• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇制備工藝的研究

    2020-11-02 08:51:44段佳琪李琲琲任杰邱德文李廣悅
    生物技術(shù)通報(bào) 2020年10期
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)毒禾谷鐮刀

    段佳琪 李琲琲 任杰 邱德文 李廣悅

    (1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究所 吉林省資源昆蟲產(chǎn)業(yè)化工程中心,長春 130118;2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

    脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是鐮刀菌侵染大麥、小麥、玉米等谷物后產(chǎn)生的一種真菌毒素,最早在1970年由諸罔信一等人從感染赤霉病的大麥中分離獲得[1]。DON屬于單端孢霉烯族毒素,分子式為C15H20O6(圖1)[2],能夠抑制蛋白質(zhì)合成[3],具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性,是毒性較大的真菌毒素之一,并且能與其他毒素產(chǎn)生毒性增效作用[4-5]。最新的研究表明,長期暴露在低劑量DON下,人和動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生慢性不良反應(yīng),甚至導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[6-9];而人畜一旦攝入過量的DON污染的食物后,會(huì)出現(xiàn)急性中毒癥狀,嚴(yán)重時(shí)甚至造成死亡[10-11]。

    圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的分子結(jié)構(gòu)

    鑒于DON在糧食、飼料和食品中污染的普遍性及其對人畜健康危害的嚴(yán)重性,系統(tǒng)研究DON的致毒機(jī)理、檢測方法和脫毒方法尤為迫切和重要。獲得大量的高純度的標(biāo)準(zhǔn)品是進(jìn)行DON相關(guān)研究的基礎(chǔ)和保障,然而由于DON結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)的特殊性,其高效的化學(xué)合成仍然面臨挑戰(zhàn)[12],因此目前市售的DON標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴,阻礙了DON相關(guān)研究的開展。禾谷鐮刀菌發(fā)酵結(jié)合后續(xù)的分離純化是目前獲取大量高純度DON的最有效的方法,國內(nèi)外的研究人員對此工藝進(jìn)行了大量的研究和改進(jìn)。在培養(yǎng)基的選擇上,多使用大米作為產(chǎn)毒培養(yǎng)基,也有利用小麥和玉米作為產(chǎn)毒培養(yǎng)基的報(bào)道[13-15];在DON的分離純化方面,多采用柱層析技術(shù),配合HPLC和高速逆流色譜技術(shù),輔以重結(jié)晶的手段,達(dá)到分離純化DON的目的[14-19]。柱層析技術(shù)操作繁瑣,耗時(shí)耗力,對操作人員的要求較高,同時(shí)需要大量的有機(jī)試劑,成本較高。高速逆流色譜價(jià)格昂貴,一般常規(guī)實(shí)驗(yàn)室無法配備。因此,為了有效推進(jìn)DON的相關(guān)研究,尤其是針對缺乏化學(xué)分離經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室,仍需開發(fā)一套簡便、經(jīng)濟(jì)、高效的DON制備方法。

    本研究充分利用了DON與其他雜質(zhì)物化特性的差異,開發(fā)了一套簡單經(jīng)濟(jì)的“抽提-凈化-精制-純化”四步DON純化制備方法,使用該方法可以從每千克PH-1的大米培養(yǎng)物中獲得61.4 mg DON純品。此外,該方法的優(yōu)勢還在于對于缺乏昂貴實(shí)驗(yàn)設(shè)備和化學(xué)分離經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室,經(jīng)過精制的DON純度已經(jīng)達(dá)到80%以上,可以滿足常規(guī)研究的需求。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 材料與試劑 禾谷鐮刀菌PH-1由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所張昊老師惠贈(zèng);DON標(biāo)準(zhǔn)品:購自青島普瑞邦生物工程有限公司;大米:購自北京市興創(chuàng)科源生物技術(shù)有限公司;甲醇(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、石油醚(60-90℃):購自北京市通廣精細(xì)化工有限公司;乙腈(分析純)、氯化鈉:購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇(色譜純):購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;純凈水:購自杭州娃哈哈基團(tuán)有限公司;無水硫酸鈉:購自生工生物工程(上海)股份有限公司;滅菌袋:購自北京威萊博生物技術(shù)有限公司。

    1.1.1.1 PDA培養(yǎng)基 稱取200.0 g去皮土豆,小塊,沸水煮20 min,使用8層紗布濾得濾液,在濾液中加入葡萄糖20.0 g,并使用蒸餾水定容至1 000 mL,攪拌均勻后分裝到500 mL錐形瓶中,每個(gè)錐形瓶加入200 mL濾液和3.0 g瓊脂,121℃滅菌15 min。

    1.1.1.2 產(chǎn)毒培養(yǎng)基 大米100.0 g裝入滅菌袋中,加入20 mL蒸餾水,充分混勻后使用16層紗布封口以保證透氣性,121℃滅菌15 min。

    1.1.2 儀器與設(shè)備 LD-Y300A高速萬能粉碎機(jī):上海頂帥電器有限公司;HPS-200B生化培養(yǎng)箱、DLCJ-2NDI超凈工作臺(tái):北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;RE-52-3-5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海青浦滬西儀器廠;水式真空泵:北京中興偉業(yè)儀器有限公司;LTCPS80C立式壓力蒸汽滅菌鍋:立德泰勀(上海)科學(xué)儀器有限公司;DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;KQ-400DE超聲清洗儀:昆山市超聲儀器有限公司;高效液相色譜儀Agilent Infinity 1260 HPLC、色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 Semi-Prep(9.4 mm×250 mm,5 μm):美國Agilent公司;色譜柱Waters XBridge C18(4.6 mm× 150 mm,5 μm):美國Waters公司。

    1.2 方法

    1.2.1 DON檢測方法的建立 使用Agilent Infinity 1260 HPLC對DON的含量進(jìn)行檢測。檢測條件如下:上樣量:20 μL;流動(dòng)相:水和甲醇(色譜純)(80∶20,V/V),等度洗脫,使用前過0.2 μm濾膜并超聲脫氣;流速:0.8 mL/min;色譜柱:Waters XBridge C18 色譜柱(4.6 mm × 150 mm,5 μm);柱溫:30℃;檢測波長:218 nm。

    1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用純凈水將DON標(biāo)準(zhǔn)品稀釋,分別配制濃度為1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的DON標(biāo)準(zhǔn)工作液,上機(jī)測定,建立DON含量與峰面積的回歸方程,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

    1.2.3 禾谷鐮刀菌PH-1的固態(tài)發(fā)酵 將禾谷鐮刀菌PH-1接種于PDA培養(yǎng)基上,25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周左右至菌絲長滿平板。使用直徑8 mm的打孔器沿菌落邊緣打制菌餅,確保菌餅菌絲生長狀態(tài)一致。將菌餅分別接種至小麥培養(yǎng)基和大米培養(yǎng)基中,每袋培養(yǎng)基接種5個(gè)菌餅,揉捏接種菌餅的培養(yǎng)基,使菌絲混勻在培養(yǎng)基中。在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天揉捏培養(yǎng)基,保證培養(yǎng)基松散不結(jié)塊。每7 d取樣一次,監(jiān)測DON的含量變化。

    1.2.4 DON提取劑的選擇及DON產(chǎn)量的檢測 將樣品在60℃的烘箱中烘干,粉碎后過50目篩,分別加入5倍質(zhì)量體積比的乙腈-水(84∶16,V/V)、甲 醇-水(9∶1,V/V)、甲 醇-水(8∶2,V/V)甲醇-水(7∶3,V/V),置于30℃恒溫?fù)u床中,200 r/min振蕩24 h。取粗提液過0.22 μm濾膜后進(jìn)行HPLC檢測。

    1.2.5 粗毒素的提取 選擇培養(yǎng)28 d的樣品制備DON,乙腈-水(84∶16,V/V)作為提取劑,提取方法同1.2.4。減壓抽濾獲得粗提液,將粗提液濃縮至膏狀,待下一步分離使用。

    1.2.6 粗毒素的凈化 (1)使用原粗提液1/10體積的提取劑重新溶解粗毒素并過濾除去不溶性雜質(zhì)。(2)在濾液中加入等體積石油醚,振蕩5 min,靜置分層,取下層乙腈-水相,重復(fù)操作3次以充分除去脂類物質(zhì)。(3)在乙腈-水相中加入NaCl至飽和,振蕩5 min,靜置分層,取上層乙腈相,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑,加入等體積乙腈重新溶解,過0.45 μm濾膜除去不溶性雜質(zhì);再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑,加入

    等體積蒸餾水重新溶解。

    1.2.7 DON的精制 (1)水相中加入等體積乙酸乙酯-石油醚(1∶1,V/V),振蕩5 min,靜置分層,取下層水相,重復(fù)操作3次。(2)向水相加入NaCl至飽和,再加入等體積乙酸乙酯,振蕩5 min,靜置分層,取上層乙酸乙酯相,重復(fù)操作3次;合并乙酸乙酯相,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑,加入等體積乙酸乙酯重新溶解,過0.45 μm濾膜除去不溶性雜質(zhì)。再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑,加入1/10體積蒸餾水重新溶解,并過0.22 μm濾膜,待進(jìn)一步純化用。

    1.2.8 DON的純化 使用制備型高效液相色譜做進(jìn)一步純化,條件如下:流動(dòng)相∶水和甲醇(色譜純)(80∶20,V/V),等度洗脫;流速:4 mL/min;色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(9.4 mm ×250 mm,5 μm);柱溫:30℃;檢測波長:218 nm。合并收集的餾分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑后于-20℃保存。

    1.2.9 DON的定量及純度鑒定 使用HPLC檢測純化產(chǎn)物中DON濃度,同時(shí)在200-950 nm的范圍內(nèi)對其進(jìn)行全波長掃描;將純化產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑,氘代甲醇重新溶解,1H-NMR檢測分子結(jié)構(gòu),鑒定DON純度。

    2 結(jié)果

    2.1 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    使用Agilent Infinity 1260 HPLC分別檢測濃度為1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的DON標(biāo)準(zhǔn)工作液,以DON濃度為橫坐標(biāo),DON的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:y= 28.332x - 4.5289,相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 8。此檢測方法在1 mg/L-50 mg/L的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

    2.2 禾谷鐮刀菌PH-1的固態(tài)發(fā)酵

    在固態(tài)發(fā)酵之前,首先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)測定了大米和小麥兩種培養(yǎng)基對DON產(chǎn)量的影響,研究結(jié)果表明連續(xù)培養(yǎng)14 d后的大米培養(yǎng)基中DON產(chǎn)量和比例均高于小麥培養(yǎng)基,DON產(chǎn)量為41.9 mg/kg,占粗毒素的2.7%。進(jìn)一步測定了大米培養(yǎng)基中含水量(10%-60%)對DON產(chǎn)量的影響,研究結(jié)果表明連續(xù)培養(yǎng)14 d后含水量為20%的大米培養(yǎng)基中DON產(chǎn)量最高,為61.2 mg/kg。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,選用含水量20%的大米培養(yǎng)基作為產(chǎn)毒培養(yǎng)基。

    為了監(jiān)測禾谷鐮刀菌發(fā)酵過程中DON產(chǎn)量的動(dòng)態(tài)變化,在接菌7 d、14 d、21 d、28 d及35 d后取樣并測定樣品中DON的含量。接種禾谷鐮刀菌不同時(shí)間后培養(yǎng)物的狀態(tài)發(fā)生了明顯的變化,培養(yǎng)基中大米由最初的顆粒狀變成了越來越細(xì)小的粉末狀,同時(shí)顏色也越來越深(圖 2),說明禾谷鐮刀菌能夠充分利用大米培養(yǎng)基中的營養(yǎng)進(jìn)行生長,并在此過程中產(chǎn)生了大量色素。

    圖2 接種禾谷鐮刀菌PH-1的大米培養(yǎng)基在發(fā)酵0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d后的狀態(tài)

    與培養(yǎng)物狀態(tài)變化相對應(yīng)的是DON的含量也發(fā)生了明顯的變化(圖 3),在連續(xù)25℃恒溫培養(yǎng)的35 d過程中,DON的產(chǎn)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢,在28 d時(shí)達(dá)到最高(259.47 mg/kg),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇接種28 d后的產(chǎn)毒培養(yǎng)物進(jìn)行DON的分離和純化。至于為何DON的產(chǎn)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢,推測這與禾谷鐮刀菌自身的代謝變化密切相關(guān),但其具體的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

    2.3 DON粗毒素的提取

    圖3 禾谷鐮刀菌PH-1的產(chǎn)毒曲線

    為了比較不同提取劑的提取效果,以84%乙腈的提取率為100%,計(jì)算不同比例的甲醇-水溶液的提取率,同時(shí)對粗提液的峰面積進(jìn)行歸一化處理,計(jì)算DON占粗提液的比例(表1)。研究結(jié)果表明90%甲醇(圖4-C,表1)的DON提取率極低,僅為22.7%,80%甲醇(圖4-D)和70%甲醇(圖4-E)與84%乙腈(圖 4-B)提取效率相當(dāng)(表1),但是雜質(zhì)的含量明顯增多(表1),給后期的分離純化工作帶來挑戰(zhàn)。因此本研究選擇了文獻(xiàn)中報(bào)道最多的84%乙腈作為DON提取劑。

    2.4 DON的分離

    從圖5-A可知,粗毒素中含有大量的雜質(zhì),DON含量僅為2.9%(表1)。因此,首先利用石油醚、乙腈以及飽和NaCl溶液三者不互溶的特性,去除一部分雜質(zhì),凈化粗毒素。圖5-B為凈化后的粗毒素,與凈化前相比雜質(zhì)的含量降低了一個(gè)數(shù)量級(jí),4 min、5 min位置附近的雜質(zhì)更是降低到原來的1%左右;DON的比例上升至20.1%,且總量沒有明顯的損失。

    凈化后粗毒素中仍然存在大量雜質(zhì),需要再次進(jìn)行了雜質(zhì)去除操作。圖5-C為再次去除雜質(zhì)后的色譜圖,與圖5-B相比,4 min、5 min位置的雜質(zhì)成功去除,2 min位置雜質(zhì)減少50%。DON在乙酸乙酯和飽和NaCl溶液中的分配比為3.3∶1,采用乙酸乙酯3次萃取后,2-4 min的雜質(zhì)幾乎都留在水相中(圖5-D),DON已經(jīng)全部轉(zhuǎn)移到有機(jī)相(即乙酸乙酯)中(圖5-E),經(jīng)過精制的DON純度達(dá)到81.5%。

    表1 不同提取劑提取效果對比

    圖4 不同溶劑提取液色譜圖

    圖5 不同分離階段色譜圖

    2.5 DON的純化及純度鑒定

    雖然精制后的DON已經(jīng)去除大部分雜質(zhì),但是依舊不能獲得DON純品,利用制備型HPLC進(jìn)一步純化,收集餾分獲得純化后的DON。使用分析型HPLC對純化產(chǎn)物檢測,利用軟件對產(chǎn)物峰積分,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程,計(jì)算得DON為61.4 mg,即1 kg產(chǎn)毒培養(yǎng)基可獲得61.4 mg DON純品。

    對純化產(chǎn)物進(jìn)行純度鑒定,結(jié)果如圖6-A所示:純化樣品的出峰時(shí)間與DON標(biāo)準(zhǔn)品(圖4-A)一致;樣品DON色譜峰純度大于99%,全波長掃描顯示最大吸收波長在220 nm(圖6-B),與DON一致;1H-NMR檢測結(jié)果為:1H NMR(CD3OD),δ:1.127(s,3H),1.848(s,3H),1.842(t,1H),2.442(dd,1H),3.069(dd,2H),3.542(d,2H),3.685(dd,2H),4.357(m,1H),4.814(s,1H),4.954(d,1H),6.608(dd,1H)。HPLC與1H-NMR結(jié)果證明獲得的是DON純品。

    圖6 純化產(chǎn)物純度分析

    3 討論

    近年來,隨著全球環(huán)境的惡化,氣候異常導(dǎo)致的病害大爆發(fā)時(shí)常發(fā)生,我國部分地區(qū)小麥赤霉病呈逐年上升趨勢[20-21]。赤霉病不僅會(huì)導(dǎo)致小麥產(chǎn)量降低,還會(huì)產(chǎn)生大量的DON,導(dǎo)致小麥品質(zhì)下降甚至不能作為食物或者飼料使用,造成嚴(yán)重?fù)p失[22]。DON能夠破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)、影響線粒體功能以及抑制蛋白質(zhì)的合成[23];若長期暴露在低劑量DON環(huán)境中,能夠引起胚胎發(fā)育缺陷以及畸形發(fā)育[24];若人、畜、禽等誤食DON,輕則會(huì)產(chǎn)生惡心、嘔吐等不良反應(yīng),重則中毒死亡[25]。為了獲得大量高純度的DON用于科學(xué)研究,國內(nèi)外科研團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了大量探索,希望開發(fā)一種經(jīng)濟(jì)高效的DON的制備方法。

    目前,DON主要通過禾谷鐮刀菌發(fā)酵產(chǎn)生,小麥、大米、玉米是最常用的產(chǎn)毒培養(yǎng)基。陸鳴等[13]測試了不同培養(yǎng)基對DON產(chǎn)量的影響,研究結(jié)果表明小麥培養(yǎng)基產(chǎn)毒最高;玉米次之;大米最低,但是就DON在粗毒素中的比例而言,大米最高;小麥次之。本研究測試了禾谷鐮刀菌在小麥培養(yǎng)基和大米培養(yǎng)基中發(fā)酵的DON產(chǎn)量情況,結(jié)果與陸鳴的研究結(jié)果有出入,可能是菌種差別的原因。徐得月等[26]預(yù)測水分和培養(yǎng)時(shí)間為產(chǎn)毒的關(guān)鍵影響因子,但是文獻(xiàn)中對于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中水分的描述并不明確,本研究測試培養(yǎng)基含水量對DON產(chǎn)量的影響以及DON產(chǎn)量隨時(shí)間的變化情況,研究結(jié)果表明禾谷鐮刀菌PH-1接種到含水量20%的大米培養(yǎng)基中,培養(yǎng)28 d時(shí)DON產(chǎn)量最高。

    在DON的分離純化方面,洪淑娟等[27]使用甲醇作為粗毒素提取劑,利用高速逆流色譜純化DON,從300 g大米培養(yǎng)基中僅得到8 mg DON,純度97.7%。該方法雖然簡單,但是提取純化效率低。Clifford[16]使用70%甲醇作為粗毒素提取劑采用硅膠柱層析的方法,使用正己烷-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫,并經(jīng)過結(jié)晶和重結(jié)晶,最終獲得DON純度>99%。Zhao等[15]使用84%乙腈作為粗毒素提取劑,采用兩次硅膠柱層析和HPLC純化的方法,該方法操作繁瑣,對實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高。姜云晶等[14]使用兩次硅膠柱層析和重結(jié)晶的方法,存在的問題和Zhao等[15]類似。郭文博等[19]利用自制前處理凈化小柱除雜,制備液相純化DON的方法。前處理凈化小柱相對于硅膠柱,技術(shù)門檻更高,而且更適合應(yīng)用于DON的分析檢測。

    無論是使用高速逆流色譜、高效液相色譜,還是重結(jié)晶的方法純化DON,其樣品的前處理工作大多采用柱層析的方法除去多余的雜質(zhì),凈化DON。根據(jù)DON的理化特性,本研究探索了DON在不同混合溶劑中的分配比例,研究結(jié)果表明DON在等體積乙腈和飽和NaCl溶液中分配比接近1∶1,在等體積乙酸乙酯和水中分配比接近0∶1?;谝陨涎芯拷Y(jié)果,本研究使用經(jīng)典方式凈化DON粗毒素后,加入“精制”這一過程,用以替代其他研究者報(bào)道的硅膠柱層析步驟。精制后的DON純度達(dá)到80%以上,這已經(jīng)能夠滿足常規(guī)研究的需求,例如DON降解菌的初步篩選等。在使用HPLC做最后純化時(shí),較高純度的DON可以有效提高純化效率,降低的色譜柱的損耗,降低分離純化的成本。

    4 結(jié)論

    本研究以大米作為產(chǎn)毒培養(yǎng)基,采用液液萃取分離結(jié)合HPLC純化的方法,建立了一套從DON發(fā)酵、分離到純化的系統(tǒng)方法,利用該方法從每千克大米培養(yǎng)物中獲得61.4 mg DON純品。

    猜你喜歡
    產(chǎn)毒禾谷鐮刀
    稻草人言
    遼河(2024年1期)2024-03-04 06:06:13
    記憶里的一彎鐮刀
    人間好個(gè)秋
    霉菌毒素什么條件下易產(chǎn)生
    漢字對對碰(四)
    郁南平臺(tái)鎮(zhèn)歡慶禾谷誕
    源流(2018年7期)2018-12-03 13:26:38
    孜然精油對產(chǎn)毒黃曲霉的抑制活性研究
    酷蟲學(xué)校再遇鐮刀幫(一)
    ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對擴(kuò)展青霉生長和產(chǎn)毒的影響
    食品防腐劑對產(chǎn)毒黃曲霉孢子萌發(fā)及菌絲生長的抑制作用研究
    欧美乱色亚洲激情| 日韩欧美一区视频在线观看| 日本在线视频免费播放| 男女下面插进去视频免费观看| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲中文字幕日韩| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产色视频综合| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 欧美色视频一区免费| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 999久久久精品免费观看国产| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产成人av激情在线播放| 青草久久国产| 亚洲一码二码三码区别大吗| 在线免费观看的www视频| 国产又爽黄色视频| 男人舔女人的私密视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 制服人妻中文乱码| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美日韩乱码在线| 国产精品,欧美在线| 国产av在哪里看| 欧美乱码精品一区二区三区| 校园春色视频在线观看| 黄片大片在线免费观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 美女午夜性视频免费| 国产高清视频在线播放一区| 91九色精品人成在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产色视频综合| 免费观看人在逋| avwww免费| 国产精品亚洲一级av第二区| 成熟少妇高潮喷水视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 99热只有精品国产| 999久久久国产精品视频| 亚洲国产欧美网| 亚洲国产中文字幕在线视频| av福利片在线| 国产高清有码在线观看视频 | 久久久水蜜桃国产精品网| av天堂在线播放| 欧美成人午夜精品| 757午夜福利合集在线观看| 国内精品久久久久精免费| 日韩欧美国产在线观看| 午夜免费鲁丝| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 黄频高清免费视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 9热在线视频观看99| 淫妇啪啪啪对白视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久九九热精品免费| 国产三级黄色录像| 悠悠久久av| 国产精品一区二区精品视频观看| av电影中文网址| 9色porny在线观看| 在线播放国产精品三级| 99精品久久久久人妻精品| 在线观看免费日韩欧美大片| 天堂动漫精品| 搡老岳熟女国产| 日本黄色视频三级网站网址| 女性被躁到高潮视频| 咕卡用的链子| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 女警被强在线播放| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 麻豆成人av在线观看| 国内精品久久久久精免费| 亚洲欧美精品综合久久99| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 中文字幕最新亚洲高清| av片东京热男人的天堂| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 女性生殖器流出的白浆| 在线永久观看黄色视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久久久久久久免费视频了| 极品人妻少妇av视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日本 av在线| 亚洲电影在线观看av| 亚洲精品av麻豆狂野| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲五月天丁香| 久久精品国产清高在天天线| 身体一侧抽搐| 91九色精品人成在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 18禁美女被吸乳视频| 午夜福利18| 9热在线视频观看99| 欧美久久黑人一区二区| 女人被狂操c到高潮| 亚洲黑人精品在线| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲av成人av| 美女大奶头视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 天堂影院成人在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 好男人在线观看高清免费视频 | 黄色 视频免费看| 不卡av一区二区三区| 国产精品 欧美亚洲| 精品欧美一区二区三区在线| 女性生殖器流出的白浆| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 精品国产国语对白av| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美中文综合在线视频| 久久久国产成人免费| 国产成年人精品一区二区| 久久精品91蜜桃| 亚洲最大成人中文| 久久青草综合色| 欧美大码av| 亚洲免费av在线视频| 亚洲五月婷婷丁香| 免费观看人在逋| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产精品一区二区三区四区久久 | 黄色毛片三级朝国网站| 久久青草综合色| 国产成人av激情在线播放| 国产在线精品亚洲第一网站| 级片在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 少妇粗大呻吟视频| 麻豆成人av在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 日日爽夜夜爽网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 成人18禁在线播放| 精品久久久久久久久久免费视频| 成人手机av| 日韩高清综合在线| 男人操女人黄网站| 午夜福利在线观看吧| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 俄罗斯特黄特色一大片| cao死你这个sao货| 亚洲av熟女| 日本 欧美在线| 国产成人精品久久二区二区91| 日本a在线网址| 黄频高清免费视频| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久国产欧美日韩av| 嫩草影视91久久| av网站免费在线观看视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 高清毛片免费观看视频网站| 久久久久久久久久久久大奶| 在线观看免费日韩欧美大片| 免费在线观看黄色视频的| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品欧美一区二区三区在线| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜久久久在线观看| aaaaa片日本免费| 久久精品成人免费网站| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久久久久久午夜电影| 99国产精品免费福利视频| 亚洲久久久国产精品| 精品乱码久久久久久99久播| 国产免费av片在线观看野外av| 9热在线视频观看99| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美在线一区亚洲| 大香蕉久久成人网| 国产欧美日韩一区二区精品| 日本vs欧美在线观看视频| 在线播放国产精品三级| 咕卡用的链子| 悠悠久久av| 亚洲 国产 在线| 国产成人系列免费观看| 身体一侧抽搐| 波多野结衣高清无吗| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久狼人影院| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美激情高清一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 自线自在国产av| 午夜福利18| 午夜免费观看网址| 亚洲av电影在线进入| 亚洲九九香蕉| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产精品一区二区三区四区久久 | 老熟妇仑乱视频hdxx| 午夜影院日韩av| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 深夜精品福利| 久久中文字幕一级| 又大又爽又粗| 性少妇av在线| 色尼玛亚洲综合影院| 91大片在线观看| 成人精品一区二区免费| 成人国产综合亚洲| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲国产精品999在线| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲精品一区av在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产成年人精品一区二区| 露出奶头的视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久久国产成人精品二区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品久久蜜臀av无| 91精品国产国语对白视频| 激情在线观看视频在线高清| 在线观看免费视频日本深夜| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 涩涩av久久男人的天堂| 在线观看一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 视频区欧美日本亚洲| 国产高清有码在线观看视频 | 国产色视频综合| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 午夜日韩欧美国产| 超碰成人久久| 色老头精品视频在线观看| 精品福利观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 久99久视频精品免费| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产成人啪精品午夜网站| 看黄色毛片网站| 一二三四在线观看免费中文在| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产精品二区激情视频| 黄色视频,在线免费观看| av网站免费在线观看视频| 麻豆国产av国片精品| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 9191精品国产免费久久| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 大型黄色视频在线免费观看| 美女免费视频网站| 免费高清视频大片| 国产高清有码在线观看视频 | 一区二区三区精品91| 国产成人欧美在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产免费男女视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 中国美女看黄片| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产国语露脸激情在线看| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 人人妻人人澡人人看| 欧美中文综合在线视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲国产欧美网| 激情视频va一区二区三区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 十八禁网站免费在线| 久久久久久久久久久久大奶| 久久草成人影院| 一本综合久久免费| 999久久久国产精品视频| АⅤ资源中文在线天堂| a级毛片在线看网站| 女警被强在线播放| 午夜久久久久精精品| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美成人午夜精品| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产极品粉嫩免费观看在线| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲五月色婷婷综合| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产av又大| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产伦人伦偷精品视频| 黄片大片在线免费观看| 色av中文字幕| 国产精品亚洲美女久久久| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日韩免费av在线播放| 亚洲成人国产一区在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 一进一出抽搐动态| 级片在线观看| 一本大道久久a久久精品| 黄色 视频免费看| 欧美激情 高清一区二区三区| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲国产精品久久男人天堂| 91九色精品人成在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 在线永久观看黄色视频| 久久中文字幕一级| 国产成人av教育| 久久国产亚洲av麻豆专区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲激情在线av| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲av成人一区二区三| 97碰自拍视频| 国产午夜精品久久久久久| 一区二区三区精品91| 日韩欧美国产在线观看| 成年版毛片免费区| av在线播放免费不卡| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 在线播放国产精品三级| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 乱人伦中国视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产色视频综合| 制服人妻中文乱码| 欧美精品亚洲一区二区| 99re在线观看精品视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 青草久久国产| 午夜免费鲁丝| 午夜视频精品福利| 国产一区二区激情短视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 日韩欧美国产在线观看| 少妇 在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲精华国产精华精| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 91九色精品人成在线观看| 村上凉子中文字幕在线| av在线天堂中文字幕| svipshipincom国产片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲激情在线av| 国产精华一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 女同久久另类99精品国产91| 久久精品影院6| 一级作爱视频免费观看| 亚洲情色 制服丝袜| 九色亚洲精品在线播放| 日本 av在线| 大型av网站在线播放| 两人在一起打扑克的视频| 咕卡用的链子| 色在线成人网| 人成视频在线观看免费观看| 中文字幕最新亚洲高清| 国产视频一区二区在线看| 国产私拍福利视频在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国内精品久久久久精免费| 91字幕亚洲| 亚洲九九香蕉| 国产成人欧美在线观看| 曰老女人黄片| 美女高潮到喷水免费观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 精品一区二区三区四区五区乱码| 日日夜夜操网爽| 好男人电影高清在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲精品国产区一区二| 国产一区二区三区综合在线观看| 三级毛片av免费| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲国产精品sss在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 国产亚洲欧美精品永久| 在线观看66精品国产| 国产精品免费一区二区三区在线| 十八禁人妻一区二区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 日韩中文字幕欧美一区二区| 岛国视频午夜一区免费看| 男人的好看免费观看在线视频 | 一区二区三区高清视频在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美乱码精品一区二区三区| 免费看a级黄色片| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲avbb在线观看| 少妇 在线观看| 国产野战对白在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 中文字幕精品免费在线观看视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 日韩免费av在线播放| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产麻豆69| 亚洲一区中文字幕在线| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲人成电影观看| 中文字幕高清在线视频| 99re在线观看精品视频| 日韩高清综合在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲国产精品999在线| 在线观看午夜福利视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 18禁观看日本| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久久久久久久免费视频了| 男人舔女人的私密视频| 搡老妇女老女人老熟妇| www.熟女人妻精品国产| 亚洲精品在线美女| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 美女高潮到喷水免费观看| 99久久精品国产亚洲精品| 9热在线视频观看99| 亚洲第一青青草原| 18禁黄网站禁片午夜丰满| www日本在线高清视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 一本久久中文字幕| 欧美久久黑人一区二区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 69av精品久久久久久| 91大片在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 99在线人妻在线中文字幕| 精品一区二区三区四区五区乱码| 不卡av一区二区三区| 日韩欧美三级三区| 热99re8久久精品国产| 久热爱精品视频在线9| 久久久久久久午夜电影| 日本三级黄在线观看| 自线自在国产av| 黄片大片在线免费观看| 国产精品国产高清国产av| 国产亚洲精品久久久久5区| 精品国内亚洲2022精品成人| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩有码中文字幕| 在线观看66精品国产| 精品久久久久久久毛片微露脸| 黄色a级毛片大全视频| 国产成人系列免费观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 岛国在线观看网站| 国产成人精品在线电影| 精品日产1卡2卡| 97碰自拍视频| 91国产中文字幕| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产精品日韩av在线免费观看 | 日韩精品青青久久久久久| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲成av人片免费观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美国产日韩亚洲一区| 色在线成人网| 在线观看日韩欧美| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品日韩av在线免费观看 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 中国美女看黄片| 757午夜福利合集在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 黄色丝袜av网址大全| 一级毛片精品| 午夜影院日韩av| 国产成人影院久久av| 不卡av一区二区三区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品国内亚洲2022精品成人| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲成国产人片在线观看| 97碰自拍视频| 国产精品久久视频播放| 国产免费男女视频| or卡值多少钱| 可以在线观看毛片的网站| 久久中文看片网| 日本三级黄在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 婷婷丁香在线五月| 国产男靠女视频免费网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 在线观看www视频免费| 色播亚洲综合网| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 俄罗斯特黄特色一大片| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 制服诱惑二区| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 欧美日本视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 九色国产91popny在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 999精品在线视频| 久久性视频一级片| 中文亚洲av片在线观看爽| 最近最新免费中文字幕在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美日韩乱码在线| 又黄又粗又硬又大视频| av在线天堂中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久狼人影院| 1024视频免费在线观看| 日韩国内少妇激情av| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美一区二区精品小视频在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩精品免费视频一区二区三区| 免费在线观看亚洲国产| 高潮久久久久久久久久久不卡| 免费av毛片视频| 国产激情久久老熟女| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 一区在线观看完整版| 妹子高潮喷水视频| a在线观看视频网站| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲av成人av| 首页视频小说图片口味搜索| 搡老岳熟女国产| 一级,二级,三级黄色视频| 国产乱人伦免费视频| 99国产精品免费福利视频| x7x7x7水蜜桃| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产一区二区激情短视频| 两人在一起打扑克的视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 日韩有码中文字幕| 91在线观看av| 国产精品精品国产色婷婷| 日本在线视频免费播放| 午夜福利一区二区在线看| 一级作爱视频免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 制服丝袜大香蕉在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 神马国产精品三级电影在线观看 | 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 怎么达到女性高潮| 久久天堂一区二区三区四区| 久久性视频一级片| 国产国语露脸激情在线看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久久久亚洲av毛片大全| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品福利观看| 亚洲精华国产精华精| 色综合婷婷激情|