支持高密度BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)和高產(chǎn)FMD病毒的無血清培養(yǎng)基開發(fā)與優(yōu)化

陳敏 劉旭平 趙亮

（1. 上海倍諳基生物科技有限公司，上海 201203；2. 華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

口蹄疫是一種具有高度傳染性的偶蹄類動(dòng)物疫病，由口蹄疫病毒（含多種血清型：O、A、C、SAT1［Southern african territories 1）、SAT2、SAT3和Asia1］引起，豬、牛、羊等養(yǎng)殖畜類及水牛等野生動(dòng)物易感，感染發(fā)病率100%，其爆發(fā)會(huì)對畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的損失。目前最為有效的防控手段是口蹄疫疫苗的接種［1-5］。畜牧業(yè)的發(fā)展、種群密度的加大都增加了防疫的難度，也進(jìn)一步提高了對疫苗的需求。近年來，各類新型疫苗不斷涌現(xiàn)，大量文獻(xiàn)介紹了這些新型疫苗所能解決的、現(xiàn)有疫苗存在的問題［6-10］。但是，目前被廣泛使用的疫苗仍以滅活病毒疫苗為主?？紤]到滅活疫苗價(jià)格昂貴、保質(zhì)期短、保護(hù)作用短、需要重復(fù)接種的問題［7-10］，提高現(xiàn)有工藝的疫苗生產(chǎn)能力，加大產(chǎn)能，降低生產(chǎn)成本，無疑是解決當(dāng)前疫苗需求困境的最佳策略。從生產(chǎn)工藝的角度，BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝優(yōu)于貼壁生產(chǎn)工藝并將逐步取代后者已在領(lǐng)域內(nèi)達(dá)成共識(shí)，急需解決的是血清引入可能導(dǎo)致的安全隱患和完全無血清體系下支持高密度細(xì)胞培養(yǎng)和高效病毒擴(kuò)增的問題。

目前利用BHK-21懸浮細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫病毒疫苗使用的接毒細(xì)胞密度通常在3×106cells/mL-5×106cells/mL，根據(jù)病毒血清型不同，收獲病毒完整顆粒在1 μg/mL-10 μg/mL不等。“細(xì)胞密度效應(yīng)”是指基于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的病毒生產(chǎn)工藝中發(fā)生的病毒收獲量不能隨接毒時(shí)細(xì)胞密度增高而增高，甚至出現(xiàn)下降的現(xiàn)象［11-14］，是生產(chǎn)工藝在擴(kuò)大規(guī)模和提高產(chǎn)能時(shí)的主要瓶頸。這一現(xiàn)象最有可能的原因是高密度細(xì)胞培養(yǎng)導(dǎo)致體系內(nèi)重要營養(yǎng)物質(zhì)缺乏［15］（如葡萄糖、氨基酸）、有毒代謝副產(chǎn)物積累［16-17］（如乳酸、氨）以及培養(yǎng)環(huán)境參數(shù)改變［18-19］（如pH），進(jìn)而影響了細(xì)胞的生理狀態(tài)以及后續(xù)的細(xì)胞產(chǎn)毒過程。

本單位前期已開展了大量開發(fā)工作，獲得了能夠支持BHK-21懸浮細(xì)胞穩(wěn)定傳代和口蹄疫病毒擴(kuò)增的多個(gè)無血清培養(yǎng)基配方和生產(chǎn)工藝［20-22］。然而，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)仍需添加低濃度的血清以達(dá)到最佳的病毒產(chǎn)量和病毒效價(jià)［20-21］。為實(shí)現(xiàn)完全的無血清培養(yǎng)工藝，本研究首先將BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)于前期開發(fā)的一款無血清培養(yǎng)基中［20］，觀測細(xì)胞生長和接毒時(shí)的生理代謝狀態(tài)，通過代謝通量分析，了解細(xì)胞生長和病毒擴(kuò)增時(shí)的營養(yǎng)需求以及可能導(dǎo)致有毒代謝物積累或培養(yǎng)環(huán)境惡化的原因，識(shí)別關(guān)鍵的營養(yǎng)成分，采用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，旨在得到一款能夠支持BHK-21細(xì)胞高密度懸浮生長和口蹄疫病毒高效擴(kuò)增的無血清培養(yǎng)基，從而取代現(xiàn)有的低血清培養(yǎng)工藝，并獲得超高細(xì)胞密度接毒（＞107cells/mL）、病毒高產(chǎn)量和簡化接毒操作的新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 BHK-21貼壁細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，使用本單位開發(fā)的無血清培養(yǎng)基懸浮馴化，并經(jīng)單克隆篩選后獲得懸浮細(xì)胞株。

1.1.2 培養(yǎng)基 優(yōu)化前的無血清培養(yǎng)基為本單位自主開發(fā)，命名為primary SFM（簡稱P-SFM），包含葡萄糖、氨基酸、維生素、微量元素以及多種血清替代物等營養(yǎng)物質(zhì)。

低血清培養(yǎng)基（簡稱LSM）為優(yōu)化前的無血清培養(yǎng)基加1%新生牛血清。

TCID50測試中使用的DMEM購自Sigma。

1.1.3 毒株 O型口蹄疫毒株，懸浮細(xì)胞生產(chǎn)獲得，由合作客戶提供，種毒TCID50值為7.25 lgTCID50/0.1mL。

1.2 方法

1.2.1 BHK-21細(xì)胞在搖瓶體系中的培養(yǎng) 取復(fù)蘇后可穩(wěn)定傳代且活性大于95%的BHK-21細(xì)胞用于本研究。

取處于對數(shù)生長期、活性大于95%的足量細(xì)胞置于50 mL離心管，1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入30 mL實(shí)驗(yàn)組無血清培養(yǎng)基后重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至125 mL搖瓶內(nèi)。搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為130 r/min，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2、飽和濕度。

批培養(yǎng)時(shí)，每24 h取樣計(jì)數(shù)，樣品于10 000 r/min下離心5 min，保留上清凍存于-20℃，用于營養(yǎng)代謝物的分析。

傳代培養(yǎng)或擴(kuò)培時(shí)，每48 h將細(xì)胞液用新鮮的無血清培養(yǎng)基稀釋至活細(xì)胞密度為1×106cells/mL，培養(yǎng)體積根據(jù)傳代或擴(kuò)培的需要進(jìn)行調(diào)整。

1.2.2 葡萄糖濃度的優(yōu)化 依據(jù)BHK-21細(xì)胞在P-SFM中的生長和代謝情況，以指數(shù)期葡萄糖的比消耗速率（1.07 mmol/109cells·day）和預(yù)期達(dá)到的最高活細(xì)胞密度（2×107cells/mL）進(jìn)行計(jì)算，葡萄糖需增加的濃度約為8 mmol/L（公式1）。為避免乳酸過量累積，本節(jié)設(shè)計(jì)在初始濃度的基礎(chǔ)上分別增加5 mmol/L和10 mmol/L葡萄糖進(jìn)行考察。

1.2.3 氨基酸濃度的優(yōu)化 依據(jù)BHK-21細(xì)胞在P-SFM中的生長和代謝情況，對谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺3種氨基酸的濃度進(jìn)行優(yōu)化。假設(shè)活細(xì)胞密度和指數(shù)期（D0-D3期間）平均比消耗速率均保持不變，以第3天各氨基酸剩余濃度為初始濃度的30%、45%為準(zhǔn)，算得各氨基酸的推薦增加濃度（表1）。計(jì)算公式如下：

表1 氨基酸濃度優(yōu)化的理論添加量

依據(jù)表1推薦的濃度，該部分實(shí)驗(yàn)分別將3種氨基酸按照原濃度增加60%和30%作為兩個(gè)濃度水平，高濃度記為“+”，低濃度為“-”，設(shè)計(jì)如表2。

表2 氨基酸濃度優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4 銅鋅離子濃度的優(yōu)化 銅離子、鋅離子分別設(shè)計(jì)3個(gè)濃度水平進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3所示。

1.2.5 基于搖瓶培養(yǎng)體系的接毒操作 直接接毒：將BHK-21細(xì)胞以1×106cells/mL接種于搖瓶，待細(xì)胞擴(kuò)增至0.9 cells/mL-1.0×107cells/mL，以MOI=0.1接種口蹄疫病毒，細(xì)胞病變90%以上時(shí)收獲毒液。

表3 銅鋅離子濃度實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

接毒前流加補(bǔ)液：將BHK-21細(xì)胞以1 cells/mL×106cells/mL接種于搖瓶，待細(xì)胞擴(kuò)增至0.9 cells/mL-1.0×107cells/mL，流加20%濃縮培養(yǎng)基，并以MOI=0.1接種口蹄疫病毒，細(xì)胞病變90%以上時(shí)收獲毒液。

接毒前離心換液：將BHK-21細(xì)胞以1 cells/mL×106cells/mL接種于搖瓶，待細(xì)胞擴(kuò)增至0.9 cells/mL-1.0×107cells/mL，離心去上清，使用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并以MOI=0.1接種口蹄疫病毒，細(xì)胞病變90%以上時(shí)收獲毒液。

1.2.6 接毒時(shí)設(shè)定不同的活細(xì)胞密度 將BHK-21細(xì)胞以1×106cells/mL接種于搖瓶，48 h后取樣計(jì)數(shù)，離心更換新鮮培養(yǎng)基，調(diào)整活細(xì)胞密度分別為3×106cells/mL、6×106cells/mL和9×106cells/mL，以MOI=0.1接種口蹄疫病毒，細(xì)胞病變90%以上時(shí)收獲毒液。

1.2.7 BHK-21細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng) 將BHK-21細(xì)胞以1×106cells/mL的活細(xì)胞密度接種于確認(rèn)無菌的2 L生物反應(yīng)器，培養(yǎng)體積1 L，每24 h取樣計(jì)數(shù)。生物反應(yīng)器的操作參數(shù)設(shè)置為：溫度37℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，pH控制在7.2-7.4，溶氧設(shè)定為40%，表層通氣控制在（50-100）mL/min，堿液使用1 mol/L的Na2CO3溶液。

1.2.8 基于生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系的接毒操作 按照方法1.2.7在2 L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，48 h后4℃低溫沉降換液，換液量約80%，按照MOI =0.1接種口蹄疫病毒，調(diào)節(jié)pH為7.2-7.4，接毒6 h后每2 h取樣計(jì)數(shù)，待細(xì)胞病變90%以上，收集病毒液于樣品瓶中，-80℃保存。留樣用于測定TCID50和146s含量。

1.2.9 細(xì)胞計(jì)數(shù) 使用自動(dòng)計(jì)數(shù)儀（IC1000，Countstar）進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并在計(jì)數(shù)前添加臺(tái)盼藍(lán)染液識(shí)別體系中的死細(xì)胞。

1.2.10 代謝物濃度檢測 葡萄糖、乳酸和氨的濃度使用生化分析儀（BP400，Nova）進(jìn)行檢測；氨基酸濃度使用HPLC（1260，Agilent）基于OPA+FMOC在線衍生的方法進(jìn)行檢測。

1.2.11 TCID50的測定 病毒感染半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物的稀釋倍數(shù)常用TCID50進(jìn)行表示，是病毒感染能力的重要指標(biāo)。檢測方法參考文獻(xiàn)方法［20-21］。簡言之，將不同稀釋倍數(shù)的病毒液加入貼壁培養(yǎng)的單層BHK-21細(xì)胞，觀察細(xì)胞的病變情況，并以下式計(jì)算TCID50：

其中，L為孔板中病變率在50%以上的最高稀釋度對數(shù)；D為孔板中病變率在50%以上的最高稀釋度對數(shù)與病變率低于50%的最低稀釋度對數(shù)之間的差值；S為孔板中病變率的總和。

1.2.12 146s含量的測定 口蹄疫病毒完整粒子146s采用密度梯度離心法進(jìn)行檢測，參考文獻(xiàn)方法［23］。

1.2.13 數(shù)據(jù)處理

（1）比生長速率

μ：比生長速率（day-1）；X2、X1：兩個(gè)采樣點(diǎn)的活細(xì)胞密度（cells/mL）；?t：兩個(gè)采樣點(diǎn)的間隔時(shí)間（day）。

（2）活細(xì)胞密度對時(shí)間積分

IVCC：活細(xì)胞密度對時(shí)間的積分（109cells·day/L）。

（3）比生成/比消耗速率

Qp：兩個(gè)采樣點(diǎn)之間葡萄糖的比消耗速率或乳 酸/氨/氨 基 酸 的 比 生 成 速 率（mmol/（109cells·day））；?p：兩個(gè)采樣點(diǎn)之間單位體積培養(yǎng)物中該物質(zhì)的消耗量或生成量（mmol/L）。

（4）細(xì)胞病變率

CPE：BHK-21細(xì)胞被口蹄疫病毒感染后的病變率（Cytopathic effect，%）；Xt：t時(shí)刻培養(yǎng)體系中的活細(xì)胞密度（cells/mL）；Xm：細(xì)胞從接種口蹄疫病毒到病變完成過程中的最大活細(xì)胞密度（cells/mL）。

（5）單細(xì)胞產(chǎn)毒能力

Svy：單位細(xì)胞產(chǎn)毒量（Cell-specific virus yield，virions/cell）；146s：口蹄疫病毒完整粒子量（10-6g/mL）；Mv：常數(shù)，單個(gè)完整病毒粒子的質(zhì)量，1.146×10-17g/virion；Xm：細(xì)胞從接種口蹄疫病毒到病變完成過程中的最大活細(xì)胞密度（cells/mL）。

（6）數(shù)理統(tǒng)計(jì) 文章中的數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行標(biāo)示，組間數(shù)據(jù)對比采用學(xué)生T檢驗(yàn)法，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 BHK-21細(xì)胞在P-SFM中的生長和代謝

BHK-21細(xì)胞在P-SFM中進(jìn)行批培養(yǎng)的生長和關(guān)鍵代謝情況如圖1所示。0-2 d是明顯的指數(shù)生長期，平均比生長速率0.96/day，第2-3天比生長速率下降為0.39/day，第3天最高活細(xì)胞密度達(dá)到13.7×106cells/mL并開始下降。培養(yǎng)至第3天時(shí)，葡萄糖的濃度為初始濃度的30%左右，不構(gòu)成營養(yǎng)限制，而谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺3種氨基酸的濃度不足初始濃度的15%（圖1-B），有可能是細(xì)胞生長的限制因素。

如圖1-A所示，0-3 d內(nèi)，乳酸和氨處在持續(xù)積累的狀態(tài)，乳酸最高濃度為26.6 mmol/L，氨為5.02 mmol/L，均已達(dá)到抑制細(xì)胞生長和影響病毒表達(dá)的水平［17，24-25］。有研究結(jié)果表明，不適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)成分補(bǔ)充［26-27］（如葡萄糖、谷氨酰胺）和一些微量元素（如銅離子［28-29］和鋅離子［30］）會(huì)影響細(xì)胞的代謝和產(chǎn)毒過程。因此，針對此款無血清培養(yǎng)基，本研究從葡萄糖、氨基酸（谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺）、微量元素（銅離子、鋅離子）3個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 BHK-21細(xì)胞在P-SFM批培養(yǎng)過程中的生長和代謝情況

2.2 無血清培養(yǎng)基的優(yōu)化

如圖2-A，葡萄糖濃度提高5 mmol/L和10 mmol/L都對細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用，兩者之間無顯著性差異，但乳酸的積累也隨葡萄糖濃度的增高而增高。因此，優(yōu)化后的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的增加量定為5 mmol/L。

氨基酸濃度優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)中，以指數(shù)期的細(xì)胞比生長速率和葡萄糖濃度為指標(biāo)時(shí)，天冬氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的濃度在較高濃度添加時(shí)都顯示了微弱但不顯著的優(yōu)勢。但是乳酸的累積和谷氨酰胺的增加呈正相關(guān)，且具有顯著性差異（圖2-B）。因此，優(yōu)化后的培養(yǎng)基中天冬氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的濃度分別以“+”、“+”、“-”的水平添加。

銅鋅離子濃度優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖、谷氨酰胺的消耗、乳酸、氨的累積均沒有顯著性差異，而以0-3 d細(xì)胞總IVCC作為指標(biāo)篩選出的最佳銅離子濃度為0.04 mmol/L，鋅離子濃度為0.2 mmol/L，且鋅離子濃度對細(xì)胞生長的影響更為顯著（圖2-C）。

調(diào)整以上成分的濃度后，新的無血清培養(yǎng)基被命名為Opt-SFM。

2.3 BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中的生長和代謝

搖瓶體系中，BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中0-3 d的細(xì)胞總IVCC顯著高于P-SFM組（圖3-A）；Opt-SFM支持細(xì)胞穩(wěn)定傳代，48 h內(nèi)的比生長速率為1.07-1.13/day（圖3-C），傳代過程中細(xì)胞活性始終高于98%；與P-SFM相比，Opt-SFM中的葡萄糖比消耗速率和乳酸比生成速率顯著降低（圖3-B）；在Opt-SFM中，細(xì)胞形態(tài)飽滿、尺寸均勻，且結(jié)團(tuán)情況極少（圖3-D）。

圖2 無血清培養(yǎng)基的優(yōu)化

反應(yīng)器體系內(nèi)，細(xì)胞的生長情況相比搖瓶體系有了更大的提升，如圖4-A所示，細(xì)胞在Opt-SFM中最高活細(xì)胞密度達(dá)到17×106-18×106cells/mL（最高紀(jì)錄為17.8×106cells/mL），與P-SFM相比提高約23.5%；前3 d的葡萄糖比消耗速率和乳酸、氨的比生成速率皆低于P-SFM（圖4-B）。

圖3 基于搖瓶體系，BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中的生長和代謝

圖4 基于反應(yīng)器體系，BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中的生長和代謝

2.4 口蹄疫病毒在Opt-SFM中的擴(kuò)增

2.4.1 搖瓶體系中口蹄疫病毒的擴(kuò)增情況 以低血清培養(yǎng)基LSM作為對照，在Opt-SFM中，以任何接毒條件獲得的病毒完整顆粒146s產(chǎn)量和單細(xì)胞產(chǎn)毒能力都高于對照組。如圖5所示，病毒產(chǎn)量隨接毒時(shí)細(xì)胞密度升高而升高，接毒細(xì)胞密度9×106cells/mL時(shí)，Opt-SFM中146s產(chǎn)量達(dá)到15.45 μg/mL。接毒操作方式上，最優(yōu)選擇是接毒前離心全量換液，流加補(bǔ)液其次，直接接毒所得病毒產(chǎn)量最低；在Opt-SFM中，接毒前離心換液的接毒操作最終得到了14.39 μg/mL的146s病毒產(chǎn)量，單細(xì)胞產(chǎn)毒能力達(dá)到13.95×104virions/mL。

圖5 細(xì)胞密度和接毒方式對病毒產(chǎn)量和單細(xì)胞產(chǎn)毒能力的影響

2.4.2 反應(yīng)器體系中口蹄疫病毒的擴(kuò)增情況 反應(yīng)器體系中，接毒前BHK-21細(xì)胞的密度達(dá)到10.1×106cells/mL，比生長速率為1.14/day，優(yōu)于搖瓶體系，說明細(xì)胞不但達(dá)到了非常高的密度，而且仍處在活躍的指數(shù)生長期內(nèi)。接毒0 h細(xì)胞形態(tài)飽滿、均勻分散（圖6-B）。接毒12 h后細(xì)胞病變率達(dá)到90%以上（圖6-A），計(jì)細(xì)胞數(shù)時(shí)視野中出現(xiàn)大量死細(xì)胞和細(xì)胞碎片（圖6-C）。

如圖7，在Opt-SFM中，細(xì)胞病變90%以上收毒后測得毒液的效價(jià)為7.25 lgTCID50/0.1mL，與LSM實(shí)驗(yàn)組水平相似，但是在Opt-SFM中獲得的146s含量為15.6 μg/mL，比LSM組提高了50.7%。

3 討論

圖6 BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中接種口蹄疫病毒細(xì)胞生長與病變情況

口蹄疫病毒屬于烈性侵染病毒，一般24 h內(nèi)使宿主細(xì)胞完全病變。作為病毒生產(chǎn)的“工廠”，接毒時(shí)BHK-21細(xì)胞的密度和狀態(tài)都與病毒的最終產(chǎn)量有重要的關(guān)系。Maranga等［31］利用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在無血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)豬細(xì)小病毒樣顆粒（VLPs）時(shí)發(fā)現(xiàn)，選擇合適的接毒時(shí)間，確保細(xì)胞處于指數(shù)生長期，比選擇細(xì)胞密度高但處于穩(wěn)定期的細(xì)胞更容易獲得較高的產(chǎn)量。本研究中BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中培養(yǎng)48 h時(shí)細(xì)胞密度雖已達(dá)到107cells/mL，但仍處于指數(shù)生長期，此時(shí)細(xì)胞狀態(tài)健康，細(xì)胞內(nèi)各種酶的活性高，細(xì)胞產(chǎn)毒能力高，是理想的接毒時(shí)間。

圖7 培養(yǎng)基優(yōu)化前后病毒效價(jià)TCID50和146s完整病毒顆粒的含量

破除“細(xì)胞密度效應(yīng)”的關(guān)鍵在于營養(yǎng)成分的供應(yīng)和有毒代謝副產(chǎn)物的消除［11-12］。Dill等［15］的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)體系中增加葡萄糖和谷氨酰胺的濃度時(shí)均不會(huì)影響病毒效價(jià)。然而，其文章中考察的葡萄糖濃度最低為22 mmol/L，僅支持最高3×106cells/mL的細(xì)胞密度，按照本文的結(jié)論，支持1.7×107cells/mL的BHK-21細(xì)胞密度僅需要45 mmol/L葡萄糖，因此，Dill等［15］的葡萄糖添加量已經(jīng)超過了細(xì)胞對葡萄糖消耗的需求，成為葡萄糖濃度持續(xù)增加無法引起產(chǎn)量進(jìn)一步提高，反而會(huì)導(dǎo)致乳酸大量積累的原因。進(jìn)一步證明了按照細(xì)胞的代謝規(guī)律和細(xì)胞需求進(jìn)行培養(yǎng)基設(shè)計(jì)和優(yōu)化的重要性。本研究對無血清培養(yǎng)基中葡萄糖、3種氨基酸和銅鋅離子濃度的設(shè)計(jì)均以營養(yǎng)成分的代謝規(guī)律為基礎(chǔ)，滿足細(xì)胞需求的同時(shí)，降低細(xì)胞的生長壓力，因此代謝副產(chǎn)物的積累情況不升反降。降低乳酸和氨本身對病毒生產(chǎn)過程影響的同時(shí)［16-17］，也降低了因乳酸積累可能引起的pH值降低和滲透壓升高等環(huán)境條件的改變對產(chǎn)毒過程的負(fù)面影響［18-19］。

提高接毒時(shí)細(xì)胞密度和改善培養(yǎng)環(huán)境的另一個(gè)重要意義在于優(yōu)化接毒操作。搖瓶體系篩選出的接毒前離心換液操作，在生物反應(yīng)器水平實(shí)施時(shí)，通常采用低溫沉降的方式，與多數(shù)企業(yè)現(xiàn)行的操作相同，目的是減小培養(yǎng)體系積累的代謝副產(chǎn)物或其他不利因素對產(chǎn)毒過程的干擾［21］。但是，低溫沉降耗時(shí)耗力，而且不可避免地會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)，進(jìn)而降低其產(chǎn)毒能力。作為可替代的接毒操作方式，接毒前流加補(bǔ)液一定程度上使細(xì)胞維持在穩(wěn)定狀態(tài)，而且減少了換液操作可能引入的染菌風(fēng)險(xiǎn)。本文中，BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中接毒前流加補(bǔ)液的操作所獲得的病毒產(chǎn)量高于在LSM中實(shí)施換液后接毒，這一結(jié)果為改良接毒工藝提供了可能性。

采用不含血清和蛋白、化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基進(jìn)行BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和口蹄疫病毒疫苗生產(chǎn)，能夠在提高產(chǎn)能效率的同時(shí)降低血清等動(dòng)物源性添加物的安全風(fēng)險(xiǎn)，并減少生產(chǎn)過程中雜蛋白對病毒疫苗純化制劑的壓力［32］。因此，使用無血清懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)病毒疫苗是生物制品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢，本研究的成果對于無血清培養(yǎng)基的工業(yè)化應(yīng)用具有極強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié)論

本研究開發(fā)的無血清培養(yǎng)基能夠支持BHK-21懸浮細(xì)胞高密度培養(yǎng)和穩(wěn)定傳代，最高活細(xì)胞密度可達(dá)1.78×107cells/mL，培養(yǎng)過程中，乳酸和氨等代謝副產(chǎn)物都維持在較低水平。以1×106cells/mL的接種密度，長至48 h時(shí)接毒，相同操作條件下，無血清培養(yǎng)基可獲得與低血清培養(yǎng)基相似的病毒效價(jià)（7.25 lgTCID50/0.1mL），而完整病毒粒子146s則達(dá)到了15.6 μg/mL，是低血清培養(yǎng)體系的1.5倍。無血清培養(yǎng)基具有完全替代低血清懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)口蹄疫病毒的潛能。