LncRNA MCM3AP-AS1靶向調(diào)控miR-16-5p表達對肺癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響及機制

趙天增 黃國勝 楊金華 徐萌博 郭彥偉

(1南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院普胸外科，河南 南陽 473000；2鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

肺癌是世界上最常見的癌癥，也是癌癥死亡的主要原因〔1〕，肺癌的轉(zhuǎn)移性給疾病的治療帶來很大的困難，分子靶向治療和精準(zhǔn)治療已是肺癌治療的主要趨勢〔2〕。研究肺癌的分子機制，為其治療提供更有效的分子靶點是肺癌研究的熱點。LncRNA和miRNA在肺癌組織和細(xì)胞系中異常表達，研究表明LncRNA與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，miRNA與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、診斷、預(yù)后及耐藥性等有關(guān)〔3,4〕。有報道顯示，LncRNA MCM3AP-AS1在膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細(xì)胞〔5〕和肝細(xì)胞癌〔6〕中表達上調(diào)，干擾或沉默其表達可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲，抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、克隆形成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在乳頭狀甲狀腺癌中，MCM3AP-AS1表達上調(diào)并促進癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔7〕。miR-16在肺腺癌細(xì)胞中低表達，抑制肺腺癌細(xì)胞增殖并促進細(xì)胞早期凋亡〔8〕。但MCM3AP-AS1在肺癌細(xì)胞中的表達及其對肺癌的影響，且其與miR-16-5p在肺癌中的關(guān)系目前還尚不清楚。本研究探討LncRNA MCM3AP-AS1對肺癌增殖、遷移和侵襲的影響及miR-16-5p在此影響中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌細(xì)胞株A549、SPC-A1和NCI-H460及人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B購自ATCC；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司；Transwell板購自美國Corning公司；引物、MCM3AP-AS1抑制物(si-MCM3AP-AS1)和過表達載體(pcDNA-MCM3AP-AS1)、miR-16-5p模擬物(miR-16-5p)和抑制物(anti-miR-16-5p)、空載體pcDNA和相應(yīng)陰性對照、雙熒光素酶載體購自上海吉瑪制藥有限公司；兔源CyclinD1、p21、p27、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、GAPDH抗體均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔源MMP-9、MMP-14抗體購自英國Abcam公司；實時熒光定量(qRT)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒、購自美國Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將肺癌細(xì)胞SPC-A1、A549和NCI-H460培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中，人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)液中，兩種培養(yǎng)液中均添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，培養(yǎng)條件：飽和濕度，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代保存。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期A549細(xì)胞稀釋為1×106個/ml接種6孔板培養(yǎng)，融合度達到90%時根據(jù)轉(zhuǎn)染說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染，用無血清OptiMEM培養(yǎng)液分別稀釋Lipofectamine2000或不同載體(片段)，將二者輕柔混勻，室溫下孵育20 min后加入培養(yǎng)好的細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h后換成RPMI1640完全培養(yǎng)基，收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，檢測轉(zhuǎn)染效果，進行后續(xù)實驗。根據(jù)轉(zhuǎn)染載體(片段)不同實驗分組如下：si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-MCM3AP-AS1組(轉(zhuǎn)染si-MCM3AP-AS1)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-16-5p組(轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimics)、si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組(共轉(zhuǎn)染si-MCM3AP-AS1與anti-miR-NC)、si-MCM3AP-AS1+anti-miR-16-5p組(共轉(zhuǎn)染si-MCM3AP-AS1與anti-miR-16-5p)。

1.2.3qRT-PCR檢測RNA的表達 TRIzol試劑提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成cDNA，置于于-80℃冰箱保存。按照說明書以取cDNA為模板進行反應(yīng)，合成MCM3AP-AS1和miR-16-5p，運用2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4MTT實驗測定細(xì)胞活性 收集轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞，消化細(xì)胞，離心后用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，稀釋濃度為1×104個/ml，200 μl/孔接種于96孔板，在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時按照20 μl/孔加入MTT(5 mg/ml)試劑。孵育4 h后棄上清培養(yǎng)基，按照150 μl/孔加入DMSO，震蕩10 min結(jié)晶溶解后酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度(A)值。

1.2.5Western印跡實驗 室溫下用RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞20 min，超聲破碎細(xì)胞，獲得蛋白并檢測濃度。進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉膜2 h，加入CyclinD1抗體(1∶1 500)、p21抗體(1∶800)、p27抗體(1∶1 500)、MMP-2抗體(1∶1 000)、MMP-9抗體(1∶1 000)、MMP-14抗體(1∶3 000)和抗GAPDH抗體(1∶1 200)一抗，4℃過夜，洗膜3次，然后加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h，顯影。以GAPDH為內(nèi)參照分析蛋白水平。

1.2.6Transwell實驗測定細(xì)胞遷移和侵襲 遷移實驗：用無血清RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/ml。Transwell下層培養(yǎng)孔加入500 μl含10%胎牛血清培養(yǎng)基作為遷移趨化物，Transwell上層小室加入100 μl細(xì)胞懸液，將上層小室置于24孔板中，培養(yǎng)24～48 h，棄去上層小室中的培養(yǎng)液，用棉簽拭去上層小室膜表面細(xì)胞，甲醛固定下室膜表面細(xì)胞后結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察計數(shù)。

侵襲實驗：采用包被Matrigel基質(zhì)膠的小室，使用前加入無血清培養(yǎng)液孵育2 h水化后備用。其余步驟同遷移實驗。

1.2.7雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗 按照1.2.2的要求進行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為90%時，進行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的MCM3AP-AS1野生型(WT-MCM3AP-AS1)和突變型(MUT-MCM3AP-AS1)雙熒光素酶報告載體分別與miR-NC或miR-16-5p共轉(zhuǎn)染融合度為90%的A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，室溫RIPA緩沖液裂解20 min，離心收集裂解后的上清，加入熒光素酶底物，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，用發(fā)光儀檢測并計算相對螢火蟲熒光素酶活性。同時將pcDNA、pcDNA-MCM3AP-AS1、si-NC、si-MCM3AP-AS1分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，依次記為pcDNA組、pcDNA-MCM3AP-AS1組、si-NC組、si-MCM3AP-AS1組。qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞中miR-16-5p表達水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1肺癌細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞中LncRNA MCM3AP-AS1和miR-16-5p的表達情況 與BEAS-2B組相比，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、SPC-A1和NCI-H460中MCM3AP-AS1表達量均顯著升高(P<0.05)，miR-16-5p表達量顯著下降(P<0.05)，見表1。兩者在3種肺癌細(xì)胞系中的表達趨勢一致，選擇表達差異相對較大的A549細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

表1 LncRNA MCM3AP-AS1和miR-16-5p在肺癌細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞中的表達

2.2抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 si-MCM3AP-AS1組A549細(xì)胞中MCM3AP-AS1表達量、細(xì)胞活性(48 h、72 h)、增殖蛋白CyclinD1表達顯著低于si-NC組(P<0.05)，增殖負(fù)調(diào)節(jié)蛋白p21和p27表達顯著高于si-NC組(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達的影響

表2 抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

2.3抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與si-NC組相比，si-MCM3AP-AS1組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降(P<0.05)，遷移和侵襲蛋白MMP-2、MMP-9和MMP-14均顯著降低(P<0.05)，見圖2，圖3,表3。

圖2 抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲蛋白表達的影響

圖3 抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表3 抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響

2.4過表達miR-16-5p對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 miR-16-5p組的miR-16-5p表達量顯著高于與miR-NC組(P<0.05)，A549細(xì)胞活性(48 h、72 h)、增殖相關(guān)蛋白CyclinD1表達、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)、侵襲蛋白MMP-2和MMP-9表達均顯著低于miR-NC組(P<0.05)，p21表達表達高于miR-NC組(P<0.05)，見表4，圖4。

2.5MCM3AP-AS1靶向調(diào)控miR-16-5p的表達 MCM3AP-AS1與miR-16-5p之間存在互補的核苷酸序列，見圖5。與轉(zhuǎn)染miR-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimics顯著降低WT-MCM3AP-AS1相對熒光素酶活性(P<0.05)；與轉(zhuǎn)染miR-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimics對MUT-MCM3AP-AS1相對熒光素酶活性無顯著影響。見表5。與pcDNA組miR-16-5p表達量(1.02±0.09)相比，pcDNA-MCM3AP-AS1組(0.37±0.04)顯著下降(P<0.05)；與si-NC組miR-16-5p表達量(0.98±0.08)相比，si-MCM3AP-AS1組(2.75±0.28)顯著上升(P<0.05)，說明MCM3AP-AS1靶向負(fù)向調(diào)控miR-16-5p的表達。

表4 miR-16-5p過表達對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

圖4 miR-16-5p過表達對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白的影響

圖5 MCM3AP-AS1與miR-16-5p靶向結(jié)合

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6抑制miR-16-5p表達減弱MCM3AP-AS1抑制對A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 si-MCM3AP-AS1組miR-16-5p表達量顯著高于si-NC組(P<0.05)，細(xì)胞活性(48 h和72 h時)、增殖相關(guān)蛋白CyclinD1表達、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、侵襲蛋白MMP-2和MMP-9表達均顯著低于si-NC組(P<0.05)，p21蛋白表達高于si-NC組(P<0.05)；與si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組相比，si-MCM3AP-AS1+anti-miR-16-5p組miR-16-5p表達量顯著低于si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組(P<0.05)，細(xì)胞活性(48 h和72 h時)、增殖相關(guān)蛋白CyclinD1表達、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、侵襲蛋白MMP-2和MMP-9表達均顯著高于si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組(P<0.05)p21蛋白表達高于si-MCM3AP-AS1+ anti-miR-NC組(P<0.05)。見圖6，表7。

1～4：si-NC組、si-MCM3AP-AS1組、si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組、si-MCM3AP-AS1+anti-miR-16-5p組

表7 抑制miR-16-5p表達逆轉(zhuǎn)了下調(diào)MCM3AP-AS1表達對A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用

3 討 論

吸煙是肺癌的主要原因，預(yù)計2035年全球約有300萬人因肺癌死亡〔9〕，而肺癌患者確診時多為晚期，患者預(yù)后和生存質(zhì)量較差。2014年，英國國家統(tǒng)計局報告稱，診斷為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性肺癌(Ⅳ期)的患者1年生存率僅為15%～19%〔10〕。因此研究肺癌的早期分子診斷和晚期治療靶點也是肺癌臨床所急需的。

LncRNA和miRNA調(diào)控肺癌的發(fā)生和發(fā)展，對肺癌的臨床診斷、治療和預(yù)后起重要作用〔11,12〕。研究表明，LncRNA MCM3AP-AS1在乳腺癌中表達上調(diào)，受雌激素正向調(diào)控，并與患者的無復(fù)發(fā)生存率較差有關(guān)〔13〕。MCM3AP-AS1在彌漫性膠質(zhì)瘤樣本中隨著腫瘤分級的升高表達下調(diào)，與患者預(yù)后及惡性進展有顯著相關(guān)性〔14〕。Zhu等〔15〕在對肺腺癌的LncRNA生物標(biāo)志物的研究中發(fā)現(xiàn)MCM3AP-AS1在肺腺癌中與LINC00649存在競爭關(guān)系，具體的作用機制未有闡述。本研究結(jié)果說明MCM3AP-AS1在肺癌發(fā)展中具有重要作用。MCM3AP-AS1與miR-16-5p之間存在互補的核苷酸序列，提示miR-16-5p可能參與MCM3AP-AS1對肺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移的調(diào)控過程。已有研究顯示脊索瘤〔16〕和乳腺癌〔17〕中miR-16-5p表達下調(diào)，過表達miR-16-5p顯著抑制脊索瘤和乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。Fan等〔18〕也發(fā)現(xiàn)miR-16-5p非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者血清中表達顯著下調(diào)，其與miR-15b-5p和miR-20a-5p聯(lián)合可能是NSCLC的診斷標(biāo)志物。Liu等〔19〕最新結(jié)果表明，miR-16-5p在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞損傷中表達下調(diào)，其通過靶向CXCR3抑制LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果Fan等〔18〕研究結(jié)果一致，過表達miR-16-5p可抑制A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，證實了miR-16-5p在肺癌發(fā)展中的重要作用。

本研究顯示，miR-16-5p是MCM3AP-AS1的靶基因，過表達或抑制MCM3AP-AS1分別下調(diào)或上調(diào)miR-16-5p表達水平，抑制miR-16-5p顯著減弱下調(diào)MCM3AP-AS1對A549細(xì)胞的抗增殖和抗遷移和侵襲作用，這進一步證實了在肺癌中兩者存在調(diào)控關(guān)系。