基于血清藥物化學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究麝香通心滴丸治療冠心病的機(jī)制

王 偉 劉星雨 尚云龍 姚建標(biāo) 王建方 宋永標(biāo) 王如偉?

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 浙江 杭州310052； 2.浙江康恩貝制藥股份有限公司， 浙江 杭州310052；3.浙江省中藥制藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 杭州310052； 4.內(nèi)蒙古康恩貝藥業(yè)有限公司圣龍分公司，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯017400）

“血清藥物化學(xué)” 這一理論最先由德國(guó)科學(xué)家格哈德·多馬克所提出［1］，后來(lái)我國(guó)科學(xué)家王喜軍教授［2］提出符合中醫(yī)藥理論的中藥血清藥物化學(xué)。中藥成分較為復(fù)雜［3］，經(jīng)口服給藥后，普遍認(rèn)為發(fā)揮藥效的活性成分應(yīng)該是被吸收入血的成分［4］。通過(guò)分析口服給藥后血中成分，可確定中藥在體內(nèi)直接起作用藥效成分。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)［4?7］通過(guò)生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的連接和關(guān)系來(lái)分析藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)，從整體效應(yīng)角度預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)，是闡明中藥復(fù)方作用機(jī)制的重要手段之一。近年來(lái)文獻(xiàn)［8?12］報(bào)道的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究大多數(shù)是以各數(shù)據(jù)庫(kù)中成分的口服生物利用度為篩選指標(biāo)。然而多味中藥在組成復(fù)方后，其原本的一些成分在其它成分的協(xié)同作用下，會(huì)使其原本較低的生物利用度得到改善，并且更改相應(yīng)的藥物劑型也會(huì)提高其生物利用度［13?14］。因此對(duì)于多成分的中藥復(fù)方制劑，僅靠數(shù)據(jù)庫(kù)中的口服生物利用度為篩選指標(biāo)，會(huì)導(dǎo)致靶點(diǎn)預(yù)測(cè)不夠精確。麝香通心滴丸為內(nèi)蒙古康恩貝藥業(yè)有限公司圣龍分公司已上市產(chǎn)品，收載于2015 年版《中國(guó)藥典》 一部，于2017 年1 月13 日被列入國(guó)家中藥保護(hù)品種，全方包括麝香、蟾酥、人參莖葉總皂苷、丹參、人工牛黃、熊膽粉、冰片，該品種屬于心腦血管領(lǐng)域用藥［15?17］。雖然臨床上治療冠心病療效顯著，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確。本文通過(guò)HPLC?Q?TOF／MS 對(duì)麝香通心滴丸進(jìn)行血清藥物化學(xué)研究，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)入血成分治療冠心病的作用機(jī)制進(jìn)行研究，為深入闡明麝香通心滴丸作用機(jī)制提供一定的依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 1260 高效液相色譜儀、6530 Q?TOF／MS 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；高速冷凍離心機(jī)、渦旋振蕩器（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Sartorius BS210S十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 試劑與藥物 麝香通心滴丸（內(nèi)蒙古康恩貝有限公司圣龍分公 司，批 號(hào)180607）。蟾毒靈（批 號(hào)111981?201501，純度99.2%）、熊去氧膽酸（批號(hào)110755?201704，純度99.4%）、脂蟾毒配基（批號(hào)110718?201809，純度98%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；遠(yuǎn)華蟾毒精（批號(hào)PS010798，純度98%）、去乙酰華蟾毒精（批號(hào)PS010804，純度98%）購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司；沙蟾毒精（批號(hào)5283，純度98%）、甘氨膽酸（批號(hào)6723，純度98%）購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；牛磺膽酸（批號(hào)PST190801?061，純度98%）購(gòu)自成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司。乙腈（批號(hào)SHBK3440，色譜純）、甲醇（批號(hào)10958407824，色譜純）購(gòu)自默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.3 動(dòng)物 5 只SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠，購(gòu)自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2013?0016，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代為飼養(yǎng)，使用許可證號(hào) SYXK（浙）2013?0184，條件為溫度（22±1）℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h 光照，通風(fēng)頻率15～20 次／h。大鼠以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飲水自由，倫理審查決議編號(hào)ZSLL?2017?054。

2 方法

2.1 麝香通心滴丸入血成分分析

2.1.1 麝香通心滴丸混懸液制備 取適量麝香通心滴丸粉研磨成粉末，加入適量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，調(diào)整質(zhì)量濃度為0.4 g／mL，即得，搖勻備用。

2.1.2 動(dòng)物給藥與血清樣品采集 SD 大鼠給藥前禁食12 h，自由飲水，以6.4 g／kg 劑量給藥。給藥前采集空白血樣，在給藥15、30、45、60 min 后眼眶取血各約0.5 mL，收集至EP 管中靜 置30 min，室溫下以3 000 r／min 離心10 min，取上層血清，備用。

2.1.3 血清樣本處理 分別精密吸取200 μL 空白血清和含藥血清（將“2.1.2” 項(xiàng)下4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)含藥血清各吸取50 μL 混勻）于1.5 mL EP 管內(nèi)，加入5 倍量甲醇渦旋5 min，離心（4 ℃、10 000 r／min）10 min，上清液于常溫下氮?dú)獯蹈桑?00 μL 甲醇復(fù)溶，渦旋5 min，離心（4 ℃、10 000 r／min）5 min，取上清液供MS 分析。

2.1.4 色譜條件 Hydro?RP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動(dòng)相0.4% 甲酸乙腈（A）?0.2% 甲酸水（B），梯度洗脫（0～5 min，5% A；5～13 min，5～20% A；13～40 min，20～22% A；40～60 min，22～45% A；60～75 min，45～75 A%）；柱溫30 ℃；體積流量1.3 mL／min；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.5 質(zhì)譜條件 離子源ESI，掃描方式ESI＋、ESI?模式；干燥氣體溫度320 ℃，體積流量10 L／min；鞘氣溫度350 ℃，體積流量12 L／min；碎裂能量175 V；毛細(xì)管電壓3 kV；正負(fù)離子采集范圍m／z50～1 500。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.2.1 預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn) 將分析得到的麝香通心滴丸入血成分通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)得到其mol2 格式文件，并將其上傳至PharmMapper 服務(wù)器（限定靶蛋白為人類，其余為默認(rèn)選項(xiàng)），采用“藥效團(tuán)匹配方法” 得到虛擬篩選結(jié)果。將篩選出的分子?靶點(diǎn)匹配度（Fit Score）大于等于3 的藥物靶點(diǎn)作為靶蛋白，并通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)輸入篩選得到的蛋白靶點(diǎn)PDBID，經(jīng)檢索和轉(zhuǎn)化操作得到的麝香通心滴丸入血成分的潛 在作用靶點(diǎn)。通 過(guò) GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“coronary atherosclerotic heart disease” 為關(guān)鍵詞，檢索與冠心病相關(guān)的基因，并與上述成分靶點(diǎn)匹配進(jìn)行分析，篩選與麝香通心滴丸入血成分相關(guān)的作用靶點(diǎn)。

2.2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 String 數(shù)據(jù)庫(kù)是一種包含已知和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，將上述成分?疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為人類（Homo sapiens），最低相互作用閥值設(shè)為高等置信度0.9 “highest confidence”，同時(shí)顯示設(shè)置隱藏游離點(diǎn)，然后下載PPI 圖形件并保存tsv 文件，最后使用R 語(yǔ)言對(duì)得到的PPI 進(jìn)行核心基因的篩選，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。

2.2.3 靶標(biāo)GO 富集分析和KEGG 通路富集分析 本研究通過(guò)David 6.7 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)成分?疾病交集靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO富集分析、KEGG 通路富集分析，其中GO 富集分析包括生物過(guò)程（biological process）、分子功能（molecularfunction）和細(xì)胞組分（cellular component）3 個(gè)部分，Select Identifier設(shè)置為Official GeneSymbol，List Type 設(shè)置為Gene List，限定物種為人，并用FDR 錯(cuò)誤控制法對(duì)P 值作檢驗(yàn)校正，最終以“P＜0.05” 作為條件進(jìn)行篩選，篩選出具有顯著差異的代謝通路。

2.2.4 入血成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接 對(duì)上述麝香通心滴丸的入血成分與核心靶基因進(jìn)行分子對(duì)接，首先通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)得到各分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索靶基因蛋白構(gòu)象，并根據(jù)以下條件篩選：通過(guò)X 晶體衍射法獲取的蛋白結(jié)構(gòu)；蛋白的晶體解析度小于3 ?；分型明確的蛋白。然后，使用AutoTools 對(duì)蛋白進(jìn)行加氫去除水分子預(yù)處理，AutoGrid 進(jìn)行能量格點(diǎn)計(jì)算，Autodock Vina 進(jìn)行小分子與蛋白對(duì)接，對(duì)每個(gè)對(duì)接進(jìn)行結(jié)合能（af?finity）評(píng)分，PyMoL 作活性分子和蛋白的互相作用圖。

3 結(jié)果

3.1 麝香通心滴丸大鼠入血成分分析 健康大鼠灌胃給予麝香通心滴丸混懸液后，血清樣品的正負(fù)離子圖（BPC 模式）見(jiàn)圖1，與對(duì)照品離子圖比對(duì)后共鑒定出8 種入血成分，見(jiàn)表1。

表1 麝香通心滴丸入血成分

化合物1：正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜分析其準(zhǔn)分子離子為m／z417.227 1 ［M＋H］＋，保留時(shí)間為41.239 min，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖2，其主要的碎片離子有m／z399.215 2 ［M?H2O＋H］＋、363.191 7 ［M?3H2O＋H］＋。將沙蟾毒精的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜及保留時(shí)間與化合物1 相同，由此確認(rèn)其為沙蟾毒精。

圖1 樣品血清離子圖

化合物2：負(fù)離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜分析其準(zhǔn)分子離子為m／z514.283 3 ［M?H］-，保留時(shí)間為52.446 min，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖3，其主要的碎片離子m／z496.271 6 為準(zhǔn)分子離子失去1 分子H2O ［M?H2O?H］-。將?；悄懰岬臉?biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜及保留時(shí)間與化合物2 相同，由此確認(rèn)其為?；悄懰?。

圖2 沙蟾毒精質(zhì)譜圖

圖3 ?；悄懰豳|(zhì)譜圖

化合物3：正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜分析其準(zhǔn)分子離子為m／z403.247 1 ［M＋H］＋，保留時(shí)間為55.824 min，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖4，其主要的碎片離子有m／z367.226 4 ［M?2H2O＋H］＋、349.216 3 ［M?3H2O＋H］＋、253.193 9 ［M?C5H9O5＋H］＋、215.179 0 ［M?C8H11O5＋H］＋。將遠(yuǎn)華蟾毒精的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜及保留時(shí)間與化合物3 相同，由此確認(rèn)其為遠(yuǎn)華蟾毒精。

圖4 遠(yuǎn)華蟾毒精質(zhì)譜圖

化合物4：負(fù)離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜分析其準(zhǔn)分子離子為m／z464.302 5 ［M?H］，保留時(shí)間為56.952 min，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖5，其主要的碎片離子m／z402.299 6 為準(zhǔn)分子離子失去1 分子水和1 分子羧基［M?H2O?COOH?H］-。將甘氨膽酸的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜及保留時(shí)間與化合物4 相同，由此確認(rèn)其為甘氨膽酸。

圖5 甘氨膽酸質(zhì)譜圖

化合物5：正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜分析其準(zhǔn)分子離子為m／z401.231 3 ［M＋H］＋，保留時(shí)間為60.756 min，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖6，其主要的碎片離子為準(zhǔn)分子離子m／z365.200 9 失去2 分子H2O ［M?H2O＋H］＋。將去乙酰華蟾毒精的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜及保留時(shí)間與化合物5 相同，由此確認(rèn)其為去乙酰華蟾毒精。

圖6 去乙酰華蟾毒精質(zhì)譜圖

化合物6：正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜分析其準(zhǔn)分子離子為m／z387.251 6 ［M＋H］＋，保留時(shí)間為62.649 min，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖7，其主要的碎片離子有m／z369.242 1 ［M?H2O ＋H］＋、351.231 3 ［M?2H2O ＋H］＋、255.209 6 ［M?C5H7O4］＋。將蟾毒靈的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜及保留時(shí)間與化合物6 相同，由此確認(rèn)其為蟾毒靈。

圖7 蟾毒靈質(zhì)譜圖

化合物7：負(fù)離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜分析其準(zhǔn)分子離子為m／z437.290 6 ［M＋COOH］-，保留時(shí)間為65.025 min，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖8，其主要的碎片離子m／z391.284 3 為準(zhǔn)分子離子失去1 分子甲酸［M?HCOOH］-。將熊去氧膽酸的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜及保留時(shí)間與化合物7 相同，由此確認(rèn)其為熊去氧膽酸。

圖8 熊去氧膽酸質(zhì)譜圖

化合物8：在正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜分析其準(zhǔn)分子離子為m／z385.237 2 ［M＋H］＋，保留時(shí)間為68.868 min，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖9，其主要的碎片離子有m／z367.227 2 ［M?H2O＋H］＋、349.214 9 ［M?2H2O＋H］＋、253.194 8 ［M?C5H7O4］＋。將脂蟾毒配基的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜及保留時(shí)間與化合物8 相同，由此確認(rèn)其為脂蟾毒配基。

3.2 麝香通心滴丸入血成分網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

3.2.1 作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將麝香通心滴丸8 個(gè)入血成分上傳至PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)后得到的所有靶點(diǎn)，刪除重復(fù)并整合得到作用靶點(diǎn)249 個(gè)。通過(guò)與GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中的1 778個(gè)與冠心病相關(guān)基因進(jìn)行匹配，并通過(guò)R 軟件繪制韋恩圖，篩選出134 個(gè)成分?疾病交集靶點(diǎn)，見(jiàn)表2、圖10。再通過(guò)Cytoscape 3.7.1 軟件將8 個(gè)入血成分與134 個(gè)成分?疾病交集靶點(diǎn)相連，繪制出麝香通心滴丸的藥物?靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖11。

3.2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將韋恩圖得到的134 個(gè)交集基因輸入String 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析得到PPI 圖，見(jiàn)圖12，其中包括134 個(gè)節(jié)點(diǎn)，347 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為5.18，PPI 富集P 值少于1.0×1016，其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大。將String 中下載的tsv 文件用R 語(yǔ)言進(jìn)行處理（以各蛋白連接的節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)為指標(biāo)，列舉節(jié)點(diǎn)數(shù)排名前30 個(gè)的蛋白），得到PPI 中的核心基因絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、酪氨酸激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3 激酶（PIK3R1）等核心基因，見(jiàn)圖13。

圖9 脂蟾毒配基質(zhì)譜圖

表2 成分?疾病交集靶點(diǎn)

圖10 藥物?疾病交集靶標(biāo)韋恩圖

3.2.3 靶標(biāo)GO 富集分析及通路富集分析結(jié)果 利用David 6.7 平臺(tái)對(duì)134 個(gè)藥物?疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析及通路富集分析。GO 富集分析包括分子功能分析、細(xì)胞組分分析、生物學(xué)過(guò)程分析，以?lgP值進(jìn)行排名并列出排名前15 的途徑，見(jiàn)圖14。在分子功能層面主要涉及類固醇激素受體活性、配體依賴性核受體活性等方面；在細(xì)胞組分層面主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)囊泡等方面；生物學(xué)過(guò)程層面主要涉及有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、內(nèi)源性刺激的反應(yīng)、激素刺激的反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等方面。對(duì)富集得到的通路結(jié)果，以?lgP值及各通路連接的基因數(shù)從大到小進(jìn)行排名，見(jiàn)圖15。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，該8 個(gè)入血成分可能通過(guò)ErbB signaling pathway、VEGF signaling pathway、PPAR signaling pathway 等信號(hào)通路治療冠心病。

圖11 藥物?靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖12 麝香通心滴丸入血成分與疾病共有靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

3.2.4 分子對(duì)接 講上述8 個(gè)入血成分與上述互作關(guān)系排名前10 的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)合能（affinity）越小則對(duì)接結(jié)果越好，affinity＜-7 表示具有較好的結(jié)合活性，可見(jiàn)該8 個(gè)入血成分與大多數(shù)核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果基本較好。其中，去乙酰華蟾毒精與MAPK1 結(jié)合活性最高，其分子對(duì)接細(xì)節(jié)模擬見(jiàn)圖16，可知小分子結(jié)合在蛋白的活性口袋，并且有和活性口袋有較好的匹配。

4 討論

本文前期按照一定梯度濃度探索麝香通心滴丸最佳給藥劑量［18］，分別以0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 g／kg 的給藥劑量對(duì)SD 大鼠進(jìn)行灌胃，并對(duì)各劑量組下的大鼠分別于給藥15、30、45、60、75、90、105、120 min 后進(jìn)行眼眶取血并分析血樣。結(jié)果，大鼠在6.4、12.8 g／kg 劑量下各時(shí)間段含藥血清的離子流圖更豐富，并且基本一致，但12.8 g／kg 較為濃稠，給灌胃帶來(lái)不便。最終，以6.4 g／kg為大鼠給藥劑量。

圖13 節(jié)點(diǎn)數(shù)目前30 的靶點(diǎn)

本研究參考文獻(xiàn)［19?20］，分別采用甲醇和乙腈沉淀血清中的蛋白，發(fā)現(xiàn)甲醇沉淀處理得到的血中移行成分?jǐn)?shù)目較多，內(nèi)源性雜志干擾較少，因此提取溶劑選用甲醇。前期考察了15、30、45、60、75、90、105、120 min 共8個(gè)采血點(diǎn)，對(duì)血清樣本質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同的入血成分會(huì)出現(xiàn)在不同采血時(shí)間點(diǎn)樣本中，然而在60 min 后其入血成分的提取離子流響應(yīng)較低，因此選擇混合前4 個(gè)取血點(diǎn)的血樣進(jìn)行分析。

大多數(shù)中藥口服給藥后，移行入血的成分才可能發(fā)揮藥效，通過(guò)分析口服給藥后血清中的入血成分來(lái)確定中藥于體內(nèi)直接作用物質(zhì)，已成為確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的有效途徑。本文基于HPLC?Q?TOF／MS 對(duì)麝香通心滴丸進(jìn)行血清藥物化學(xué)研究，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)鑒定出8 個(gè)成分，文獻(xiàn)［21?22］報(bào)道，沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、脂蟾毒配基、蟾毒靈等均具有一定強(qiáng)心的作用。

圖14 入血成分與疾病交集靶點(diǎn)GO 富集

圖15 KEGG 通路富集

表3 有效成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接

圖16 去乙酰華蟾毒精與MAPK1 的分子對(duì)接細(xì)節(jié)圖

Pharm Mapper 是預(yù)測(cè)化合物生物活性，并建立相應(yīng)的公共網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器［23］。本研究通過(guò)該服務(wù)器，采用反向藥效團(tuán)匹配方法得到虛擬篩選結(jié)果，并與GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中治療冠心病相關(guān)的靶點(diǎn)相結(jié)合，得到134 個(gè)作用靶點(diǎn)，通過(guò)David 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行KEGG 通路分析，發(fā)現(xiàn)這8 種入血成分有較多基因靶點(diǎn)有富集在與冠心病相關(guān)的通路上。通過(guò)Autodock Vina［24］對(duì)上述入血成分與核心靶基因進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示入血成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合性較好。

冠心病是冠狀動(dòng)脈發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，導(dǎo)致血管腔狹窄甚至阻塞，造成心肌缺血、缺氧而導(dǎo)致的心臟病。細(xì)胞凋亡是冠心病病理過(guò)程的重要因素，抗凋亡基因Bcl?2 和促凋亡基因Bax 共同參與［25］，ErbB signaling pathway 通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其中Bcl?2 家族在內(nèi)源性凋亡過(guò)程中起重要調(diào)控作用［26］。研究表明心肌細(xì)胞心肌缺血損傷后可通過(guò)活化ErbB signaling pathway 通路，誘導(dǎo)內(nèi)源性Nrg?1 下調(diào)促凋亡分子Bax 表達(dá)，減輕細(xì)胞由于缺氧復(fù)氧而造成氧化應(yīng)激的損傷。Lin 等［27］通過(guò)Na2S2O4誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入一定濃度的麝香通心滴丸后，結(jié)果表明麝香通心滴丸顯著提高了Na2S2O4處理誘導(dǎo)的H9c2 心肌細(xì)胞的活力并抑制了其異常形態(tài)學(xué)變化麝香通心滴丸預(yù)處理可減輕Na2S2O4引起的缺氧損傷，下調(diào)H9c2 細(xì)胞凋亡前Bax 的表達(dá)，并上調(diào)抗凋亡Bcl?2 的表達(dá)。

麝香通心滴丸具有調(diào)節(jié)過(guò)PPAR 信號(hào)通路的潛在作用。PPAR 信號(hào)通路對(duì)冠心病的發(fā)展和糖代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。PPAR 主要有PPARα、PPARβ 和PPARγ 三種表型。研究表明，PPARα 和PPARγ 的激活能通過(guò)抑制血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞增殖和遷移，抑制單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，減少血管細(xì)胞黏附分子?1、ICAM1 表達(dá)等多個(gè)方面，發(fā)揮治療冠心病的作用［28］。PPAR?γ 對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)主要是增加外周組織對(duì)胰島素的敏感性，從而改善胰島素抵抗［29］。本研究發(fā)現(xiàn)PPAR 信號(hào)通路上有麝香通心滴丸與冠心病的 共同靶 點(diǎn)PPARA、APOA2、PPARD、RXRB、RXRA、PPARG、FABP3、MMP1、FABP5、NR1H3，因此，推測(cè)麝香通心滴丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)PPAR 信號(hào)通路，改善胰島素抵抗來(lái)治療冠心病。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是調(diào)節(jié)生理或病理的血管新生及增加血管通透性的一個(gè)重要細(xì)胞因子，它與內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合后會(huì)提高微血管的通透性，導(dǎo)致大量的炎性細(xì)胞滲入肺間質(zhì)并產(chǎn)生膠原酶降解內(nèi)皮下基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生遷移，從而形成新生血管［30］。VEGFR2 是VEGF 的主要功能受體，其與VEGF 相結(jié)合主要介導(dǎo)血管的生成，VEGF／VEGFR2 信號(hào)通路是VEGF 信號(hào)通路中的主要信號(hào)通路，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、分化，同時(shí)抑制其調(diào)亡。VEGF 是血管生成過(guò)程中具有關(guān)鍵性的生長(zhǎng)因子，可以增加血管密度，促進(jìn)缺氧區(qū)甚至無(wú)血管區(qū)域內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)缺血組織內(nèi)的血管新生，是目前臨床上已知的最強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，可有效促進(jìn)心肌重塑［31］，本研究發(fā)現(xiàn)VEGF signaling pathway 通路上有麝香通心滴丸與冠心病的共同靶點(diǎn)PIK3CG、CDC42、MAPK1、MAP2K1、MAPK14、PLA2G2A、RAF1、SRC、PIK3R1、KDR、AKT2，因此推測(cè)麝香通心滴丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF signaling pathway 通路來(lái)治療冠心病。

綜上所述，本研究基于血清藥物化學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，在體內(nèi)化學(xué)成分分析辨識(shí)的基礎(chǔ)上通過(guò)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析，初步闡釋了麝香通心滴丸治療冠心病作用機(jī)制，可為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)分析及其相關(guān)作用機(jī)制探究提供一定依據(jù)。