不同儲藏年限地黃化學成分分析

宋琳琳 薛淑娟 王利麗 張 飛 陳隨清

（河南中醫(yī)藥大學藥學院， 河南 鄭州450046）

地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLi?bosch的新鮮或干燥塊根，列為上品，秋季采挖，除去蘆頭、須根及泥沙，鮮用，或?qū)⒌攸S緩緩烘焙至干，前者習稱 “鮮地黃”，后者習稱 “生地黃”［1］，始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》。清代陳嘉謨在《本草蒙荃》［2］中解釋道：“江浙壤地種者，受南方陽氣，質(zhì)雖光潤而力微，懷慶山產(chǎn)者，稟北方純陰，皮有疙瘩而力大”，懷慶為河南焦作一帶，至今仍以河南“懷地黃” 為道地藥材，為“四大懷藥” 之一，故本研究藥材皆收集于河南。

地黃的化學成分大多為苷類，其中又以環(huán)烯醚萜苷類為主，從鮮地黃及干地黃中已分離鑒定出20 多種，如梓醇、二氫梓醇、乙酰梓醇、益母草苷、桃葉珊瑚苷、單蜜力特苷、蜜力特苷、益母草苷A、B、C、D 等；從地黃愈傷組織甲醇提取物中分離鑒定了4 種酚性苷類和8 種糖，如水蘇糖、棉籽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露三糖、毛蕊花糖及半乳糖［3］；李更生等［4］報道，地黃從鮮品加工成生地黃及熟地黃過程中，顏色從淡黃色變成黑色，梓醇含有量約降低至原來的1／7，而地黃苷A、地黃苷D 含有量變化不顯著。

地黃經(jīng)長時間放置后，斷面亦會越來越黑；新鮮烘焙出的地黃斷面的顏色通常為棕黃色、棕褐色、外黃內(nèi)棕等，少見黑色，若呈黑色則大多為烘焦所致，且傳統(tǒng)用藥習慣認為生品烘焙好存放以3～5 年為佳，但其中成分不穩(wěn)定，如按現(xiàn)有指標則不足以全面評價藥材質(zhì)量。因此，本研究在2015 年版《中國藥典》 檢查項目的基礎上，增加氨基酸、糖類、環(huán)烯醚萜苷類等評價指標，全面了解不同儲藏時間下地黃化學成分的變化規(guī)律，以期為其貯藏、加工提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 島津LC?20A 高效液相色譜儀（配置RI 檢測器）、島津UV?2600 紫外分光光度計（日本島津公司）；Waters2695 高效液相色譜儀（配置2998 紫外檢測器，美國Waters 公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）；KQ?500DV 數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海比朗儀器有限公司）；分析天平（十萬分之一）、ALC?210.4 電子天平（萬分之一）（德國賽多利斯公司）。

1.2 試劑與樣品 梓醇（17030904）、毛蕊花糖苷（13042401）、地黃苷D（16091306）、地黃苷A（16072802 ）、果 糖（140811 ）、半乳糖（16070K01）對照品均購于四川省維克奇生物科技有限公司；益母草苷（L10A6Y2298）、棉籽糖（BBT0177）、水蘇糖（K03D6S6823）、阿拉伯糖（Z29O7H23894）、甘露糖（A16O6L4546）、甘露三糖（15122402）、蜜二糖（K23M7S15176）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司。石油醚（天津市富宇精細化工有限公司）；乙酸乙酯（天津市致遠化學試劑有限公司）；磷酸、濃硫酸（北京化工廠）；雙蒸水（實驗室自制）。甲醇、乙腈（美國Fisher 公司）。樣品具體信息見表1。

2 方法

2.1 氨基酸含有量測定 將25 份樣品送于河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究中心，采用氨基酸分析儀，根據(jù)國家標準GB5009.124—2016（具體方法見附錄Ⅰ）測定了16 種游離氨基酸的含有量及其總和。

2.2 梓醇、毛蕊花糖苷的含有量測定 按2015 年版《中國藥典》 方法測定，色譜圖見圖1～2。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

圖1 梓醇HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of catalpol

2.3 寡糖棉籽糖、蔗糖、水蘇糖、果糖含有量測定

2.3.1 原理 由于糖類成分在正常的紫外區(qū)域和可見光范圍內(nèi)沒有吸收，也無熒光，故不經(jīng)過衍生的糖不適合使用紫外檢測器和熒光檢測器，應選擇示差折光檢測器。另外，糖類物質(zhì)極性較大，因此選擇NH2色譜柱進行分離。

圖2 毛蕊花糖苷HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of verbascoside

2.3.2 色譜條件 Inertsil NH2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈?水（70 ∶30）；體積流量1 mL／min，色譜圖見圖3。

圖3 單糖、寡糖HPLC 色譜圖（Ⅰ）Fig.3 HPLC chromatograms of monosaccharides and oligosaccharides（Ⅰ）

2.3.3 對照品溶液制備 精密稱取對照品棉子糖5.06 mg、蔗糖3.41 mg、水蘇糖9.83 mg、果糖4.97 mg，置于1 mL 量瓶中，加水溶解至刻度，即得（四者質(zhì)量濃度分別為5.06、3.41、9.83、4.97 mg／mL）。

2.3.4 供試品溶液制備 精密稱定60 ℃下烘72 h后粉碎成粗粉（過2 號篩）的地黃1.50 g，置于錐形瓶中，50 mL 蒸餾水回流2 h，取出放至冷卻，蒸餾水補足減失質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液20 mL，用等量石油醚和乙酸乙酯分別萃取2 次，取下層溶液，過0.22 μm 微孔濾膜備用。

2.4 葡萄糖、半乳糖、甘露三糖、蜜二糖、阿拉伯糖、甘露糖含有量測定

2.4.1 原理 為了盡可能多的檢測糖的種類，對其進行柱前衍生化法處理。糖類物質(zhì)極性較大，缺乏光學吸收基團，而衍生化可以使糖鏈結(jié)構(gòu)帶上紫外或者熒光基團。PMP 衍生試劑和糖鏈末端的反應在弱堿性介質(zhì)中進行，具有條件溫和、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、無立體異構(gòu)體，紫外吸收強的特點，適用于多種糖鏈分析。

2.4.2 色譜條件 Waters XBridge? shield C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；葡萄糖和半乳糖流動相乙腈（A）?20 mmol／L 乙酸銨（B）；甘露三糖、蜜二糖、阿拉伯糖、甘露糖流動相乙腈（A）?0.1% 甲酸（B），梯度洗脫，程序見表2；體積流量1 mL／min；檢測波長245 nm，色譜圖見圖4～5。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

圖4 葡萄糖、半乳糖HPLC 色譜圖（Ⅱ）Fig.4 HPLC chromatograms of glucose and galactose（Ⅱ）

2.4.3 對照品溶液制備 精密稱取對照品葡萄糖4.86 mg、半乳糖4.98 mg、甘露三糖4.79 mg、甘露糖 4.79 mg、蜜二糖 5.41 mg、阿拉伯 糖8.29 mg，置于1 mL 量瓶中，加水溶解至刻度，即得（五者質(zhì)量濃度分別為4.86、4.98、4.79、4.79、5.41、8.29 mg／mL）。

2.4.4 供試品溶液PMP 衍生 取“2.3.4” 項下供試品溶液100 μL，依次加100 μL 0.3 mol／L NaOH 溶液、0.5 mol／L 1?苯基?3?甲基?5?吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液至離心管中，混勻后于70 ℃下反應30 min，冷卻后加入等量0.3 mol／L HCl 溶液反應，400 μL 氯仿離心萃取10 min，取上層溶液進行HPLC 分析。

圖5 單糖、寡糖HPLC 色譜圖（Ⅱ）Fig.5 HPLC chromatograms of monosaccharides and oligosaccharides（Ⅱ）

2.5 多糖含有量測定

2.5.1 原理 苯酚?硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，它在490 nm 波長處有最大吸收，再以比色法測定含糖量。

2.5.2 對照品溶液制備 取無水葡萄糖對照品10.47 mg，置于100 mL 量瓶中，蒸餾水溶解稀釋至刻度，即得（質(zhì)量濃度為0.104 7 mg／mL）。

2.5.3 最大吸收波長測定 吸取“2.5.2” 項下無水葡萄糖對照品溶液2 mL，依次加入1 mL 5%苯酚溶液、5 mL 濃硫酸，搖勻后放置5 min，水浴15 min后冰浴至室溫，進行200～800 nm 全波長掃描。結(jié)果顯示，其在490 nm 波長處有最大吸收，因此確定檢測波長為490 nm。

2.5.4 生地黃多糖提取 取樣品粉末100 g 于圓底燒瓶中，500 mL 石油醚回流提取1 h，重復操作1 次，濾過，濾渣揮干后加500 mL 80%乙醇回流提取1 h，重復操作1 次，濾過，濾渣揮干后加1 000 mL蒸餾水回流提取1 h，重復操作1 次，趁熱濾過后合并濾液，減壓濃縮至150 mL，加入硅藻土過濾，濾液加乙醇使其含醇量超過80%，置冰箱中靜置12 h，棄上清液，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌離心3 次，50 ℃烘干，即得。

2.5.5 換算因子測定 取5.1 mg 地黃多糖，置于50 mL 量瓶中，蒸餾水溶解定容，搖勻后取2 mL，測定吸光度，依據(jù)標準曲線算出多糖濃度，換算因子f計算公式為f＝W／（C×D），其中W為多糖質(zhì)量（mg），C為多糖稀釋液中葡萄糖質(zhì)量濃度（mg／mL），D為多糖稀釋因素。

2.5.6 供試品溶液制備與測定 取0.1 g 樣品粉末，置于100 mL 錐形瓶中，加50 mL 95%乙醇振蕩3 h，取出過濾，濾渣加50 mL 80% 乙醇振蕩2 h，濾渣揮干，加50 mL 蒸餾水，60 ℃浸泡3 h，濾過，取2.3 mL 濾液，蒸餾水定容至10 mL 量瓶中，即得。取2 mL 供試品溶液于試管中，依次加入5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，搖勻后靜置5 min，水浴15 min，取出冰浴至室溫，測其吸光度。

2.6 地黃苷A、地黃苷D、益母草苷含有量測定

2.6.1 原理 環(huán)烯醚萜苷類化合物易溶于極性較大的溶劑中，一般采用溶劑提取法，利用超聲波產(chǎn)生的強烈震動、較高的加速度、強烈的空化效應、攪拌作用，可以加速溶劑滲入藥材中，促使環(huán)烯醚萜溶解。

2.6.2 色譜條件 Aichrombond?AQ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈?水（3 ∶97）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長203 nm；進樣量20 μL，色譜圖見圖6。

圖6 環(huán)烯醚萜苷類HPLC 色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of cyclic allene terpenoids

2.6.3 對照品溶液制備 分別稱取地黃苷A、益母草苷、地黃苷D 對照品0.42、0.10、0.58 mg，加雙蒸水溶解搖勻，即得（三者質(zhì)量濃度分別為0.42、0.10、0.058 mg／mL）。

2.6.4 供試品溶液制備 稱取樣品粉末2.0 g，置于錐形瓶中，加入60% 甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，取出冷卻至室溫，60%甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，棄去初濾液，量取20 mL 續(xù)濾液減壓濃縮至近干，流動相溶解定容至5 mL 量瓶中，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得，冷藏備用。

2.7 方法學考察 梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷、果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、甘露三糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖、總多糖在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.998 0），精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率試驗結(jié)果均良好。

3 結(jié)果與分析

3.1 地黃中氨基酸含有量變化 隨著儲藏時間延長，總氨基酸含有量及天冬氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸含有量逐年下降，其中賴氨酸、精氨酸屬于堿性氨基酸，見表3、圖7。

3.2 地黃中化學成分含有量變化 隨著儲存時間延長，棉籽糖、水蘇糖、總多糖含有量逐年降低，蔗糖、甘露三糖含有量先增后減，蔗糖在儲存1 年后含有量最高，甘露三糖在儲存2 年后含有量較高，蜜二糖含有量基本平穩(wěn)；單糖中半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖含有量也有所增加，果糖、葡萄糖含有量先增后減；環(huán)烯醚萜苷類成分（梓醇、地黃苷D、地黃苷A、益母草苷）含有量下降；毛蕊花糖苷含有量有小幅度下降，但相對穩(wěn)定。見表4、圖8～10。

4 討論

傳統(tǒng)經(jīng)驗認為，地黃以塊大、體質(zhì)量、斷面烏黑者為佳，地黃剛烘焙好時通常呈現(xiàn)棕黃、棕褐色等，隨著儲藏年限增加斷面顏色會逐漸變黑，是逐漸發(fā)生美拉德反應的過程。地黃中含有豐富的美拉德反應底物，影響因素不僅包括糖類和氨基酸，還有溫度、時間、pH、水分活度等［5］，儲存時間的延長會促進美拉德反應，所以儲藏時間長的生品斷面顏色逐漸加深，直至變成烏黑色，美拉德反應的程度也逐漸加深。作為參加美拉德反應的反應物，堿性氨基酸含有量降低，與吳正善［6］、倪慕云［7］、龔躍新等［8］研究結(jié)果一致，同時棉籽糖、水蘇糖、總多糖持續(xù)水解［9］；水蘇糖水解為甘露三糖或棉籽糖［10］，棉籽糖水解為蜜二糖或蔗糖、半乳糖［11］，總多糖水解為阿拉伯糖和甘露糖，所以水蘇糖含有量下降，阿拉伯糖、甘露糖含有量升高；甘露三糖、蜜二糖、蔗糖、乳糖等寡糖水解為葡萄糖、半乳糖、果糖等單糖［12］，所以還原糖含有量的變化趨勢較為特殊，一方面從反應體系顏色的變化和氨基酸組分含有量的降低，可以判斷美拉德反應的進行，部分還原糖參加反應被消耗；另一方面體系中又生成了大量的還原糖，2 個反應平衡的最終結(jié)果是體系中的的還原糖含有量有升有降。甘露三糖的含有量先增加后減少，上升階段可能是由于水蘇糖的水解產(chǎn)生了甘露三糖，下降階段可能是由于其生成的速率要低于其自身的水解速率；蔗糖含有量上升階段可能也是由于其大部分來源于棉子糖的水解，下降階段是因為自身水解成了單糖，水解速率要高于生成速率；蜜二糖的含有量基本穩(wěn)定，上升幅度較小，可能是其生成速率與水解速率基本一致。在美拉德反應的初級階段，體系中游離氨基與游離羰基發(fā)生縮合生成不穩(wěn)定的亞胺衍生物?薛夫堿，隨即環(huán)化為N?葡萄糖基胺，后者在酸的催化下經(jīng)過Amadori 分子重排，生成果糖基胺（1?氨基?1?脫氧?2?酮糖）［13?14］，此時葡萄糖與果糖都參與了美拉德反應，所以含有量下降。據(jù)報道，美拉德反應可導致體系中積累一定量的甲酸和乙酸，使體系酸化［15］呈弱酸性，果糖基胺進行1，2?烯醇化反應，再經(jīng)過脫水、脫氨最后生成羥甲基糠醛，單糖中果糖、葡萄糖的含有量先增后減，其中果糖的變化趨勢大于葡萄糖，可見其反應性大于后者［16］。

表3 不同儲藏年限樣品中氨基酸含有量測定結(jié)果（g／kg，， n＝5）Tab.3 Results of amino acid content determination in samples with different storage years（g／kg， x ±s， n＝5）

表3 不同儲藏年限樣品中氨基酸含有量測定結(jié)果（g／kg，， n＝5）Tab.3 Results of amino acid content determination in samples with different storage years（g／kg， x ±s， n＝5）

表4 不同儲藏年限樣品中各成分含有量測定結(jié)果（%，， n＝5）Tab.4 Results of content determination of various constituents in samples with different storage years（%， x ±s， n＝5）

圖8 不同儲藏年限樣品中寡糖及總多糖含有量變化Fig.8 Variations of oligosaccharide and total polysaccharides contents in samples with different storage years

圖9 不同儲藏年限樣品中單糖含有量變化Fig.9 Variations of monosaccharide contents in samples with different storage years

圖10 不同儲藏年限樣品中環(huán)烯醚萜苷類及毛蕊花糖苷含有量變化Fig.10 Variations of cyclic allene terpenoid and verbascoside contents in samples with different storage years

環(huán)烯醚萜苷是地黃中的主要化學成分，其極性相對較大，易溶于水，但熱穩(wěn)定較差［17］。王宏潔等［18］發(fā)現(xiàn)，梓醇在酸堿條件下極不穩(wěn)定；有文獻表明，結(jié)合糖越多的環(huán)烯醚萜苷類成分越穩(wěn)定，梓醇為單糖苷，容易發(fā)生反應［19］，所以在體系酸化后其含有量下降幅度很大，而地黃苷A、D，益母草苷屬于雙糖苷，下降幅度略小。另外，毛蕊花糖苷含有量下降可能是由于反應時體系酸化，發(fā)生可逆的酯化反應［20］，如毛蕊花糖苷可轉(zhuǎn)化為異毛蕊花糖苷［21?22］。

綜上所述，儲藏時間越久，地黃斷面顏色不斷加深；寡糖含有量雖然會呈現(xiàn)先增后減的趨勢，但總體還是下降的；總多糖、環(huán)烯醚萜苷類含有量逐漸降低；大多數(shù)化學成分經(jīng)過3 年儲藏后，其含有量都趨于平穩(wěn)。薛淑娟等［23］研究不同商品規(guī)格中地黃化學成分的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)隨著斷面顏色逐漸加深，環(huán)烯醚萜類、寡糖類成分含有量逐漸降低，而單糖類含有量逐漸升高，與本研究結(jié)果基本一致。因此，可將斷面顏色作為依據(jù)來對不同品質(zhì)的地黃進行區(qū)分，可為工業(yè)生產(chǎn)及醫(yī)院用藥提供參考依據(jù)。