PET水解酶的研究進展

石利霞 高松楓 朱蕾蕾

（中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

聚對苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）是以石油為原料的一種常見塑料，由對苯二甲酸（Terephthalic acid，TPA）和乙二醇（Ethylene glycol，EG）通過酯鍵聚合而成［1］。PET廣泛應用于包裝、建筑、電氣等行業(yè)，如飲料瓶、薄膜和工程塑料［2］。PET在被廣泛應用的同時，由于其廢棄物難以自然降解而造成了嚴重的環(huán)境污染。目前，PET廢棄物的處理方法主要有垃圾填埋法、熱處理法、化學回收法，這3種處理方式產(chǎn)生的廢氣廢水均會對環(huán)境造成二次污染且?guī)砭薮蟮哪茉聪模?］。近年來，生物回收塑料廢棄物因其作用條件比較溫和環(huán)保、安全性較高而備受關(guān)注，將有望發(fā)展成為塑料降解的方法之一。

目前已從微生物中分離出多種PET水解酶，包 括 角 質(zhì) 酶［4-12］、脂 肪 酶［13-22］、PETase［23］等。PET水解酶可在較為溫和的條件下將PET水解為對苯二甲酸單羥乙酯（Mono（2-hydroxyethyl）terephthalic acid，MHET）、對苯二甲酸雙羥乙酯（Bis（2-hydroxyethyl）terephthalic acid，BHET）、乙二醇（Ethylene glycol，EG）和對苯二甲酸（Terephthalic acid，TPA）等組分（圖1），而得到的單體可進一步循環(huán)利用，更加綠色環(huán)保。因此，使用酶法降解PET具有不可替代的優(yōu)勢。其中，脂肪酶對PET的水解活性最低，這可能是由于其催化中心被“蓋子”結(jié)構(gòu)覆蓋，從而阻礙了酶與底物的有效催化，一般需要在反應體系中添加表面活性劑（如洗滌劑或增塑劑）進行界面活化以增強活性［15］。角質(zhì)酶是目前研究最廣泛的PET水解酶，已解析獲得若干來源于細菌和真菌的角質(zhì)酶的晶體結(jié)構(gòu)（表1），其含有較寬的底物結(jié)合口袋且沒有“蓋子”結(jié)構(gòu)，容許剛性長鏈聚合底物PET進入酶的活性中心，所以對PET的水解活性較高。角質(zhì)酶一般在高溫（50-70℃）條件下才能發(fā)揮降解作用（表1）。目前已發(fā)現(xiàn)幾種角質(zhì)酶可以顯著降解結(jié)晶度較低的PET，如LCC［5］、HiC［6］等。將角質(zhì)酶、脂肪酶用于PET水解是老酶新用，而PETase是2016年Yoshida等［23］從一種能“吃”PET塑料的細菌Ideonella sakaiensis中分離出的一種新型PET水解酶。它能夠在30℃條件下高效特異性水解PET，但其熱穩(wěn)定性較差，與角質(zhì)酶在高溫條件下才能發(fā)揮降解作用形成了鮮明的對比。其次，Yoshida等還發(fā)現(xiàn)Ideonella sakaiensis中存在一種類似阿魏酸酯酶的MHET水解酶MHETase，可將PET主要中間產(chǎn)物MHET特異性水解生成TPA和EG（圖1），對PET的完全降解也很重要。

PET水解酶在PET生物降解中顯示出巨大的潛力，但PET水解酶在催化效率、熱穩(wěn)定性等方面仍存在諸多不足，目前無法很好地滿足工業(yè)應用需求。隨著蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)、催化機制等研究的深入，利用（半）理性設計對PET水解酶進行分子改造的研究備受關(guān)注。本文綜述了不同PET水解酶的結(jié)構(gòu)、降解機理，重點介紹了角質(zhì)酶和PETase的分子改造進展，旨在為改造PET水解酶以實現(xiàn)其工業(yè)化應用提供一定的參考依據(jù)。

1 PET水解酶

1.1 角質(zhì)酶

角質(zhì)酶是存在于大多數(shù)植物病原菌和腐生植物中的胞外絲氨酸酯酶，可以水解水溶性酯、乳化的三酰甘油及合成聚酯，如聚ε-己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）和聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）等［24］。表1列出了目前報道的可水解PET的角質(zhì)酶類型及降解能力。

1.1.1 角質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)和催化機制 角質(zhì)酶屬于絲氨酸水解酶家族，具有α/β-水解酶結(jié)構(gòu)。角質(zhì)酶的活性位點處有氧陰離子穴，用于識別、結(jié)合底物；其催化三聯(lián)體（Ser-His-Asp）一般位于由疏水氨基酸包圍的表面溝槽中，有利于容納底物PET［9］。

來源于Thermobifida fuscaKW3的TfCut2的 晶體結(jié)構(gòu)表明（圖2），殘基Y60和M131可以形成氧陰離子空穴，它們的主鏈氮原子與底物PET的羰基氧原子相互作用，從而使可裂解酯鍵靠近催化三聯(lián)體中的活性絲氨酸。此外，I178、W155和F209與PET鏈的苯環(huán)之間具有疏水相互作用，這些殘基與PET的相互作用均有利于酶對底物的識別［12］。

圖1 PET水解酶降解PET過程

表1 可水解PET的角質(zhì)酶類型及降解能力

圖2 TfCut2的結(jié)構(gòu)（PDB：4CG1）［12］

1.1.2 角質(zhì)酶的分子改造進展

1.1.2.1 擴大酶活性位點空間及增加疏水性以提高角質(zhì)酶活力 酶與底物的識別及結(jié)合是酶解過程中的重要環(huán)節(jié)，這要求酶的活性位點處有足夠的空間容納聚酯底物，因而對酶的活性口袋適當擴大可提高酶解效率［25-29］。同時增加活性位點處氨基酸的疏水性，也可促進酶分子與疏水底物的結(jié)合［30-31］。

基于上述理論，Silva等［25］采用定點突變的方法將來源于Thermobifida fusca的Tfu_0883進行分子改造，得到的突變體I218A和Q132A/T101A對PET纖維的降解活性均有提高。Araujo等［26］對來源于F. solani pisi的FsC的活性位點殘基進行突變，將該處的亮氨酸替換為空間位阻較小的丙氨酸，擴大了底物的結(jié)合口袋，得到的突變體L182A和L81A對PET纖維的水解活性分別提高了4倍和5倍。此外，Kawabata等［30］基于Cut190晶體結(jié)構(gòu)進行半理性設計，將該酶的活性口袋擴大，以形成額外的空間更好地容納底物，得到的突變體Q138A的降解性能明顯提高。

1.1.2.2 增加二硫鍵以提高角質(zhì)酶熱穩(wěn)定性 二硫鍵的存在有利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，該特征已成功應用于改造提高酶的熱穩(wěn)定性［31-33］。Then等［31］研究發(fā)現(xiàn)，當TfCut2的金屬離子結(jié)合位點結(jié)合Ca2+時，會抑制催化三聯(lián)體發(fā)揮作用，他們用二硫鍵替換該酶的金屬離子結(jié)合位點，不僅提高了該酶的熱穩(wěn)定性，也消除了水解過程中該酶對Ca2+的依賴。最近，Tournier等［34］基于LCC的晶體結(jié)構(gòu)進行理性設計，添加二硫鍵來提高LCC的熱穩(wěn)定性，得到的突變體D238C/S283C的Tm與野生型相比提高了9.8℃，活性僅下降28%。其同時對底物結(jié)合附近的熱點氨基酸進行定點突變，在突變體D238C/S283C的基礎上進行組合，最后得到組合突變體F243I/D238C/S283C/Y127G（ICCG），Tm與WT-LCC相 比 提 高 了9.3℃，活性基本完全恢復。在72℃條件下反應9.3 h后，對切碎的PET塑料瓶（PcW-PET）的水解率高達90%，是目前為止效率最高的PET水解酶，且得到的單體可用于再生PET，有助于實現(xiàn)PET廢棄物的循環(huán)利用。

1.1.2.3 減少產(chǎn)物抑制 PET經(jīng)過酶解后，產(chǎn)生的中間產(chǎn)物（BHET和MHET）可競爭性的結(jié)合到酶的底物結(jié)合位點，從而抑制PET的進一步降解［35］。Wei等［36］對TfCut2的氨基酸殘基進行突變，得到的突變體G62A的降解效率提高了2.7倍，分析表明，在TfCut2中，59位的Gly的主鏈氮原子可與MHET的羰基氧相互作用，而60位的Gly突變?yōu)锳la后，由于Ala側(cè)鏈引起的位阻，G62A突變體無法通過G59與MHET相互作用，從而導致該酶對MHET的結(jié)合常數(shù)降低了5.5倍。

采用雙酶體系也有利于PET的酶解，雙酶體系一般包括聚酯降解酶和清除中間產(chǎn)物的酶［35］。Barth等［37］采用固定化雙酶體系（TfCa-TfCut2和 TfCa-LCC）實現(xiàn)PET的高效降解，其中TfCa水解中間產(chǎn)物BHET和MHET，與單酶處理相比，雙酶的協(xié)同作用使水解產(chǎn)物總量分別增加91%和104%。

1.1.2.4 增加角質(zhì)酶與底物有效接觸面積 聚酯降解酶與疏水結(jié)合域的融合有助于加快聚合物的水解作用［38］，可能是以下兩種原因：（1）酶表面的疏水性增加，與疏水聚合物之間的吸附性增強，使得聚合物界面上的酶量增加［39］；（2）有些結(jié)合模塊會破壞聚合物的結(jié)構(gòu)，從而使得目標化學鍵更容易進入酶的活性位點區(qū)域［40］。Ribitsch等［41］將來源于Thermomyces cellullosylitica的Thc_Cut1與疏水性模塊CBM和PBM進行融合，得到的融合酶（Thc_Cut1+CBM）和（Thc_Cut1+PBM）對PET的吸附性增強，水解產(chǎn)物（MHET和TPA）的產(chǎn)量與Thc_Cut1相比明顯增加。Ribitsch等［42］還將Thc_Cut1與疏水蛋白HFB4和HFB7分別進行融合，得到的融合蛋白對PET的水解作用提高了約15倍。

1.2 PETase

與角質(zhì)酶、脂肪酶相比，來源于Ideonella sakaiensis的PETase可以在30-40℃更加特異性高效降解PET［23］。

1.2.1 PETase的結(jié)構(gòu)和催化機制 目前PETase的晶體結(jié)構(gòu)已被中國、美國、韓國及德國等國家的研究團隊以不同的分辨率解析。PETase采用典型的α/β水解酶折疊方式，含有由9個β-鏈組成的中心：β-折疊，其被7個α-螺旋夾在中間［43］。PETase具有催化三聯(lián)體（S160-H237-D206）和氧陰離子穴（Y87、M161）［44-45］。PETase含有兩個二硫鍵，二硫鍵2（DS2）在所有同源酶中都是嚴格保守的，特異性二硫鍵1（DS1）位于活性位點附近（圖3-A）［44-45］。Fecker等［46］通過分子動力學模擬證明，PETase的活性位點在室溫下具有更高的柔韌性，這種柔韌性由其活性位點中獨特的二硫鍵（DS1）控制，將其除去會導致催化三聯(lián)體不穩(wěn)定并降低活性。因此，DS1在PETase中起關(guān)鍵作用。

Joo等［43］使 用MHET四 聚 體（MHET4）和PETase進行分子對接計算，估算出其底物結(jié)合裂隙為40?的細長溝槽，分為兩個亞位點：亞位點I和II，分別結(jié)合1個和3個MHET部分。亞位點I中，MHET4的第一個MHET置于Y87和W185的兩個芳香族殘基之間，形成π-π相互作用。亞位點II由殘 基T88、A89、W159、I232、N233、S236、S238、N241、N244、S245、N246和R280組成，亞位點II根據(jù)第2、3和4個MHET的位置進一步分為IIa、IIb、和IIc。亞位點II和MHET4的后3個MHET主要是通過疏水相互作用介導的（圖3-B）。

根據(jù)PETase的晶體結(jié)構(gòu)，與不同配體的分子對接模型，定點突變實驗及已熟悉的α/β水解酶家族的水解機理，推測PETase的催化機制［43-44，47-49］如下：當PET通過疏水相互作用與PETase結(jié)合時，PETase表面上形成淺裂縫，殘基（His和Asp）形成激活親核試劑（Ser）的電荷中繼網(wǎng)絡。位于第一苯環(huán)的羰基被引導至底物結(jié)合裂縫的中心，催化三聯(lián)體進行親核攻擊，形成第一四面體中間體，氧陰離子空穴使酯鍵極化并使反應中間體穩(wěn)定。隨后，由水分子將該第一四面體中間體轉(zhuǎn)化為?；?酶中間體，并進行第二次親核攻擊以裂解酯鍵。在酯鍵斷裂后，剩余的苯甲酸基團形成較寬平面，由于W185構(gòu)象的可變性，其易于與W185側(cè)鏈面對面堆疊。因此，產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)并被拉開，最終從活動中心釋放（圖3-C）。

近期，Wei等［50］通過Solid-state NMR實驗分析發(fā)現(xiàn)，無定形PET高分子鏈中乙二醇（EG）單元的OC-CO扭轉(zhuǎn)角Ψ的trans/gauche比率明顯低于2-HE（MHET）4中的t/g比率；且通過（MAS）NMR方法研究了無定形PET中的局域和大規(guī)模協(xié)同主鏈運動，表明無定形PET在30℃從gauche構(gòu)象到trans構(gòu)象的轉(zhuǎn)變受到了很大的限制。因此，其認為Joo等［43］使用柔性低聚合底物的構(gòu)象擬合來解釋PETase對PET的降解機理可能不合理，促進底物結(jié)合的關(guān)鍵因素不是PET鏈構(gòu)象的相互轉(zhuǎn)換，而是苯亞基與周圍疏水殘基之間的弱相互作用。Joo等（Seo）［51］做出回復基本同意以上觀點。因此若能解析PETase和底物PET或較長寡聚物的共結(jié)晶，則更有意義。

圖3 PETase的結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合位點和催化機制示意圖［43-44，47-49］

PETase對PET的水解活性高于其他PET水解酶，可能是由于以下獨特的結(jié)構(gòu)特征：（1）PETase含有一對W159-S238殘基，可形成足夠的空間來容納底物；（2）PETase連接環(huán)中的3個額外的殘基S245、N246和Q247提供了足夠的空間來容納PET；（3）PETase在活性位點附近具有一個額外的二硫鍵，這對其熱穩(wěn)定性和活性至關(guān)重要［52］；（4）PETase的W185存在多種構(gòu)象，容許PET大分子進入酶的活性中心［27，44］。

1.2.2 PETase的分子改造進展

1.2.2.1 基于理性設計改變底物結(jié)合口袋 影響PET降解效率的主要因素在于酶與底物的有效吸附［53］。Joo等［43］通過分子對接發(fā)現(xiàn)，R280位于IIc的末端，似乎阻礙了底物的延伸，將其突變?yōu)楸彼幔蛔凅wR280A對PET的降解活性提高了約33%。Austin等［54］發(fā)現(xiàn)PETase比同源角質(zhì)酶具有更開放的活性位點裂隙，通過將兩個活性位點殘基W159和S238突變?yōu)榻琴|(zhì)酶中保守的氨基酸，使結(jié)合裂縫變窄，所得突變體S238F/W159H降解PET的性能得到提高。Ma等［55］對底物結(jié)合附近的熱點氨基酸進行定點突變，同時，使用無細胞蛋白表達系統(tǒng)進行高通量表達和篩選，成功篩選出3株突變體：R90A，L117F和I208F，酶活性與野生型相比分別提高了約1.6、2.1和2.5倍。Liu等［56］根據(jù)PETase的結(jié)構(gòu)進行定點突變，篩選出5株酶活性提高的突變體：Y87A、W159A、W159H、A209I和S214H，產(chǎn)物TPA的產(chǎn)量最高可達野生型的3倍。

Liu等［57］發(fā)現(xiàn)PETase對于萘酯幾乎沒有降解作用，其基于PETase結(jié)構(gòu)信息對催化中心周圍的關(guān)鍵殘基進行了突變，以改變這些殘基的疏水性，減輕空間位阻效應，得到的突變體S93M、W159F和N241F都能水解萘酯。

1.2.2.2 基于理性設計和固定化技術(shù)增強PETase熱穩(wěn)定性 一般來講，聚合物在接近或高于玻璃化溫度（Tg）的條件下，其非結(jié)晶區(qū)域會變得更加靈活，更容易接受酶的攻擊，從而加快降解速率［58-59］。酶促反應在水溶液中進行，PET的Tg值降低至60-65℃［60］。而PETase在30-40℃下降解PET，極大的限制了催化效率。

Son等［61］為了提高PETase的熱穩(wěn)定性，開發(fā)了一種合理的蛋白質(zhì)工程策略。綜合考慮蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性與活性的關(guān)系，其集中在遠離活性位點的結(jié)構(gòu)區(qū)域進行研究，發(fā)現(xiàn)在PETase中，由于β6鏈的異常構(gòu)型，中心β片層被打斷，與總體b因子（16.1）相比，β6-β7連接環(huán)顯示出更高的b因子（22.2），隨后將PETase與熱穩(wěn)定性較高的TfCut2的相應區(qū)域進行比較發(fā)現(xiàn)，由于氫鍵的存在，β6-β7連接環(huán)在TfCut2中形成了相當穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。因此，其擬通過在PETase中引入氫鍵增加β6-β7連接環(huán)的穩(wěn)定性。最后得到具有穩(wěn)定的β6-β7連接環(huán)（S121E/D186H）和底物結(jié)合亞位點IIc得到擴展（R280A）的三突變體：S121E/D186H/R280A，與野生型相比，該突變體的Tm值提高了8.81℃，PET的降解活性在40℃提高了約14倍［61］。

Liu等［57］采用硫酸銨沉淀法和戊二醛交聯(lián)法固定化PETase，提高了PETase的熱穩(wěn)定性，最適溫度從25-35℃延長至25-45℃，酶活力在65℃時仍保持較高活性。

1.2.2.3 增加PETase與底物有效接觸面積 若使用合適的分子介導酶與PET之間相互作用，可以增加酶與PET膜的接觸面積，酶的降解活性得到改善［42］。

王澤方等［62-63］通過研究表明疏水蛋白的自組裝功能可以控制PETase在PET表面的有效吸附，同時利用大腸桿菌和畢赤酵母表面共展示HFBIPETase融合酶，可極大提高酶的催化效率。由于PETase表面帶正電荷（pI=9.4），F(xiàn)urukawa等［64］嘗試將PET膜與不同的陰離子烷基表面活性劑預孵育，將PET表面轉(zhuǎn)化為帶負電荷，然后再進行酶促水解，結(jié)果表明，PET膜經(jīng)表面活性劑預處理后，PETase降解活性在30℃提高了約120倍。

1.2.2.4 PETase分泌表達 PET作為一種高分子聚合物，無法進入細胞，其降解需將PETase分泌至胞外。盡管Ideonella sakaiensis可以分泌PETase降解PET，但面對各種環(huán)境條件，其分泌量可能較低。因此，從常應用于工業(yè)的宿主中獲得PETase的分泌表達非常重要。

Huang等［65］采用B.subtilis168表達系統(tǒng)，測試3個Sec信號肽和2個Tat信號肽及其天然信號肽SPPETase用于介導PETase的分泌量，結(jié)果表明，通過PETase天然信號肽SPPETase介導得到最高分泌量的有活性的PETase。Seo等［66］通過將來自大腸桿菌的Sec依賴性信號肽融合到PETase中，建立了5個PETase分泌表達系統(tǒng)，使用表達量最高的pET22b-SPLamB：IsPETase分泌系統(tǒng)成功表達出對PET膜有活性的細胞外酶PETase。Moog等［67］使用海洋光合單細胞真核生物Phaeodactylum tricornutum作為PETase的宿主，成功得到分泌型融合蛋白AP_SPPETaseR280A-FLAG，其在不同條件下對不同PET底物（商業(yè)瓶PET、PETG和PET粉碎物）顯示出不同的降解能力，有助于PET微塑料污染海水的生物修復。Chen等［68］將酵母菌P. pastorisGS115作為宿主來表達PETase，同時從宿主中選擇3種內(nèi)源性GPImodified細 胞 壁 蛋 白：GCW21、GCW51、GCW61作為錨定蛋白來展示PETase，最后得到有催化活性的融合蛋白：pPIC9-PETase-GCW21/51/61，實現(xiàn)PETase的酵母細胞表面展示降解高結(jié)晶度的PET，且與純酶相比，轉(zhuǎn)化率提高了約36倍。

此外，定向進化技術(shù)也是蛋白質(zhì)分子改造的一個重要策略［69］。其利用易錯PCR等技術(shù)建立突變體文庫，然后采取合適的篩選體系在特定條件下篩選得到目標突變體［70］。本實驗室最近通過對PETase分泌表達系統(tǒng)的信號肽進行定向進化，篩選得到的信號肽突變體使得PETase的胞外分泌量提高了約3倍［71］。

1.3 脂肪酶

脂肪酶又稱甘油酯水解酶，屬于羧基酯水解酶類［72］。一些脂肪酶不能水解PET膜，但對PET纖維和寡聚物有活性［73-74］（表2）。

脂肪酶同樣采用α/β水解酶折疊方式，其還具有由α-螺旋的額外肽段構(gòu)成的“蓋子”結(jié)構(gòu)域，可蓋住活性口袋以保護催化三聯(lián)體［75］（圖4為來源于T.lanuginosus的脂肪酶TLL的結(jié)構(gòu)［76］）?！吧w子”的存在使得剛性聚合物較難進入底物結(jié)合位點，所以脂肪酶對PET的水解活性較低，其對PET纖維的主要作用是使其表面親水化，削弱纖維強度，但無法顯著降解PET的結(jié)構(gòu)模塊，因此也有研究者將脂肪酶歸類為PET表面修飾酶［77］。

表2 脂肪酶類型及對PET的水解能力

圖4 TLL的結(jié)構(gòu)（PDB：1DT3）［76］

1.4 MHETase

MHETase同樣是從Ideonella sakaiensis201-F6中分離得到的一種水解酶，它能與PETase協(xié)同作用，將PETase中間產(chǎn)物MHET降解為TPA和EG，對PET的完全降解也很重要［23］。通過多重序列比對，初步認定MHETase屬于鞣酸酶家族［78］。

最 近，Palm等［78］首 次 解 析 出MHETase的晶 體 結(jié) 構(gòu)，MHETase存 在α/β水 解 酶 結(jié) 構(gòu) 域（MHETaseHyd）和 蓋 子 結(jié) 構(gòu) 域（MHETaseLid），MHETaseLid為α螺旋折疊結(jié)構(gòu)（圖5-A）。

他們解析了MHETase-MHETA（（2-羥乙基）對苯二甲酰胺）的復合物結(jié)構(gòu)［78］。MHETA的整個苯環(huán)部分與MHETaseLid結(jié)構(gòu)域的殘基F415，L254和W397緊密結(jié)合，游離羧酸鹽的兩個氧與MHETaseLid的R411結(jié)合（圖5-B）。由此說明，盡管MHETase存在典型的催化三聯(lián)體和氧陰離子孔，但其底物特異性幾乎完全由MHETaseLid賦予。

他們推斷MHETase的誘導機制如下：在無配體的結(jié)構(gòu)中，F(xiàn)415指向遠離活性位點的位置，底物結(jié)合位點屬于打開狀態(tài)；當?shù)孜颩HETA進入底物結(jié)合位點后，會觸發(fā)F415側(cè)鏈繞 χ1旋轉(zhuǎn)近180°，從而封閉活性位點并鞏固相互作用。所以，不同于PETase，MHETase與底物的結(jié)合非常緊密，導致其特異性地水解MHET，而對BHET和PET并無水解活性，表現(xiàn)出高度的底物特異性［78］。

此 外，Palm等［78］通 過 定 點 突 變 來 改 變MHETase的底物特異性，使其能夠降解BHET。因此通過MHET的結(jié)構(gòu)表征，將來有可能合理地設計出更有效更實用的MHETase突變體，使其不僅可以降解MHET，還可降解PET的其他中間產(chǎn)物。

2 展望

目前，研究者對PET水解酶已有一定的研究基礎，根據(jù)已有PET水解酶的晶體結(jié)構(gòu)及催化機理進行（半）理性設計有希望獲得降解性能大幅度提高的突變體。同時，應結(jié)合定向進化采用高效的篩選方法實現(xiàn)PET水解酶的高通量篩選，推動PET水解酶的高效開發(fā)。另外，在已有條件下可以將目前已發(fā)現(xiàn)的多種PET水解酶協(xié)同發(fā)揮作用，如在利用PETase降解PET過程中，可以加入MHETase以去除中間產(chǎn)物MHET，而反應條件如何控制，則需要我們后續(xù)的深入研究；也應該繼續(xù)篩選挖掘可將PET塑料作為唯一碳源的微生物，如篩選在海洋環(huán)境中可降解微塑料的菌株，并挖掘關(guān)鍵酶基因等。此外，要實現(xiàn)PET水解酶的工業(yè)化應用，還需考慮PET自身的物理性質(zhì)，如結(jié)晶度、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）、熔點、可用表面積等。PET較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度要求水解酶具有較高的熱穩(wěn)定性從而可在高于PET的Tg條件下更加高效降解PET，而PET水解酶的熱穩(wěn)定性還有待大幅度提高。另外，為擴大酶的可接觸表面積，PET材料的機械預處理也是必要的。因此，若能將PET的材料性能研究與水解酶研究有機統(tǒng)一起來，做到物理學、化學、生物學的綜合應用，將有望實現(xiàn)PET的完全降解及循環(huán)利用。總之，酶法降解PET具有巨大的應用前景，需要大力開發(fā)，以期在不久的將來作為綠色環(huán)保工具應用于塑料的降解。

圖5 MHETase的結(jié)構(gòu)和底物結(jié)合位點［78］