（磷酸氫二鉀）量3.63 g，微波功率500 W。此工藝條件下，藜麥皮皂苷3次平均提取率為5.53%。與理論預(yù)測(cè)值接近，無顯著性差異（p＞0.05）。表明工藝穩(wěn)定、可靠。試驗(yàn)為藜麥皮皂苷的提取應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。