虎掌南星HPLC 指紋圖譜建立

陸 丹 池玉梅 高秋芳 趙懿清 吳 皓

［1.江南大學附屬醫(yī)院）三院院區(qū)）， 江蘇 無錫214000； 2.南京中醫(yī)藥大學， 江蘇 南京210046］

虎掌南星又名掌葉半夏，為天南星科半夏屬植物掌葉半夏Pinellia pedatisectaSchott 的干燥塊莖［1］，具有祛風定驚、降逆止嘔、燥濕化痰、消痞散結(jié)的功效［2］，目前尚未被《中國藥典》 收載，臨床上個大者常代用天南星，個小者常代用半夏，應(yīng)用較為混亂［3］。迄今，有關(guān)天南星科植物的研究大多圍繞毒性及炮制機制開展［4?8］，鮮有報道虎掌南星質(zhì)量標準，其物質(zhì)基礎(chǔ)也不明晰。因此，本實驗利用HPLC 法研究虎掌南星指紋圖譜，以期為該藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

Waters Alliance 2695 HPLC，配置Waters 2996 PDA 檢測器、Waters Empower Pro 色譜工作站（美國Waters 公司）；KQ?500 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純（德國Merck 公司）；水為超純水（由德國Millipore 純水器制得）；其他試劑均為分析純。對照品腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、鳥苷（純度均大于99.5%，美國Sigma 公司）；夏佛托苷（自制，純度98.89%）。虎掌南星、天南星、半夏經(jīng)南京中醫(yī)藥大學談獻和教授鑒定為正品，具體信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 參考文獻［9?13］，藥材粉末過60目篩后精密稱定0.6 g，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，密塞并稱定質(zhì)量，超聲（40 kHz、250 W）處理45 min，取出放冷，用60% 乙醇補足質(zhì)量，搖勻，濾過，精密移取續(xù)濾液25 mL，蒸干，用2 mL 水復(fù)溶，離心并取上清液，即得。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取核苷類成分及夏佛托苷對照品適量，制成0.1 mg／mL 貯備液，精密移取適量，置10 mL量瓶中，加水定容，即得。

2.3 色譜條件 參考文獻［10?13］。Lichrospher C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?水（B）（含0.1% 醋 酸），梯度洗脫，程序見 表2；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長270 nm；進樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取樣品S5，按“2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項條件下連續(xù)進樣6 次，以尿苷峰為參照峰，測得15 個共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD 分別小于1%、3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取樣品S5，按“2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項條件下每間隔3 h 進樣5 次，共12 h，以尿苷峰為參照峰，測得15 個共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD 分別小于1%、3%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取樣品S5，按“2.1” 項下方法制備供試品溶液6 份，在“2.3” 項條件下進樣分析，以尿苷峰為參照峰，測得15 個共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD 分別小于1%、3%，表明該法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 共有峰確定 參考文獻［11?23］，取樣品S1～S10，按“2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項條件下進樣，將HPLC 色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A 版）進行分析，生成對照指紋圖譜和指紋圖譜共有模式，共標定15 個共有峰，見圖1～2。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜

圖2 HPLC 指紋圖譜共有峰

取“2.2” 項下對照品溶液，在“2.3” 項條件下進樣，參照課題組前期LC?MS／MS 結(jié)果，同時比對保留時間與紫外數(shù)據(jù)，確定6 號峰為腺嘌呤，7 號峰為次黃嘌呤，9號峰為黃嘌呤，10 號峰為尿苷，11 號峰為鳥苷，15 號峰為夏佛托苷，保留時間分別為5.890、6.314、7.543、9.336、15.133、40.548 min。各樣品色譜圖中均存在10 號峰，其峰面積較大，峰位適中，峰形較佳，而且與相鄰峰分離度較好，故選取其作為參照峰（S），見圖2，再計算各樣品色譜峰的相對保留時間及相對峰面積，見表3。

表3 10 批樣品共有峰相對保留時間及相對峰面積

2.5.2 相似度分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A 版）對樣品S1～S10 的指紋圖譜進行分析，發(fā)現(xiàn)相似度均大于0.9，見表4。

表4 10 批樣品相似度

2.5.3 模式識別 將相對峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入MATLAB7.8，利用歐氏距離對各樣品進行聚類分析，結(jié)果見圖3，可知S5、S7，S3、S9，S1、S10 分別聚為一類，核對表1 顯示為同產(chǎn)地藥材。以各樣品相對峰面積為變量進行特征分析，得到前3 個主成分貢獻率分別為61.53%、26.28%、9.50%，累積貢獻率達97.31%，表明可以反映樣品大部分信息，分別對第一主成分與第二主成分、第一主成分與第三主成分作得分圖，結(jié)果顯示產(chǎn)地相同的樣品在主成分得分圖上比較接近，與聚類分析一致，見圖4～5。

圖3 10 批樣品聚類分析樹狀圖

圖4 第一主成分對第二主成分得分圖

圖5 第一主成分對第三主成分得分圖

2.6 指紋圖譜專屬性分析 參考文獻［24?26］，取樣品S11、S12，按 “2.1” 項下方 法制備 供試品溶液，在“2.3” 項條件下進樣，結(jié)果見圖6。參照課題組前期研究，將指紋圖譜劃歸為3 塊區(qū)域，Ⅰ區(qū)（0～16 min）含核苷類成分，虎杖南星、天南星、半夏中其組成類似，但含有量存在一定差異，虎掌南星在13 min 未檢測到色譜峰；Ⅱ區(qū)（16～25 min）半夏峰強度相對較強；Ⅲ區(qū)（25～75 min）含黃酮類成分，天南星在該區(qū)檢測到多種黃酮，半夏檢測到夏佛托苷與異夏佛托苷，虎掌南星僅檢測到夏佛托苷。

圖6 各藥材特征圖譜

3 討論

3.1 樣品前處理方法選擇 課題組前期UPLC?ESI?Q／TOF?MS 測試結(jié)果顯示虎掌南星中含有核苷及黃酮類成分夏佛托苷，為了同時兼顧兩者的提取，選擇60%乙醇作為提取溶劑。復(fù)溶溶劑比較了0.1%醋酸、水、60%乙醇、甲醇、乙醇，結(jié)果顯示0.1%醋酸、水作為復(fù)溶溶劑時，出峰較多，峰面積較大，由于酸水樣品穩(wěn)定性較差，容易導(dǎo)致樣品敗壞，最終選擇水作為復(fù)溶溶劑。

3.2 流動相選擇 比較甲醇?水、乙腈?水體系，結(jié)果顯示后者體系出峰較多且各色譜峰分離較好；加酸改善峰形，比較乙腈?甲酸、乙腈?醋酸體系，結(jié)果顯示，后者可使色譜峰達到基線分離；試驗了體系中含0.1%、0.5%、1%醋酸，考察酸用量，結(jié)果顯示無顯著差別，出于對色譜柱的保護，最終選擇乙腈?水體系（含0.1%醋酸）。

3.3 檢測波長選擇 利用PDA 進行全波長掃描，比較同一樣品不同波長下的色譜圖。結(jié)果顯示，在270 nm 處色譜圖出峰較多且基線穩(wěn)定，因此選擇270 nm 作為檢測波長。

3.4 色譜柱選擇 以乙腈?水（含0.1%醋酸）體系為流動相，探討ACE 5 AQ（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Platisil ODS（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Lichrospher C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Lichrospher C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）等色譜柱對樣品的分離效果。結(jié)果顯示，Lichrospher C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）作用最佳，各色譜峰分離度及峰形較好。

3.5 柱溫選擇 比較25、30、35 ℃下色譜圖的峰形及分離度。結(jié)果顯示，在25、35 ℃時色譜峰均存在一定程度的漂移，分離效果不佳；在30 ℃時，各色譜峰能較好地分離，并且峰形較佳。

3.6 色譜分析時間選擇 記錄樣品進樣后2 h 的色譜圖。結(jié)果顯示，各樣品在75 min 后未見色譜峰，表明可在這段時間內(nèi)出峰完全，故確定分析時間為75 min。

4 結(jié)論

本實驗建立HPLC 指紋圖譜分析虎掌南星所含中等、大極性成分（黃酮和核苷），10 批樣品中有15 個共有峰，并且相似度較高。通過與對照品比對色譜峰保留時間及紫外數(shù)據(jù)，歸屬了6 個指紋峰，利用基于聚類分析及主成分分析的模式識別法進行分析，發(fā)現(xiàn)相同產(chǎn)地的虎掌南星聚為一類，主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致；與同科植物天南星及半夏在相同色譜條件下進行指紋圖譜比對，發(fā)現(xiàn)三者能得到良好區(qū)分。綜上所述，該方法準確穩(wěn)定，重復(fù)性好，專屬性強，可用于虎掌南星的質(zhì)量控制。