• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    PET水解酶的研究進展

    2020-11-02 08:51:40石利霞高松楓朱蕾蕾
    生物技術(shù)通報 2020年10期
    關(guān)鍵詞:水解酶角質(zhì)殘基

    石利霞 高松楓 朱蕾蕾

    (中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所,天津 300308)

    聚對苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate,PET)是以石油為原料的一種常見塑料,由對苯二甲酸(Terephthalic acid,TPA)和乙二醇(Ethylene glycol,EG)通過酯鍵聚合而成[1]。PET廣泛應用于包裝、建筑、電氣等行業(yè),如飲料瓶、薄膜和工程塑料[2]。PET在被廣泛應用的同時,由于其廢棄物難以自然降解而造成了嚴重的環(huán)境污染。目前,PET廢棄物的處理方法主要有垃圾填埋法、熱處理法、化學回收法,這3種處理方式產(chǎn)生的廢氣廢水均會對環(huán)境造成二次污染且?guī)砭薮蟮哪茉聪模?]。近年來,生物回收塑料廢棄物因其作用條件比較溫和環(huán)保、安全性較高而備受關(guān)注,將有望發(fā)展成為塑料降解的方法之一。

    目前已從微生物中分離出多種PET水解酶,包 括 角 質(zhì) 酶[4-12]、脂 肪 酶[13-22]、PETase[23]等。PET水解酶可在較為溫和的條件下將PET水解為對苯二甲酸單羥乙酯(Mono(2-hydroxyethyl)terephthalic acid,MHET)、對苯二甲酸雙羥乙酯(Bis(2-hydroxyethyl)terephthalic acid,BHET)、乙二醇(Ethylene glycol,EG)和對苯二甲酸(Terephthalic acid,TPA)等組分(圖1),而得到的單體可進一步循環(huán)利用,更加綠色環(huán)保。因此,使用酶法降解PET具有不可替代的優(yōu)勢。其中,脂肪酶對PET的水解活性最低,這可能是由于其催化中心被“蓋子”結(jié)構(gòu)覆蓋,從而阻礙了酶與底物的有效催化,一般需要在反應體系中添加表面活性劑(如洗滌劑或增塑劑)進行界面活化以增強活性[15]。角質(zhì)酶是目前研究最廣泛的PET水解酶,已解析獲得若干來源于細菌和真菌的角質(zhì)酶的晶體結(jié)構(gòu)(表1),其含有較寬的底物結(jié)合口袋且沒有“蓋子”結(jié)構(gòu),容許剛性長鏈聚合底物PET進入酶的活性中心,所以對PET的水解活性較高。角質(zhì)酶一般在高溫(50-70℃)條件下才能發(fā)揮降解作用(表1)。目前已發(fā)現(xiàn)幾種角質(zhì)酶可以顯著降解結(jié)晶度較低的PET,如LCC[5]、HiC[6]等。將角質(zhì)酶、脂肪酶用于PET水解是老酶新用,而PETase是2016年Yoshida等[23]從一種能“吃”PET塑料的細菌Ideonella sakaiensis中分離出的一種新型PET水解酶。它能夠在30℃條件下高效特異性水解PET,但其熱穩(wěn)定性較差,與角質(zhì)酶在高溫條件下才能發(fā)揮降解作用形成了鮮明的對比。其次,Yoshida等還發(fā)現(xiàn)Ideonella sakaiensis中存在一種類似阿魏酸酯酶的MHET水解酶MHETase,可將PET主要中間產(chǎn)物MHET特異性水解生成TPA和EG(圖1),對PET的完全降解也很重要。

    PET水解酶在PET生物降解中顯示出巨大的潛力,但PET水解酶在催化效率、熱穩(wěn)定性等方面仍存在諸多不足,目前無法很好地滿足工業(yè)應用需求。隨著蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)、催化機制等研究的深入,利用(半)理性設計對PET水解酶進行分子改造的研究備受關(guān)注。本文綜述了不同PET水解酶的結(jié)構(gòu)、降解機理,重點介紹了角質(zhì)酶和PETase的分子改造進展,旨在為改造PET水解酶以實現(xiàn)其工業(yè)化應用提供一定的參考依據(jù)。

    1 PET水解酶

    1.1 角質(zhì)酶

    角質(zhì)酶是存在于大多數(shù)植物病原菌和腐生植物中的胞外絲氨酸酯酶,可以水解水溶性酯、乳化的三酰甘油及合成聚酯,如聚ε-己內(nèi)酯(Polycaprolactone,PCL)和聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)等[24]。表1列出了目前報道的可水解PET的角質(zhì)酶類型及降解能力。

    1.1.1 角質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)和催化機制 角質(zhì)酶屬于絲氨酸水解酶家族,具有α/β-水解酶結(jié)構(gòu)。角質(zhì)酶的活性位點處有氧陰離子穴,用于識別、結(jié)合底物;其催化三聯(lián)體(Ser-His-Asp)一般位于由疏水氨基酸包圍的表面溝槽中,有利于容納底物PET[9]。

    來源于Thermobifida fuscaKW3的TfCut2的 晶體結(jié)構(gòu)表明(圖2),殘基Y60和M131可以形成氧陰離子空穴,它們的主鏈氮原子與底物PET的羰基氧原子相互作用,從而使可裂解酯鍵靠近催化三聯(lián)體中的活性絲氨酸。此外,I178、W155和F209與PET鏈的苯環(huán)之間具有疏水相互作用,這些殘基與PET的相互作用均有利于酶對底物的識別[12]。

    圖1 PET水解酶降解PET過程

    表1 可水解PET的角質(zhì)酶類型及降解能力

    圖2 TfCut2的結(jié)構(gòu)(PDB:4CG1)[12]

    1.1.2 角質(zhì)酶的分子改造進展

    1.1.2.1 擴大酶活性位點空間及增加疏水性以提高角質(zhì)酶活力 酶與底物的識別及結(jié)合是酶解過程中的重要環(huán)節(jié),這要求酶的活性位點處有足夠的空間容納聚酯底物,因而對酶的活性口袋適當擴大可提高酶解效率[25-29]。同時增加活性位點處氨基酸的疏水性,也可促進酶分子與疏水底物的結(jié)合[30-31]。

    基于上述理論,Silva等[25]采用定點突變的方法將來源于Thermobifida fusca的Tfu_0883進行分子改造,得到的突變體I218A和Q132A/T101A對PET纖維的降解活性均有提高。Araujo等[26]對來源于F. solani pisi的FsC的活性位點殘基進行突變,將該處的亮氨酸替換為空間位阻較小的丙氨酸,擴大了底物的結(jié)合口袋,得到的突變體L182A和L81A對PET纖維的水解活性分別提高了4倍和5倍。此外,Kawabata等[30]基于Cut190晶體結(jié)構(gòu)進行半理性設計,將該酶的活性口袋擴大,以形成額外的空間更好地容納底物,得到的突變體Q138A的降解性能明顯提高。

    1.1.2.2 增加二硫鍵以提高角質(zhì)酶熱穩(wěn)定性 二硫鍵的存在有利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,該特征已成功應用于改造提高酶的熱穩(wěn)定性[31-33]。Then等[31]研究發(fā)現(xiàn),當TfCut2的金屬離子結(jié)合位點結(jié)合Ca2+時,會抑制催化三聯(lián)體發(fā)揮作用,他們用二硫鍵替換該酶的金屬離子結(jié)合位點,不僅提高了該酶的熱穩(wěn)定性,也消除了水解過程中該酶對Ca2+的依賴。最近,Tournier等[34]基于LCC的晶體結(jié)構(gòu)進行理性設計,添加二硫鍵來提高LCC的熱穩(wěn)定性,得到的突變體D238C/S283C的Tm與野生型相比提高了9.8℃,活性僅下降28%。其同時對底物結(jié)合附近的熱點氨基酸進行定點突變,在突變體D238C/S283C的基礎上進行組合,最后得到組合突變體F243I/D238C/S283C/Y127G(ICCG),Tm與WT-LCC相 比 提 高 了9.3℃,活性基本完全恢復。在72℃條件下反應9.3 h后,對切碎的PET塑料瓶(PcW-PET)的水解率高達90%,是目前為止效率最高的PET水解酶,且得到的單體可用于再生PET,有助于實現(xiàn)PET廢棄物的循環(huán)利用。

    1.1.2.3 減少產(chǎn)物抑制 PET經(jīng)過酶解后,產(chǎn)生的中間產(chǎn)物(BHET和MHET)可競爭性的結(jié)合到酶的底物結(jié)合位點,從而抑制PET的進一步降解[35]。Wei等[36]對TfCut2的氨基酸殘基進行突變,得到的突變體G62A的降解效率提高了2.7倍,分析表明,在TfCut2中,59位的Gly的主鏈氮原子可與MHET的羰基氧相互作用,而60位的Gly突變?yōu)锳la后,由于Ala側(cè)鏈引起的位阻,G62A突變體無法通過G59與MHET相互作用,從而導致該酶對MHET的結(jié)合常數(shù)降低了5.5倍。

    采用雙酶體系也有利于PET的酶解,雙酶體系一般包括聚酯降解酶和清除中間產(chǎn)物的酶[35]。Barth等[37]采用固定化雙酶體系(TfCa-TfCut2和 TfCa-LCC)實現(xiàn)PET的高效降解,其中TfCa水解中間產(chǎn)物BHET和MHET,與單酶處理相比,雙酶的協(xié)同作用使水解產(chǎn)物總量分別增加91%和104%。

    1.1.2.4 增加角質(zhì)酶與底物有效接觸面積 聚酯降解酶與疏水結(jié)合域的融合有助于加快聚合物的水解作用[38],可能是以下兩種原因:(1)酶表面的疏水性增加,與疏水聚合物之間的吸附性增強,使得聚合物界面上的酶量增加[39];(2)有些結(jié)合模塊會破壞聚合物的結(jié)構(gòu),從而使得目標化學鍵更容易進入酶的活性位點區(qū)域[40]。Ribitsch等[41]將來源于Thermomyces cellullosylitica的Thc_Cut1與疏水性模塊CBM和PBM進行融合,得到的融合酶(Thc_Cut1+CBM)和(Thc_Cut1+PBM)對PET的吸附性增強,水解產(chǎn)物(MHET和TPA)的產(chǎn)量與Thc_Cut1相比明顯增加。Ribitsch等[42]還將Thc_Cut1與疏水蛋白HFB4和HFB7分別進行融合,得到的融合蛋白對PET的水解作用提高了約15倍。

    1.2 PETase

    與角質(zhì)酶、脂肪酶相比,來源于Ideonella sakaiensis的PETase可以在30-40℃更加特異性高效降解PET[23]。

    1.2.1 PETase的結(jié)構(gòu)和催化機制 目前PETase的晶體結(jié)構(gòu)已被中國、美國、韓國及德國等國家的研究團隊以不同的分辨率解析。PETase采用典型的α/β水解酶折疊方式,含有由9個β-鏈組成的中心:β-折疊,其被7個α-螺旋夾在中間[43]。PETase具有催化三聯(lián)體(S160-H237-D206)和氧陰離子穴(Y87、M161)[44-45]。PETase含有兩個二硫鍵,二硫鍵2(DS2)在所有同源酶中都是嚴格保守的,特異性二硫鍵1(DS1)位于活性位點附近(圖3-A)[44-45]。Fecker等[46]通過分子動力學模擬證明,PETase的活性位點在室溫下具有更高的柔韌性,這種柔韌性由其活性位點中獨特的二硫鍵(DS1)控制,將其除去會導致催化三聯(lián)體不穩(wěn)定并降低活性。因此,DS1在PETase中起關(guān)鍵作用。

    Joo等[43]使 用MHET四 聚 體(MHET4)和PETase進行分子對接計算,估算出其底物結(jié)合裂隙為40?的細長溝槽,分為兩個亞位點:亞位點I和II,分別結(jié)合1個和3個MHET部分。亞位點I中,MHET4的第一個MHET置于Y87和W185的兩個芳香族殘基之間,形成π-π相互作用。亞位點II由殘 基T88、A89、W159、I232、N233、S236、S238、N241、N244、S245、N246和R280組成,亞位點II根據(jù)第2、3和4個MHET的位置進一步分為IIa、IIb、和IIc。亞位點II和MHET4的后3個MHET主要是通過疏水相互作用介導的(圖3-B)。

    根據(jù)PETase的晶體結(jié)構(gòu),與不同配體的分子對接模型,定點突變實驗及已熟悉的α/β水解酶家族的水解機理,推測PETase的催化機制[43-44,47-49]如下:當PET通過疏水相互作用與PETase結(jié)合時,PETase表面上形成淺裂縫,殘基(His和Asp)形成激活親核試劑(Ser)的電荷中繼網(wǎng)絡。位于第一苯環(huán)的羰基被引導至底物結(jié)合裂縫的中心,催化三聯(lián)體進行親核攻擊,形成第一四面體中間體,氧陰離子空穴使酯鍵極化并使反應中間體穩(wěn)定。隨后,由水分子將該第一四面體中間體轉(zhuǎn)化為?;?酶中間體,并進行第二次親核攻擊以裂解酯鍵。在酯鍵斷裂后,剩余的苯甲酸基團形成較寬平面,由于W185構(gòu)象的可變性,其易于與W185側(cè)鏈面對面堆疊。因此,產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)并被拉開,最終從活動中心釋放(圖3-C)。

    近期,Wei等[50]通過Solid-state NMR實驗分析發(fā)現(xiàn),無定形PET高分子鏈中乙二醇(EG)單元的OC-CO扭轉(zhuǎn)角Ψ的trans/gauche比率明顯低于2-HE(MHET)4中的t/g比率;且通過(MAS)NMR方法研究了無定形PET中的局域和大規(guī)模協(xié)同主鏈運動,表明無定形PET在30℃從gauche構(gòu)象到trans構(gòu)象的轉(zhuǎn)變受到了很大的限制。因此,其認為Joo等[43]使用柔性低聚合底物的構(gòu)象擬合來解釋PETase對PET的降解機理可能不合理,促進底物結(jié)合的關(guān)鍵因素不是PET鏈構(gòu)象的相互轉(zhuǎn)換,而是苯亞基與周圍疏水殘基之間的弱相互作用。Joo等(Seo)[51]做出回復基本同意以上觀點。因此若能解析PETase和底物PET或較長寡聚物的共結(jié)晶,則更有意義。

    圖3 PETase的結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合位點和催化機制示意圖[43-44,47-49]

    PETase對PET的水解活性高于其他PET水解酶,可能是由于以下獨特的結(jié)構(gòu)特征:(1)PETase含有一對W159-S238殘基,可形成足夠的空間來容納底物;(2)PETase連接環(huán)中的3個額外的殘基S245、N246和Q247提供了足夠的空間來容納PET;(3)PETase在活性位點附近具有一個額外的二硫鍵,這對其熱穩(wěn)定性和活性至關(guān)重要[52];(4)PETase的W185存在多種構(gòu)象,容許PET大分子進入酶的活性中心[27,44]。

    1.2.2 PETase的分子改造進展

    1.2.2.1 基于理性設計改變底物結(jié)合口袋 影響PET降解效率的主要因素在于酶與底物的有效吸附[53]。Joo等[43]通過分子對接發(fā)現(xiàn),R280位于IIc的末端,似乎阻礙了底物的延伸,將其突變?yōu)楸彼幔蛔凅wR280A對PET的降解活性提高了約33%。Austin等[54]發(fā)現(xiàn)PETase比同源角質(zhì)酶具有更開放的活性位點裂隙,通過將兩個活性位點殘基W159和S238突變?yōu)榻琴|(zhì)酶中保守的氨基酸,使結(jié)合裂縫變窄,所得突變體S238F/W159H降解PET的性能得到提高。Ma等[55]對底物結(jié)合附近的熱點氨基酸進行定點突變,同時,使用無細胞蛋白表達系統(tǒng)進行高通量表達和篩選,成功篩選出3株突變體:R90A,L117F和I208F,酶活性與野生型相比分別提高了約1.6、2.1和2.5倍。Liu等[56]根據(jù)PETase的結(jié)構(gòu)進行定點突變,篩選出5株酶活性提高的突變體:Y87A、W159A、W159H、A209I和S214H,產(chǎn)物TPA的產(chǎn)量最高可達野生型的3倍。

    Liu等[57]發(fā)現(xiàn)PETase對于萘酯幾乎沒有降解作用,其基于PETase結(jié)構(gòu)信息對催化中心周圍的關(guān)鍵殘基進行了突變,以改變這些殘基的疏水性,減輕空間位阻效應,得到的突變體S93M、W159F和N241F都能水解萘酯。

    1.2.2.2 基于理性設計和固定化技術(shù)增強PETase熱穩(wěn)定性 一般來講,聚合物在接近或高于玻璃化溫度(Tg)的條件下,其非結(jié)晶區(qū)域會變得更加靈活,更容易接受酶的攻擊,從而加快降解速率[58-59]。酶促反應在水溶液中進行,PET的Tg值降低至60-65℃[60]。而PETase在30-40℃下降解PET,極大的限制了催化效率。

    Son等[61]為了提高PETase的熱穩(wěn)定性,開發(fā)了一種合理的蛋白質(zhì)工程策略。綜合考慮蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性與活性的關(guān)系,其集中在遠離活性位點的結(jié)構(gòu)區(qū)域進行研究,發(fā)現(xiàn)在PETase中,由于β6鏈的異常構(gòu)型,中心β片層被打斷,與總體b因子(16.1)相比,β6-β7連接環(huán)顯示出更高的b因子(22.2),隨后將PETase與熱穩(wěn)定性較高的TfCut2的相應區(qū)域進行比較發(fā)現(xiàn),由于氫鍵的存在,β6-β7連接環(huán)在TfCut2中形成了相當穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。因此,其擬通過在PETase中引入氫鍵增加β6-β7連接環(huán)的穩(wěn)定性。最后得到具有穩(wěn)定的β6-β7連接環(huán)(S121E/D186H)和底物結(jié)合亞位點IIc得到擴展(R280A)的三突變體:S121E/D186H/R280A,與野生型相比,該突變體的Tm值提高了8.81℃,PET的降解活性在40℃提高了約14倍[61]。

    Liu等[57]采用硫酸銨沉淀法和戊二醛交聯(lián)法固定化PETase,提高了PETase的熱穩(wěn)定性,最適溫度從25-35℃延長至25-45℃,酶活力在65℃時仍保持較高活性。

    1.2.2.3 增加PETase與底物有效接觸面積 若使用合適的分子介導酶與PET之間相互作用,可以增加酶與PET膜的接觸面積,酶的降解活性得到改善[42]。

    王澤方等[62-63]通過研究表明疏水蛋白的自組裝功能可以控制PETase在PET表面的有效吸附,同時利用大腸桿菌和畢赤酵母表面共展示HFBIPETase融合酶,可極大提高酶的催化效率。由于PETase表面帶正電荷(pI=9.4),F(xiàn)urukawa等[64]嘗試將PET膜與不同的陰離子烷基表面活性劑預孵育,將PET表面轉(zhuǎn)化為帶負電荷,然后再進行酶促水解,結(jié)果表明,PET膜經(jīng)表面活性劑預處理后,PETase降解活性在30℃提高了約120倍。

    1.2.2.4 PETase分泌表達 PET作為一種高分子聚合物,無法進入細胞,其降解需將PETase分泌至胞外。盡管Ideonella sakaiensis可以分泌PETase降解PET,但面對各種環(huán)境條件,其分泌量可能較低。因此,從常應用于工業(yè)的宿主中獲得PETase的分泌表達非常重要。

    Huang等[65]采用B.subtilis168表達系統(tǒng),測試3個Sec信號肽和2個Tat信號肽及其天然信號肽SPPETase用于介導PETase的分泌量,結(jié)果表明,通過PETase天然信號肽SPPETase介導得到最高分泌量的有活性的PETase。Seo等[66]通過將來自大腸桿菌的Sec依賴性信號肽融合到PETase中,建立了5個PETase分泌表達系統(tǒng),使用表達量最高的pET22b-SPLamB:IsPETase分泌系統(tǒng)成功表達出對PET膜有活性的細胞外酶PETase。Moog等[67]使用海洋光合單細胞真核生物Phaeodactylum tricornutum作為PETase的宿主,成功得到分泌型融合蛋白AP_SPPETaseR280A-FLAG,其在不同條件下對不同PET底物(商業(yè)瓶PET、PETG和PET粉碎物)顯示出不同的降解能力,有助于PET微塑料污染海水的生物修復。Chen等[68]將酵母菌P. pastorisGS115作為宿主來表達PETase,同時從宿主中選擇3種內(nèi)源性GPImodified細 胞 壁 蛋 白:GCW21、GCW51、GCW61作為錨定蛋白來展示PETase,最后得到有催化活性的融合蛋白:pPIC9-PETase-GCW21/51/61,實現(xiàn)PETase的酵母細胞表面展示降解高結(jié)晶度的PET,且與純酶相比,轉(zhuǎn)化率提高了約36倍。

    此外,定向進化技術(shù)也是蛋白質(zhì)分子改造的一個重要策略[69]。其利用易錯PCR等技術(shù)建立突變體文庫,然后采取合適的篩選體系在特定條件下篩選得到目標突變體[70]。本實驗室最近通過對PETase分泌表達系統(tǒng)的信號肽進行定向進化,篩選得到的信號肽突變體使得PETase的胞外分泌量提高了約3倍[71]。

    1.3 脂肪酶

    脂肪酶又稱甘油酯水解酶,屬于羧基酯水解酶類[72]。一些脂肪酶不能水解PET膜,但對PET纖維和寡聚物有活性[73-74](表2)。

    脂肪酶同樣采用α/β水解酶折疊方式,其還具有由α-螺旋的額外肽段構(gòu)成的“蓋子”結(jié)構(gòu)域,可蓋住活性口袋以保護催化三聯(lián)體[75](圖4為來源于T.lanuginosus的脂肪酶TLL的結(jié)構(gòu)[76])?!吧w子”的存在使得剛性聚合物較難進入底物結(jié)合位點,所以脂肪酶對PET的水解活性較低,其對PET纖維的主要作用是使其表面親水化,削弱纖維強度,但無法顯著降解PET的結(jié)構(gòu)模塊,因此也有研究者將脂肪酶歸類為PET表面修飾酶[77]。

    表2 脂肪酶類型及對PET的水解能力

    圖4 TLL的結(jié)構(gòu)(PDB:1DT3)[76]

    1.4 MHETase

    MHETase同樣是從Ideonella sakaiensis201-F6中分離得到的一種水解酶,它能與PETase協(xié)同作用,將PETase中間產(chǎn)物MHET降解為TPA和EG,對PET的完全降解也很重要[23]。通過多重序列比對,初步認定MHETase屬于鞣酸酶家族[78]。

    最 近,Palm等[78]首 次 解 析 出MHETase的晶 體 結(jié) 構(gòu),MHETase存 在α/β水 解 酶 結(jié) 構(gòu) 域(MHETaseHyd)和 蓋 子 結(jié) 構(gòu) 域(MHETaseLid),MHETaseLid為α螺旋折疊結(jié)構(gòu)(圖5-A)。

    他們解析了MHETase-MHETA((2-羥乙基)對苯二甲酰胺)的復合物結(jié)構(gòu)[78]。MHETA的整個苯環(huán)部分與MHETaseLid結(jié)構(gòu)域的殘基F415,L254和W397緊密結(jié)合,游離羧酸鹽的兩個氧與MHETaseLid的R411結(jié)合(圖5-B)。由此說明,盡管MHETase存在典型的催化三聯(lián)體和氧陰離子孔,但其底物特異性幾乎完全由MHETaseLid賦予。

    他們推斷MHETase的誘導機制如下:在無配體的結(jié)構(gòu)中,F(xiàn)415指向遠離活性位點的位置,底物結(jié)合位點屬于打開狀態(tài);當?shù)孜颩HETA進入底物結(jié)合位點后,會觸發(fā)F415側(cè)鏈繞 χ1旋轉(zhuǎn)近180°,從而封閉活性位點并鞏固相互作用。所以,不同于PETase,MHETase與底物的結(jié)合非常緊密,導致其特異性地水解MHET,而對BHET和PET并無水解活性,表現(xiàn)出高度的底物特異性[78]。

    此 外,Palm等[78]通 過 定 點 突 變 來 改 變MHETase的底物特異性,使其能夠降解BHET。因此通過MHET的結(jié)構(gòu)表征,將來有可能合理地設計出更有效更實用的MHETase突變體,使其不僅可以降解MHET,還可降解PET的其他中間產(chǎn)物。

    2 展望

    目前,研究者對PET水解酶已有一定的研究基礎,根據(jù)已有PET水解酶的晶體結(jié)構(gòu)及催化機理進行(半)理性設計有希望獲得降解性能大幅度提高的突變體。同時,應結(jié)合定向進化采用高效的篩選方法實現(xiàn)PET水解酶的高通量篩選,推動PET水解酶的高效開發(fā)。另外,在已有條件下可以將目前已發(fā)現(xiàn)的多種PET水解酶協(xié)同發(fā)揮作用,如在利用PETase降解PET過程中,可以加入MHETase以去除中間產(chǎn)物MHET,而反應條件如何控制,則需要我們后續(xù)的深入研究;也應該繼續(xù)篩選挖掘可將PET塑料作為唯一碳源的微生物,如篩選在海洋環(huán)境中可降解微塑料的菌株,并挖掘關(guān)鍵酶基因等。此外,要實現(xiàn)PET水解酶的工業(yè)化應用,還需考慮PET自身的物理性質(zhì),如結(jié)晶度、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)、熔點、可用表面積等。PET較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度要求水解酶具有較高的熱穩(wěn)定性從而可在高于PET的Tg條件下更加高效降解PET,而PET水解酶的熱穩(wěn)定性還有待大幅度提高。另外,為擴大酶的可接觸表面積,PET材料的機械預處理也是必要的。因此,若能將PET的材料性能研究與水解酶研究有機統(tǒng)一起來,做到物理學、化學、生物學的綜合應用,將有望實現(xiàn)PET的完全降解及循環(huán)利用。總之,酶法降解PET具有巨大的應用前景,需要大力開發(fā),以期在不久的將來作為綠色環(huán)保工具應用于塑料的降解。

    圖5 MHETase的結(jié)構(gòu)和底物結(jié)合位點[78]

    猜你喜歡
    水解酶角質(zhì)殘基
    無底物情況下來白Rhoclococcus zopfii的腈水解酶中親核進攻試劑CYS165的活性狀態(tài)的探究(英文)
    腈水解酶反應機制與催化性能調(diào)控研究進展
    基于各向異性網(wǎng)絡模型研究δ阿片受體的動力學與關(guān)鍵殘基*
    氨基甲酸乙酯水解酶的家族生物信息學分析
    生物信息學(2022年1期)2022-04-01 08:56:50
    “殘基片段和排列組合法”在書寫限制條件的同分異構(gòu)體中的應用
    石油化工應用(2018年3期)2018-03-24 14:54:36
    紫外線A輻射對人角質(zhì)形成細胞的損傷作用
    骨角質(zhì)文物保護研究進展
    蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)序列與殘基種類間關(guān)聯(lián)的分析
    基于支持向量機的蛋白質(zhì)相互作用界面熱點殘基預測
    精品国产一区二区久久| 亚洲avbb在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 69av精品久久久久久| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 90打野战视频偷拍视频| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲全国av大片| 97碰自拍视频| 午夜免费成人在线视频| 国产av在哪里看| 一区福利在线观看| 午夜福利,免费看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久久久久大精品| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品日韩av在线免费观看 | 校园春色视频在线观看| 女人被狂操c到高潮| 免费少妇av软件| 亚洲激情在线av| 91精品三级在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 久久人妻熟女aⅴ| 99国产综合亚洲精品| 亚洲九九香蕉| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美日韩一级在线毛片| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 精品第一国产精品| 久久久久精品国产欧美久久久| 级片在线观看| 正在播放国产对白刺激| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲情色 制服丝袜| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产一区在线观看成人免费| 人成视频在线观看免费观看| 午夜久久久久精精品| 欧美不卡视频在线免费观看 | 少妇 在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一区二区三区国产精品乱码| 欧美大码av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 天堂动漫精品| 日韩三级视频一区二区三区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 免费观看精品视频网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| 午夜两性在线视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产av一区二区精品久久| av网站免费在线观看视频| 日本一区二区免费在线视频| 人妻久久中文字幕网| 人妻久久中文字幕网| 日本在线视频免费播放| 欧美日本视频| 亚洲美女黄片视频| 亚洲黑人精品在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产av一区二区精品久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美久久黑人一区二区| 午夜福利高清视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99久久综合精品五月天人人| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产麻豆69| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日本黄色视频三级网站网址| 国产精品九九99| 欧美日韩福利视频一区二区| 咕卡用的链子| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 大香蕉久久成人网| 看免费av毛片| 91字幕亚洲| 久久香蕉国产精品| 精品一区二区三区四区五区乱码| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲熟妇熟女久久| 午夜免费激情av| 狂野欧美激情性xxxx| 久久热在线av| 真人做人爱边吃奶动态| 成人特级黄色片久久久久久久| 免费在线观看完整版高清| 免费看十八禁软件| 女人精品久久久久毛片| 九色国产91popny在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 一级黄色大片毛片| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产麻豆成人av免费视频| 色综合婷婷激情| 国产av在哪里看| 黄频高清免费视频| 黄片播放在线免费| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 久久香蕉精品热| 99国产精品免费福利视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 99国产精品99久久久久| 久久国产乱子伦精品免费另类| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲在线自拍视频| 午夜影院日韩av| 久久精品国产亚洲av高清一级| www.精华液| 午夜两性在线视频| 久久中文字幕人妻熟女| 91麻豆av在线| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 一二三四社区在线视频社区8| 一进一出抽搐动态| av免费在线观看网站| 亚洲av美国av| 可以在线观看的亚洲视频| netflix在线观看网站| 日本欧美视频一区| 真人一进一出gif抽搐免费| 真人做人爱边吃奶动态| av视频免费观看在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美中文日本在线观看视频| 久久久久久久久免费视频了| 禁无遮挡网站| 女警被强在线播放| 九色国产91popny在线| 又紧又爽又黄一区二区| 国产高清激情床上av| 亚洲av第一区精品v没综合| 女人精品久久久久毛片| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 免费无遮挡裸体视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久草成人影院| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产一区二区三区视频了| 欧美午夜高清在线| 久久久久久久午夜电影| 亚洲成av人片免费观看| 国产免费男女视频| 在线天堂中文资源库| 首页视频小说图片口味搜索| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 性欧美人与动物交配| 国产精品99久久99久久久不卡| 天堂动漫精品| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲午夜理论影院| 午夜福利高清视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久这里只有精品19| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲第一青青草原| 精品久久蜜臀av无| 老司机靠b影院| 99国产综合亚洲精品| 日本在线视频免费播放| 日本五十路高清| 国产精品 国内视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 老司机靠b影院| 性色av乱码一区二区三区2| 在线播放国产精品三级| 涩涩av久久男人的天堂| 极品教师在线免费播放| x7x7x7水蜜桃| 精品无人区乱码1区二区| 日本 欧美在线| 首页视频小说图片口味搜索| 一进一出抽搐动态| 丝袜美足系列| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品免费一区二区三区在线| 十八禁人妻一区二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 妹子高潮喷水视频| 啦啦啦 在线观看视频| 后天国语完整版免费观看| svipshipincom国产片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 丁香欧美五月| 99香蕉大伊视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 女性被躁到高潮视频| 日韩欧美三级三区| 成人三级做爰电影| 成人av一区二区三区在线看| 电影成人av| 可以在线观看毛片的网站| 美女大奶头视频| 后天国语完整版免费观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产成年人精品一区二区| 女人被狂操c到高潮| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 制服丝袜大香蕉在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久青草综合色| 成人国语在线视频| 一本综合久久免费| 在线观看一区二区三区| 又大又爽又粗| 一级毛片女人18水好多| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产精品精品国产色婷婷| 性少妇av在线| 91在线观看av| 国产又爽黄色视频| 一级片免费观看大全| 色尼玛亚洲综合影院| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品日韩av在线免费观看 | 手机成人av网站| 一级a爱片免费观看的视频| 91av网站免费观看| 免费不卡黄色视频| 精品久久久精品久久久| 免费看a级黄色片| 日韩高清综合在线| 欧美激情久久久久久爽电影 | 又黄又爽又免费观看的视频| 黄色视频,在线免费观看| 久久热在线av| 日本 av在线| 热99re8久久精品国产| 亚洲专区国产一区二区| 欧美在线一区亚洲| 搡老熟女国产l中国老女人| 免费在线观看完整版高清| 91麻豆av在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 在线观看日韩欧美| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 国产精品一区二区免费欧美| 国产免费av片在线观看野外av| 国产区一区二久久| 久久人人97超碰香蕉20202| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 亚洲欧美激情在线| 中亚洲国语对白在线视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 男女床上黄色一级片免费看| 精品久久久久久成人av| 国产成人系列免费观看| 女人精品久久久久毛片| 国产精品影院久久| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站| av网站免费在线观看视频| 国产熟女xx| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久人妻熟女aⅴ| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美丝袜亚洲另类 | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 午夜亚洲福利在线播放| 少妇的丰满在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 两性夫妻黄色片| 亚洲一区中文字幕在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 色综合婷婷激情| 一二三四社区在线视频社区8| 色尼玛亚洲综合影院| 国产成人系列免费观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产亚洲av嫩草精品影院| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 深夜精品福利| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品国产国语对白av| 久久久国产欧美日韩av| 69av精品久久久久久| 黄片播放在线免费| 精品乱码久久久久久99久播| 久久伊人香网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 大香蕉久久成人网| 激情在线观看视频在线高清| 午夜亚洲福利在线播放| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美大码av| 久久狼人影院| 可以在线观看的亚洲视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 少妇被粗大的猛进出69影院| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品高清国产在线一区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产精品野战在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看 | 久久中文字幕人妻熟女| 搡老熟女国产l中国老女人| 色综合站精品国产| 国产成人精品久久二区二区免费| 黄色视频不卡| 啦啦啦韩国在线观看视频| 午夜福利,免费看| 正在播放国产对白刺激| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美久久黑人一区二区| 国产精品二区激情视频| 人人澡人人妻人| 国产免费av片在线观看野外av| 校园春色视频在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 日韩欧美在线二视频| 国产精品久久久av美女十八| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲伊人色综图| 黄色片一级片一级黄色片| 妹子高潮喷水视频| 99在线视频只有这里精品首页| 国产99白浆流出| 禁无遮挡网站| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久9热在线精品视频| 激情视频va一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 制服诱惑二区| 一区二区三区高清视频在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 麻豆久久精品国产亚洲av| 在线观看免费日韩欧美大片| 999精品在线视频| 久久午夜亚洲精品久久| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产亚洲av高清不卡| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 操出白浆在线播放| 18禁观看日本| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 日韩精品青青久久久久久| 在线观看免费午夜福利视频| 成人国产一区最新在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲成国产人片在线观看| 国产三级在线视频| 少妇的丰满在线观看| 丁香欧美五月| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产欧美日韩一区二区三| 色尼玛亚洲综合影院| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产精品一区二区免费欧美| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产黄a三级三级三级人| 国产99久久九九免费精品| АⅤ资源中文在线天堂| 看片在线看免费视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产熟女xx| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久亚洲真实| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 91字幕亚洲| 久久这里只有精品19| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 婷婷丁香在线五月| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 在线永久观看黄色视频| 久久热在线av| 女性生殖器流出的白浆| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 最近最新中文字幕大全免费视频| 麻豆成人av在线观看| a在线观看视频网站| 妹子高潮喷水视频| 国产国语露脸激情在线看| 日韩精品青青久久久久久| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲国产精品999在线| 人妻久久中文字幕网| 久热这里只有精品99| 91大片在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久 | www日本在线高清视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 午夜成年电影在线免费观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美最黄视频在线播放免费| 99国产综合亚洲精品| www日本在线高清视频| a级毛片在线看网站| 亚洲电影在线观看av| 欧美色视频一区免费| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲免费av在线视频| 日本欧美视频一区| 国产精品一区二区在线不卡| 老汉色av国产亚洲站长工具| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久久久九九精品影院| 午夜福利高清视频| 亚洲成国产人片在线观看| 午夜a级毛片| 最近最新中文字幕大全电影3 | 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 这个男人来自地球电影免费观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 视频在线观看一区二区三区| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 日本 av在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 露出奶头的视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| av网站免费在线观看视频| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 少妇的丰满在线观看| 精品人妻在线不人妻| 国产精品一区二区免费欧美| or卡值多少钱| 少妇熟女aⅴ在线视频| 又大又爽又粗| 亚洲欧美日韩另类电影网站| a级毛片在线看网站| 在线观看免费视频日本深夜| 可以在线观看的亚洲视频| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲人成电影观看| 免费在线观看影片大全网站| av片东京热男人的天堂| 亚洲片人在线观看| 91老司机精品| 丝袜美腿诱惑在线| 精品不卡国产一区二区三区| 国产国语露脸激情在线看| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 久久久久久久久中文| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲熟女毛片儿| 国产国语露脸激情在线看| 美女免费视频网站| xxx96com| 久久中文字幕人妻熟女| 一级黄色大片毛片| 无人区码免费观看不卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 天堂影院成人在线观看| 91成年电影在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 大香蕉久久成人网| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 不卡av一区二区三区| 在线观看午夜福利视频| 此物有八面人人有两片| 国产亚洲欧美精品永久| 天堂√8在线中文| 亚洲专区字幕在线| 99riav亚洲国产免费| 亚洲全国av大片| 人妻久久中文字幕网| 欧美黑人欧美精品刺激| 91九色精品人成在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| ponron亚洲| 欧美成人免费av一区二区三区| 岛国视频午夜一区免费看| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品久久视频播放| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜福利,免费看| 欧美乱码精品一区二区三区| 99riav亚洲国产免费| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 一本大道久久a久久精品| 在线观看午夜福利视频| av天堂在线播放| 色尼玛亚洲综合影院| 成人免费观看视频高清| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩有码中文字幕| 日韩精品免费视频一区二区三区| 中文字幕av电影在线播放| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产成人欧美| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 变态另类丝袜制服| 欧美不卡视频在线免费观看 | 又大又爽又粗| av中文乱码字幕在线| 高清在线国产一区| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲欧美激情综合另类| 国产私拍福利视频在线观看| 精品久久久精品久久久| 禁无遮挡网站| 国产成人系列免费观看| 日韩大尺度精品在线看网址 | 不卡一级毛片| 大码成人一级视频| 国产成年人精品一区二区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲自拍偷在线| 精品一区二区三区av网在线观看| 免费观看人在逋| 亚洲精品在线美女| 婷婷丁香在线五月| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 黄色女人牲交| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 99国产精品一区二区三区| 好男人在线观看高清免费视频 | 免费人成视频x8x8入口观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 黄色丝袜av网址大全| 成在线人永久免费视频| 久久精品91蜜桃| 大码成人一级视频| 国产一区二区激情短视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品乱码久久久久久99久播| 日韩国内少妇激情av| 国产熟女午夜一区二区三区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久青草综合色| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲伊人色综图| 9色porny在线观看| 亚洲av熟女| 97碰自拍视频| 久久人妻av系列| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 身体一侧抽搐| 人妻久久中文字幕网| videosex国产| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产单亲对白刺激| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲专区国产一区二区| 欧美黄色淫秽网站| 国产一区二区三区综合在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 久久狼人影院| 亚洲午夜理论影院| 香蕉国产在线看| 在线观看免费视频网站a站| 看黄色毛片网站| 国产精华一区二区三区| 免费少妇av软件| 男男h啪啪无遮挡| 禁无遮挡网站| av欧美777| 精品久久久精品久久久| 午夜精品久久久久久毛片777| avwww免费| 精品国产国语对白av| tocl精华| 在线观看免费视频网站a站| 欧美日本视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 色哟哟哟哟哟哟| 在线av久久热| 宅男免费午夜| 久久午夜亚洲精品久久| 久久精品91蜜桃| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产不卡一卡二|