大豆疫病拮抗菌的篩選及促生抗病作用研究

張鴻雁 高擎 張琳?qǐng)@ 林國莉 李如蓮

（1. 嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湛江 524048；2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

大豆疫?。ù蠖挂呙垢。┦谴蠖股a(chǎn)中的一種毀滅性病害，全球范圍內(nèi)皆可發(fā)生［1］。病原菌大豆疫霉（Phytophthora sojae）在土壤和病殘?bào)w中越冬，在大豆整個(gè)生育期都可侵染，使得種子、根、莖腐爛，植株枯死，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。對(duì)大豆疫病的防治一般采用化學(xué)藥物處理或選育抗病品種等方法。其中化學(xué)藥物防治，如利用福美雙、多菌靈等拌種來起到殺菌作用，但疫霉菌對(duì)化學(xué)藥劑抗性較強(qiáng)，通過化學(xué)藥物很難徹底根治［3］，且有農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染和食品污染等弊端?？共∑贩N防治的問題是抗病品種較少和抗性容易被克服等［4］。因此，開發(fā)具有防病抗病，綠色無污染的生物防治方法是一種大豆疫病防控的良好途徑。

大豆疫病的生物防治研究主要是利用細(xì)菌［5］、放線菌［6］或霉菌［7］作為拮抗菌，其中以細(xì)菌為主［8］。鏈霉菌是土壤中一種含量較多的放線菌，能夠產(chǎn)生多種具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，具有促生抗病等多種作用［9-11］，在植物病害生物防治中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究從大豆根際土壤中分離出具有拮抗作用的鏈霉菌，對(duì)其中拮抗效果明顯的XS1-5菌株進(jìn)行抗病促生作用研究，并確定其分類地位，期望為大豆疫病的生物防治提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品：采集自黑龍江省綏化市安達(dá)大豆農(nóng)田土壤，經(jīng)緯度為N46°24'10.2"，E125°21'59.5"。土壤基本理化性質(zhì)為有機(jī)質(zhì)46.04 g/kg、速效氮226.3 mg/kg、速效磷9.35 mg/kg、速效鉀171.9 mg/kg，pH6.90。收集5-30 cm深度范圍內(nèi)土壤，多點(diǎn)取樣，混勻使用。

病原菌：大豆疫霉（P. sojae）由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院分離保藏。

1.2 方法

1.2.1 放線菌的分離、純化 采集健康大豆根際土壤，置于裝有少量石英砂和無菌水的三角瓶中，搖床振蕩30 min，經(jīng)系列稀釋，涂布于含50 mg/mL重鉻酸鉀的高氏一號(hào)培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)，觀察。選擇孢子量豐富的放線菌經(jīng)劃線純化，轉(zhuǎn)接于斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗放線菌篩選

1.2.2.1 放線菌與拮抗菌的皿內(nèi)拮抗作用 瓊脂塊法抑菌試驗(yàn)［12］。病原菌接種于PDA斜面試管，于25℃培養(yǎng)3-4 d，無菌水制成菌懸液。將菌懸液均勻涂布于PDA平板，用打孔器從培養(yǎng)7 d的待篩放線菌平皿中打取直徑為5 mm的放線菌瓊脂塊，正置于PDA平板上，28℃培養(yǎng)5-7 d，測定抑菌圈直徑（D）及抑菌圈透明度（T）。根據(jù)拮抗環(huán)寬度、透明度、放線菌產(chǎn)孢量，挑選出有應(yīng)用價(jià)值的拮抗菌用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2.2 放線菌無菌發(fā)酵濾液對(duì)病原菌菌絲作用 生長速率法抑菌試驗(yàn)［13］。將供試放線菌以一定比例接種到液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)9 d。發(fā)酵液4 000 r/min離心5 min后，用0.45 μm滅菌微孔濾膜過濾除菌，得無菌濾液。將濾液不同濃度與冷卻至40℃左右的PDA培養(yǎng)基按1∶4體積比混勻倒平板，以同比例加入無菌水的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。用5 mm打孔器打取病原菌菌餅，置于PDA平板中央，每處理3次重復(fù)，25℃培養(yǎng)7 d，定時(shí)測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.3 拮抗菌鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征 將菌株XS1-5接種在高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基上，利用插片法觀察氣生菌絲、基內(nèi)菌絲及孢子絲的形態(tài)特征。XS1-5菌落形態(tài)觀察采用蔗糖硝酸鹽瓊脂、葡糖天冬素瓊脂、淀粉瓊脂、甘油蘋果酸鈣瓊脂和營養(yǎng)瓊脂，觀察記錄氣生菌絲顏色、基內(nèi)菌絲顏色、可溶性色素顏色。對(duì)菌株進(jìn)行碳源利用、明膠液化、淀粉水解、纖維素降解、牛奶胨化、硫化氫產(chǎn)生、硝酸鹽還原、類黑素的產(chǎn)生試驗(yàn)等，測定其生理生化特征［14］。

1.2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株XS1-5全基因組DNA。細(xì)菌通用引物：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-AGGAGG TGATCCAGCCGCA-3'）對(duì)其16S rRNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 5.0 μL，dNTPs 4.0 μL，Primer A 1.0 μL，Primer B 1.0 μL，Taq酶0.25 μL，ddH2O 37.7 μL，提取的總DNA 1.0 μL，總體積為50 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，57℃退火55 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳后測序。將測得的16S rRNA序列經(jīng)過序列拼接后，利用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得最相近菌株的序列，用Clustalx1.8按照最大同源性的原則進(jìn)行排序，采用MEGA5軟件Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 盆栽試驗(yàn) 分別以XS1-5孢子濃度0.1×108CFU/g、1.0×108CFU/g和10.0×108CFU/g進(jìn)行大豆種子包衣處理。0.7%的羧甲基纖維素鈉作為粘附劑，以只加粘附劑不加孢子包衣為對(duì)照。

生物量測定：以直尺測量株高、根長，百分位電子天平稱量大豆地上鮮重、地下鮮重。

葉綠素含量參照白寶璋等［16］的方法，根系活力采用TTC法（紅四氮唑）［15］。

葉片和根系酶活力測定：參考王寶成等［14］方法。過氧化氫酶（CAT）活性測定采用紫外分光光度法，以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活性單位（U）；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）光化還原法，以抑制NBT光還原50%的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）；氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，以1 min內(nèi)OD470變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U）。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Duncan法進(jìn)行單因素多重比較（P<0.05），并用Excel 2016進(jìn)行圖表的制作，文中數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌篩選

2.1.1 放線菌與拮抗菌的皿內(nèi)拮抗作用 從大豆根際共分離放線菌163株。163株放線菌經(jīng)與病原菌大豆疫霉瓊脂塊皿內(nèi)拮抗實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，獲得拮抗效果較明顯的菌株7株。7株菌的抑菌圈結(jié)果見表1。由表1可知，7株拮抗放線菌抑菌圈透明，孢子較豐富。其中抑菌圈超過15 mm的菌株3株，分別為XS1-5、GF1和X9，抑菌圈直徑分別為20.5 mm、15.2 mm和15.7 mm，顯著高于其他菌（P<0.05）。選擇3株菌做生長速率試驗(yàn)。

表1 拮抗放線菌對(duì)大豆疫霉的皿內(nèi)拮抗作用

2.1.2 放線菌無菌發(fā)酵濾液對(duì)病原菌菌絲的作用 皿內(nèi)拮抗作用選得3株拮抗菌，其無菌發(fā)酵濾液對(duì)病原菌大豆疫霉的抑菌作用結(jié)果見表2。由表2可知，3株拮抗菌不同濃度無菌發(fā)酵濾液對(duì)病原菌大豆疫霉都有不同程度的抑制作用，抑菌率為12.4%-90.9%。且表現(xiàn)為隨著時(shí)間的延長，濾液的抑菌率先逐漸升高后有所下降。同時(shí)，由表2還可以看出，3株菌濾液經(jīng)稀釋后其抑菌效果皆不如原液，差異顯著（P<0.05）。XS1-5原液的抑菌率可達(dá)90%以上，高于GF1和X9，差異顯著（P<0.05）。選擇XS1-5做后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 拮抗菌鑒定

菌株XS1-5的培養(yǎng)特征、碳源利用及生理生化特征見表3、表4和表5。在不同供試培養(yǎng)基上XS1-5的氣生菌絲白色或無氣生菌絲，基內(nèi)菌絲無色到紅色，無可溶性色素（表3）。光學(xué)顯微鏡下（10×40）可見孢子絲直，偶有螺旋。XS1-5可以利用蔗糖、葡萄糖、鼠李糖、果糖和肌醇，不能利用棉子糖、乳糖、木糖和阿拉伯糖（表4），明膠液化、淀粉水解、硝酸鹽還原陽性，不降解纖維素，不能進(jìn)行牛奶胨化、不產(chǎn)硫化氫和類黑色素（表5）。

表2 拮抗放線菌無菌發(fā)酵濾液對(duì)大豆疫霉的抑菌率

表3 拮抗菌XS1-5在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

表4 拮抗菌XS1-5的碳源利用

表5 拮抗菌XS1-5的生理生化特征

圖1 菌株XS1-5的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)菌株XS1-5的16S rRNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大約1 300 bp片段。經(jīng)與GenBank中相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST相似性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，建樹結(jié)果見圖1。由圖1可知，與菌株XS1-5 16SrRNA同源性較高的均為鏈霉菌屬（Streptomycessp.）。其中與白孢鏈霉菌（Streptomyces albosporeus）的序列相似性高達(dá)100%。結(jié)合形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)與分子生物學(xué)分析，XS1-5鑒定為白孢鏈霉菌（S.albosporeus）。綠素c分別增加50.6%、12.22%、15.81%和7.93%（P<0.05）。對(duì)于葉綠素a、總?cè)~綠素和葉綠素c，10.0×108CFU/g孢子濃度含量與1.0×108CFU/g作用效果相當(dāng)。由表7還可看出，3種濃度的拮抗菌XS1-5包衣對(duì)根系活力的促進(jìn)作用為1.0×108CFU/g最強(qiáng)，為685.41 μg/g.h，比對(duì)照增加了138.38%，是對(duì)照的約2.4倍（P<0.05）。其他兩種濃度對(duì)大豆根系活力的促進(jìn)作用與對(duì)照相比差異亦顯著，分別比對(duì)照增加了80.79%（10.0×108CFU/g）和74.96%（0.1×108CFU/g）。

2.3.3 拮抗菌XS1-5對(duì)大豆保護(hù)性酶活力的影響 拮抗菌XS1-5對(duì)大豆葉片和根系保護(hù)性酶CAT、SOD和POD活力的影響結(jié)果見表8。由表8可知，拮抗菌XS1-5處理種子使葉片和根系3種保護(hù)性酶活力皆有所增加。與對(duì)照相比，1.0×108CFU/g處理使葉片保護(hù)性酶CAT、SOD和POD活力分別增加158.86%、459.71%和135.45%，差異顯著（P<0.05），0.1×108CFU/g包衣后葉片SOD增加315.69%，是對(duì)照的近6倍。1.0×108CFU/g處理使根系CAT、SOD和POD活力分別比對(duì)照增加109.33%、146.03%和27.60%（P<0.05）。

表6 拮抗菌XS1-5對(duì)大豆生長的影響

3 討論

大豆疫病是一種土傳病害，由大豆疫霉菌侵染導(dǎo)致。該菌擴(kuò)展迅速、危害嚴(yán)重，對(duì)大豆產(chǎn)量影響較大，現(xiàn)世界大部分大豆產(chǎn)區(qū)均有大豆疫病發(fā)生的報(bào)道［17］。

生物防治植物土傳病害因其綠色、安全、無污染等特點(diǎn)，是較有潛力的防治方法。目前對(duì)大豆疫病的生物防治應(yīng)用研究非常廣泛。楊光紅等［18］從大豆根圍土樣中篩選得到對(duì)大豆疫霉有較好拮抗作用的生防細(xì)菌菌株BY-2，經(jīng)平板測定，生防菌株BY-2的防效最好，盆栽灌根大豆幼苗的鮮重、干重、根長和莖長顯著增加，表明生防菌株BY-2能促進(jìn)大豆植株的生長。王愷等［19］分離到一株對(duì)大豆疫霉具有較強(qiáng)抑制作用的放線菌1-17，平板對(duì)峙抑菌直徑在17.81 mm以上，為鏈霉菌屬S. humidussp.。本研究篩選到一株對(duì)大豆疫霉具有明顯拮抗活性的鏈霉菌XS1-5，并結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rRNA序列測定將其鑒定為白孢鏈霉菌。目前國內(nèi)外關(guān)于白孢鏈霉菌的研究有產(chǎn)生可以殺原核微生物的抗生素［20］和幾丁質(zhì)［21］的報(bào)道，但未見其對(duì)真核微生物的作用及在農(nóng)業(yè)植物病害防治應(yīng)用的相關(guān)試驗(yàn)報(bào)道。本研究表明鏈霉菌XS1-5及其發(fā)酵液能抑制大豆疫霉病原菌生長，抑菌圈直徑達(dá)20.5 mm，抑菌率達(dá)90.9%，盆栽試驗(yàn)表明其促進(jìn)大豆生長、提高葉片葉綠素含量和根系活力，具有明顯的促生抗病作用。

表7 拮抗菌XS1-5對(duì)大豆葉綠素和根系活力的影響

表8 拮抗菌XS1-5對(duì)大豆根系和葉片酶活性的影響

另外，本研究篩選到的白孢鏈霉菌XS1-5還可以提高大豆的保護(hù)性酶活性。植物受到病原物侵染而發(fā)生主動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)時(shí)，體內(nèi)一系列保護(hù)性酶發(fā)生了廣泛的病理變化，提高植物的抗病性。Patel等［22］研究表明，番茄根際獲得細(xì)菌Providencia rettgeriMSS2盆栽試驗(yàn)使得番茄多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等保護(hù)性酶活性增強(qiáng)。朱學(xué)明等［23］采用噴霧接種方法，發(fā)現(xiàn)放線菌A-1顯著提高了葉片中保護(hù)性酶CAT、SOD、POD、PPO和PAL的活性，提高寄主對(duì)炭疽葉枯病的抗性。臺(tái)蓮梅等［7］發(fā)現(xiàn)木霉菌株T115D誘導(dǎo)大豆葉片CAT、SOD、POD、PPO和PAL的活性增強(qiáng)。目前對(duì)根系保護(hù)性酶活性研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)白孢鏈霉菌XS1-5孢子對(duì)大豆種子包衣可以顯著提高葉片和根系CAT、SOD和POD的活性，對(duì)大豆防御外來病原菌的感染有重要作用，抗病促生機(jī)理及次及代謝產(chǎn)物中抗菌物質(zhì)待后續(xù)研究。

4 結(jié)論

本研究利用瓊脂塊法和生長速率法篩選到大豆疫霉拮抗菌XS1-5，經(jīng)形態(tài)、理化指標(biāo)和分子生物學(xué)指標(biāo)鑒定為白孢鏈霉菌，并進(jìn)行了大豆盆栽試驗(yàn)，測定大豆生長情況、葉綠素含量、根系活力和保護(hù)性酶活性等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)拮抗菌XS1-5具有促生抗病作用，推斷XS1-5在大豆疫病的生物防治上有較好的應(yīng)用價(jià)值。