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    一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇制備工藝的研究

    2020-11-02 08:51:44段佳琪李琲琲任杰邱德文李廣悅
    生物技術(shù)通報(bào) 2020年10期
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)毒禾谷鐮刀

    段佳琪 李琲琲 任杰 邱德文 李廣悅

    (1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究所 吉林省資源昆蟲產(chǎn)業(yè)化工程中心,長春 130118;2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

    脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是鐮刀菌侵染大麥、小麥、玉米等谷物后產(chǎn)生的一種真菌毒素,最早在1970年由諸罔信一等人從感染赤霉病的大麥中分離獲得[1]。DON屬于單端孢霉烯族毒素,分子式為C15H20O6(圖1)[2],能夠抑制蛋白質(zhì)合成[3],具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性,是毒性較大的真菌毒素之一,并且能與其他毒素產(chǎn)生毒性增效作用[4-5]。最新的研究表明,長期暴露在低劑量DON下,人和動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生慢性不良反應(yīng),甚至導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[6-9];而人畜一旦攝入過量的DON污染的食物后,會(huì)出現(xiàn)急性中毒癥狀,嚴(yán)重時(shí)甚至造成死亡[10-11]。

    圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的分子結(jié)構(gòu)

    鑒于DON在糧食、飼料和食品中污染的普遍性及其對人畜健康危害的嚴(yán)重性,系統(tǒng)研究DON的致毒機(jī)理、檢測方法和脫毒方法尤為迫切和重要。獲得大量的高純度的標(biāo)準(zhǔn)品是進(jìn)行DON相關(guān)研究的基礎(chǔ)和保障,然而由于DON結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)的特殊性,其高效的化學(xué)合成仍然面臨挑戰(zhàn)[12],因此目前市售的DON標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴,阻礙了DON相關(guān)研究的開展。禾谷鐮刀菌發(fā)酵結(jié)合后續(xù)的分離純化是目前獲取大量高純度DON的最有效的方法,國內(nèi)外的研究人員對此工藝進(jìn)行了大量的研究和改進(jìn)。在培養(yǎng)基的選擇上,多使用大米作為產(chǎn)毒培養(yǎng)基,也有利用小麥和玉米作為產(chǎn)毒培養(yǎng)基的報(bào)道[13-15];在DON的分離純化方面,多采用柱層析技術(shù),配合HPLC和高速逆流色譜技術(shù),輔以重結(jié)晶的手段,達(dá)到分離純化DON的目的[14-19]。柱層析技術(shù)操作繁瑣,耗時(shí)耗力,對操作人員的要求較高,同時(shí)需要大量的有機(jī)試劑,成本較高。高速逆流色譜價(jià)格昂貴,一般常規(guī)實(shí)驗(yàn)室無法配備。因此,為了有效推進(jìn)DON的相關(guān)研究,尤其是針對缺乏化學(xué)分離經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室,仍需開發(fā)一套簡便、經(jīng)濟(jì)、高效的DON制備方法。

    本研究充分利用了DON與其他雜質(zhì)物化特性的差異,開發(fā)了一套簡單經(jīng)濟(jì)的“抽提-凈化-精制-純化”四步DON純化制備方法,使用該方法可以從每千克PH-1的大米培養(yǎng)物中獲得61.4 mg DON純品。此外,該方法的優(yōu)勢還在于對于缺乏昂貴實(shí)驗(yàn)設(shè)備和化學(xué)分離經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室,經(jīng)過精制的DON純度已經(jīng)達(dá)到80%以上,可以滿足常規(guī)研究的需求。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 材料與試劑 禾谷鐮刀菌PH-1由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所張昊老師惠贈(zèng);DON標(biāo)準(zhǔn)品:購自青島普瑞邦生物工程有限公司;大米:購自北京市興創(chuàng)科源生物技術(shù)有限公司;甲醇(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、石油醚(60-90℃):購自北京市通廣精細(xì)化工有限公司;乙腈(分析純)、氯化鈉:購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇(色譜純):購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;純凈水:購自杭州娃哈哈基團(tuán)有限公司;無水硫酸鈉:購自生工生物工程(上海)股份有限公司;滅菌袋:購自北京威萊博生物技術(shù)有限公司。

    1.1.1.1 PDA培養(yǎng)基 稱取200.0 g去皮土豆,小塊,沸水煮20 min,使用8層紗布濾得濾液,在濾液中加入葡萄糖20.0 g,并使用蒸餾水定容至1 000 mL,攪拌均勻后分裝到500 mL錐形瓶中,每個(gè)錐形瓶加入200 mL濾液和3.0 g瓊脂,121℃滅菌15 min。

    1.1.1.2 產(chǎn)毒培養(yǎng)基 大米100.0 g裝入滅菌袋中,加入20 mL蒸餾水,充分混勻后使用16層紗布封口以保證透氣性,121℃滅菌15 min。

    1.1.2 儀器與設(shè)備 LD-Y300A高速萬能粉碎機(jī):上海頂帥電器有限公司;HPS-200B生化培養(yǎng)箱、DLCJ-2NDI超凈工作臺(tái):北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;RE-52-3-5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海青浦滬西儀器廠;水式真空泵:北京中興偉業(yè)儀器有限公司;LTCPS80C立式壓力蒸汽滅菌鍋:立德泰勀(上海)科學(xué)儀器有限公司;DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;KQ-400DE超聲清洗儀:昆山市超聲儀器有限公司;高效液相色譜儀Agilent Infinity 1260 HPLC、色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 Semi-Prep(9.4 mm×250 mm,5 μm):美國Agilent公司;色譜柱Waters XBridge C18(4.6 mm× 150 mm,5 μm):美國Waters公司。

    1.2 方法

    1.2.1 DON檢測方法的建立 使用Agilent Infinity 1260 HPLC對DON的含量進(jìn)行檢測。檢測條件如下:上樣量:20 μL;流動(dòng)相:水和甲醇(色譜純)(80∶20,V/V),等度洗脫,使用前過0.2 μm濾膜并超聲脫氣;流速:0.8 mL/min;色譜柱:Waters XBridge C18 色譜柱(4.6 mm × 150 mm,5 μm);柱溫:30℃;檢測波長:218 nm。

    1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用純凈水將DON標(biāo)準(zhǔn)品稀釋,分別配制濃度為1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的DON標(biāo)準(zhǔn)工作液,上機(jī)測定,建立DON含量與峰面積的回歸方程,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

    1.2.3 禾谷鐮刀菌PH-1的固態(tài)發(fā)酵 將禾谷鐮刀菌PH-1接種于PDA培養(yǎng)基上,25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周左右至菌絲長滿平板。使用直徑8 mm的打孔器沿菌落邊緣打制菌餅,確保菌餅菌絲生長狀態(tài)一致。將菌餅分別接種至小麥培養(yǎng)基和大米培養(yǎng)基中,每袋培養(yǎng)基接種5個(gè)菌餅,揉捏接種菌餅的培養(yǎng)基,使菌絲混勻在培養(yǎng)基中。在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天揉捏培養(yǎng)基,保證培養(yǎng)基松散不結(jié)塊。每7 d取樣一次,監(jiān)測DON的含量變化。

    1.2.4 DON提取劑的選擇及DON產(chǎn)量的檢測 將樣品在60℃的烘箱中烘干,粉碎后過50目篩,分別加入5倍質(zhì)量體積比的乙腈-水(84∶16,V/V)、甲 醇-水(9∶1,V/V)、甲 醇-水(8∶2,V/V)甲醇-水(7∶3,V/V),置于30℃恒溫?fù)u床中,200 r/min振蕩24 h。取粗提液過0.22 μm濾膜后進(jìn)行HPLC檢測。

    1.2.5 粗毒素的提取 選擇培養(yǎng)28 d的樣品制備DON,乙腈-水(84∶16,V/V)作為提取劑,提取方法同1.2.4。減壓抽濾獲得粗提液,將粗提液濃縮至膏狀,待下一步分離使用。

    1.2.6 粗毒素的凈化 (1)使用原粗提液1/10體積的提取劑重新溶解粗毒素并過濾除去不溶性雜質(zhì)。(2)在濾液中加入等體積石油醚,振蕩5 min,靜置分層,取下層乙腈-水相,重復(fù)操作3次以充分除去脂類物質(zhì)。(3)在乙腈-水相中加入NaCl至飽和,振蕩5 min,靜置分層,取上層乙腈相,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑,加入等體積乙腈重新溶解,過0.45 μm濾膜除去不溶性雜質(zhì);再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑,加入

    等體積蒸餾水重新溶解。

    1.2.7 DON的精制 (1)水相中加入等體積乙酸乙酯-石油醚(1∶1,V/V),振蕩5 min,靜置分層,取下層水相,重復(fù)操作3次。(2)向水相加入NaCl至飽和,再加入等體積乙酸乙酯,振蕩5 min,靜置分層,取上層乙酸乙酯相,重復(fù)操作3次;合并乙酸乙酯相,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑,加入等體積乙酸乙酯重新溶解,過0.45 μm濾膜除去不溶性雜質(zhì)。再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑,加入1/10體積蒸餾水重新溶解,并過0.22 μm濾膜,待進(jìn)一步純化用。

    1.2.8 DON的純化 使用制備型高效液相色譜做進(jìn)一步純化,條件如下:流動(dòng)相∶水和甲醇(色譜純)(80∶20,V/V),等度洗脫;流速:4 mL/min;色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(9.4 mm ×250 mm,5 μm);柱溫:30℃;檢測波長:218 nm。合并收集的餾分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑后于-20℃保存。

    1.2.9 DON的定量及純度鑒定 使用HPLC檢測純化產(chǎn)物中DON濃度,同時(shí)在200-950 nm的范圍內(nèi)對其進(jìn)行全波長掃描;將純化產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑,氘代甲醇重新溶解,1H-NMR檢測分子結(jié)構(gòu),鑒定DON純度。

    2 結(jié)果

    2.1 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    使用Agilent Infinity 1260 HPLC分別檢測濃度為1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的DON標(biāo)準(zhǔn)工作液,以DON濃度為橫坐標(biāo),DON的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:y= 28.332x - 4.5289,相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 8。此檢測方法在1 mg/L-50 mg/L的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

    2.2 禾谷鐮刀菌PH-1的固態(tài)發(fā)酵

    在固態(tài)發(fā)酵之前,首先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)測定了大米和小麥兩種培養(yǎng)基對DON產(chǎn)量的影響,研究結(jié)果表明連續(xù)培養(yǎng)14 d后的大米培養(yǎng)基中DON產(chǎn)量和比例均高于小麥培養(yǎng)基,DON產(chǎn)量為41.9 mg/kg,占粗毒素的2.7%。進(jìn)一步測定了大米培養(yǎng)基中含水量(10%-60%)對DON產(chǎn)量的影響,研究結(jié)果表明連續(xù)培養(yǎng)14 d后含水量為20%的大米培養(yǎng)基中DON產(chǎn)量最高,為61.2 mg/kg。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,選用含水量20%的大米培養(yǎng)基作為產(chǎn)毒培養(yǎng)基。

    為了監(jiān)測禾谷鐮刀菌發(fā)酵過程中DON產(chǎn)量的動(dòng)態(tài)變化,在接菌7 d、14 d、21 d、28 d及35 d后取樣并測定樣品中DON的含量。接種禾谷鐮刀菌不同時(shí)間后培養(yǎng)物的狀態(tài)發(fā)生了明顯的變化,培養(yǎng)基中大米由最初的顆粒狀變成了越來越細(xì)小的粉末狀,同時(shí)顏色也越來越深(圖 2),說明禾谷鐮刀菌能夠充分利用大米培養(yǎng)基中的營養(yǎng)進(jìn)行生長,并在此過程中產(chǎn)生了大量色素。

    圖2 接種禾谷鐮刀菌PH-1的大米培養(yǎng)基在發(fā)酵0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d后的狀態(tài)

    與培養(yǎng)物狀態(tài)變化相對應(yīng)的是DON的含量也發(fā)生了明顯的變化(圖 3),在連續(xù)25℃恒溫培養(yǎng)的35 d過程中,DON的產(chǎn)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢,在28 d時(shí)達(dá)到最高(259.47 mg/kg),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇接種28 d后的產(chǎn)毒培養(yǎng)物進(jìn)行DON的分離和純化。至于為何DON的產(chǎn)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢,推測這與禾谷鐮刀菌自身的代謝變化密切相關(guān),但其具體的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

    2.3 DON粗毒素的提取

    圖3 禾谷鐮刀菌PH-1的產(chǎn)毒曲線

    為了比較不同提取劑的提取效果,以84%乙腈的提取率為100%,計(jì)算不同比例的甲醇-水溶液的提取率,同時(shí)對粗提液的峰面積進(jìn)行歸一化處理,計(jì)算DON占粗提液的比例(表1)。研究結(jié)果表明90%甲醇(圖4-C,表1)的DON提取率極低,僅為22.7%,80%甲醇(圖4-D)和70%甲醇(圖4-E)與84%乙腈(圖 4-B)提取效率相當(dāng)(表1),但是雜質(zhì)的含量明顯增多(表1),給后期的分離純化工作帶來挑戰(zhàn)。因此本研究選擇了文獻(xiàn)中報(bào)道最多的84%乙腈作為DON提取劑。

    2.4 DON的分離

    從圖5-A可知,粗毒素中含有大量的雜質(zhì),DON含量僅為2.9%(表1)。因此,首先利用石油醚、乙腈以及飽和NaCl溶液三者不互溶的特性,去除一部分雜質(zhì),凈化粗毒素。圖5-B為凈化后的粗毒素,與凈化前相比雜質(zhì)的含量降低了一個(gè)數(shù)量級(jí),4 min、5 min位置附近的雜質(zhì)更是降低到原來的1%左右;DON的比例上升至20.1%,且總量沒有明顯的損失。

    凈化后粗毒素中仍然存在大量雜質(zhì),需要再次進(jìn)行了雜質(zhì)去除操作。圖5-C為再次去除雜質(zhì)后的色譜圖,與圖5-B相比,4 min、5 min位置的雜質(zhì)成功去除,2 min位置雜質(zhì)減少50%。DON在乙酸乙酯和飽和NaCl溶液中的分配比為3.3∶1,采用乙酸乙酯3次萃取后,2-4 min的雜質(zhì)幾乎都留在水相中(圖5-D),DON已經(jīng)全部轉(zhuǎn)移到有機(jī)相(即乙酸乙酯)中(圖5-E),經(jīng)過精制的DON純度達(dá)到81.5%。

    表1 不同提取劑提取效果對比

    圖4 不同溶劑提取液色譜圖

    圖5 不同分離階段色譜圖

    2.5 DON的純化及純度鑒定

    雖然精制后的DON已經(jīng)去除大部分雜質(zhì),但是依舊不能獲得DON純品,利用制備型HPLC進(jìn)一步純化,收集餾分獲得純化后的DON。使用分析型HPLC對純化產(chǎn)物檢測,利用軟件對產(chǎn)物峰積分,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程,計(jì)算得DON為61.4 mg,即1 kg產(chǎn)毒培養(yǎng)基可獲得61.4 mg DON純品。

    對純化產(chǎn)物進(jìn)行純度鑒定,結(jié)果如圖6-A所示:純化樣品的出峰時(shí)間與DON標(biāo)準(zhǔn)品(圖4-A)一致;樣品DON色譜峰純度大于99%,全波長掃描顯示最大吸收波長在220 nm(圖6-B),與DON一致;1H-NMR檢測結(jié)果為:1H NMR(CD3OD),δ:1.127(s,3H),1.848(s,3H),1.842(t,1H),2.442(dd,1H),3.069(dd,2H),3.542(d,2H),3.685(dd,2H),4.357(m,1H),4.814(s,1H),4.954(d,1H),6.608(dd,1H)。HPLC與1H-NMR結(jié)果證明獲得的是DON純品。

    圖6 純化產(chǎn)物純度分析

    3 討論

    近年來,隨著全球環(huán)境的惡化,氣候異常導(dǎo)致的病害大爆發(fā)時(shí)常發(fā)生,我國部分地區(qū)小麥赤霉病呈逐年上升趨勢[20-21]。赤霉病不僅會(huì)導(dǎo)致小麥產(chǎn)量降低,還會(huì)產(chǎn)生大量的DON,導(dǎo)致小麥品質(zhì)下降甚至不能作為食物或者飼料使用,造成嚴(yán)重?fù)p失[22]。DON能夠破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)、影響線粒體功能以及抑制蛋白質(zhì)的合成[23];若長期暴露在低劑量DON環(huán)境中,能夠引起胚胎發(fā)育缺陷以及畸形發(fā)育[24];若人、畜、禽等誤食DON,輕則會(huì)產(chǎn)生惡心、嘔吐等不良反應(yīng),重則中毒死亡[25]。為了獲得大量高純度的DON用于科學(xué)研究,國內(nèi)外科研團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了大量探索,希望開發(fā)一種經(jīng)濟(jì)高效的DON的制備方法。

    目前,DON主要通過禾谷鐮刀菌發(fā)酵產(chǎn)生,小麥、大米、玉米是最常用的產(chǎn)毒培養(yǎng)基。陸鳴等[13]測試了不同培養(yǎng)基對DON產(chǎn)量的影響,研究結(jié)果表明小麥培養(yǎng)基產(chǎn)毒最高;玉米次之;大米最低,但是就DON在粗毒素中的比例而言,大米最高;小麥次之。本研究測試了禾谷鐮刀菌在小麥培養(yǎng)基和大米培養(yǎng)基中發(fā)酵的DON產(chǎn)量情況,結(jié)果與陸鳴的研究結(jié)果有出入,可能是菌種差別的原因。徐得月等[26]預(yù)測水分和培養(yǎng)時(shí)間為產(chǎn)毒的關(guān)鍵影響因子,但是文獻(xiàn)中對于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中水分的描述并不明確,本研究測試培養(yǎng)基含水量對DON產(chǎn)量的影響以及DON產(chǎn)量隨時(shí)間的變化情況,研究結(jié)果表明禾谷鐮刀菌PH-1接種到含水量20%的大米培養(yǎng)基中,培養(yǎng)28 d時(shí)DON產(chǎn)量最高。

    在DON的分離純化方面,洪淑娟等[27]使用甲醇作為粗毒素提取劑,利用高速逆流色譜純化DON,從300 g大米培養(yǎng)基中僅得到8 mg DON,純度97.7%。該方法雖然簡單,但是提取純化效率低。Clifford[16]使用70%甲醇作為粗毒素提取劑采用硅膠柱層析的方法,使用正己烷-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫,并經(jīng)過結(jié)晶和重結(jié)晶,最終獲得DON純度>99%。Zhao等[15]使用84%乙腈作為粗毒素提取劑,采用兩次硅膠柱層析和HPLC純化的方法,該方法操作繁瑣,對實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高。姜云晶等[14]使用兩次硅膠柱層析和重結(jié)晶的方法,存在的問題和Zhao等[15]類似。郭文博等[19]利用自制前處理凈化小柱除雜,制備液相純化DON的方法。前處理凈化小柱相對于硅膠柱,技術(shù)門檻更高,而且更適合應(yīng)用于DON的分析檢測。

    無論是使用高速逆流色譜、高效液相色譜,還是重結(jié)晶的方法純化DON,其樣品的前處理工作大多采用柱層析的方法除去多余的雜質(zhì),凈化DON。根據(jù)DON的理化特性,本研究探索了DON在不同混合溶劑中的分配比例,研究結(jié)果表明DON在等體積乙腈和飽和NaCl溶液中分配比接近1∶1,在等體積乙酸乙酯和水中分配比接近0∶1?;谝陨涎芯拷Y(jié)果,本研究使用經(jīng)典方式凈化DON粗毒素后,加入“精制”這一過程,用以替代其他研究者報(bào)道的硅膠柱層析步驟。精制后的DON純度達(dá)到80%以上,這已經(jīng)能夠滿足常規(guī)研究的需求,例如DON降解菌的初步篩選等。在使用HPLC做最后純化時(shí),較高純度的DON可以有效提高純化效率,降低的色譜柱的損耗,降低分離純化的成本。

    4 結(jié)論

    本研究以大米作為產(chǎn)毒培養(yǎng)基,采用液液萃取分離結(jié)合HPLC純化的方法,建立了一套從DON發(fā)酵、分離到純化的系統(tǒng)方法,利用該方法從每千克大米培養(yǎng)物中獲得61.4 mg DON純品。

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