砂仁復(fù)方對(duì)5?FU 所致大鼠腸道損傷的影響

鄭霏艷 孫瑞芬 龔建瑜 陳 鑫 趙榮華 李 菊?

（1.云南省疾病預(yù)防控制中心， 云南 昆明650022； 2.云南中醫(yī)藥大學(xué)， 云南 昆明650500）

惡性腫瘤威脅著全人類的健康，在我國(guó)腫瘤導(dǎo)致的死亡占全部死因的1／4，治療手段以手術(shù)和放化療為主。五氟尿嘧啶（5?fluorouracil，5?FU）是臨床上常用的化療藥物，但其應(yīng)用常伴隨有骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、肝損害、泌尿生殖系統(tǒng)毒性、脫發(fā)等不良反應(yīng)［1］，以胃腸道反應(yīng)為主，如何改善這一現(xiàn)象，成為了腫瘤化療中的重要課題。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)博大精深，尤其在治療胃腸道方面疾病時(shí)有不可替代的優(yōu)勢(shì)。砂仁復(fù)方是以砂仁為主要藥材，輔以人參、滇黃精制成，方中砂仁具有行氣調(diào)中、和胃醒脾的功效，在臨床上具有保護(hù)胃黏膜、改善胃腸機(jī)能、止痛、止瀉、促進(jìn)消化液的分泌等作用［2?3］；人參具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津止渴、安神益智的功效［4］，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明它有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗炎、殺菌等作用［5］；滇黃精具有滋腎潤(rùn)肺、補(bǔ)脾益氣的功效［6］，全方對(duì)5?FU 導(dǎo)致的胃腸道功能損傷可能具有保護(hù)作用，但尚無(wú)確切的研究證明。本實(shí)驗(yàn)利用5?FU 建立大鼠腸道功能損傷模型，研究砂仁復(fù)方對(duì)大鼠腸道功能損傷的保護(hù)作用，為臨床腫瘤治療中5?FU 應(yīng)用提供支撐，為該方開(kāi)發(fā)利用提供一定科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為云南砂仁產(chǎn)業(yè)化發(fā)揮推動(dòng)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD 大鼠，清潔級(jí)，雄性，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滇）k2015?002。

1.2 試劑與藥物 砂仁復(fù)方相關(guān)生藥均購(gòu)自昆明螺獅灣中藥材市場(chǎng)，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)趙榮華教授鑒定為正品。雙歧桿菌四聯(lián)活菌片（杭州遠(yuǎn)大生物制藥有限公司，批號(hào)201703101）；5?FU（北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)BJ160513212A）；二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號(hào)P1511）；高效細(xì)胞組織裂解液（radio?immunoprecip?itation assay，RIPA，北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)R0010）；Anti?occludin 抗體（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab167161）；Anti?Claudin?1 抗體（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab15098）；Anti?Alpha tubulin 抗體（英國(guó)Abcam 公 司，貨 號(hào)5335）；辣根過(guò) 氧化物 酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobin G，IgG）二 抗（美 國(guó)Cell Signaling Technology 公司，貨號(hào)7074）；抗?甘油醛?3?磷酸脫氫酶（Anti?glyceraldehyde?3?phosphate dehydro?genase，Anti?GAPDH）抗體（美國(guó)Proteintech 公司，貨號(hào)10494?1?AP）；電化學(xué)發(fā)光（electrochemilumines?cence，ECL）檢測(cè)試劑（德國(guó)Merck Millipore 公司，貨號(hào)WBKLS0050）。

2 方法

2.1 砂仁復(fù)方溶液的制備 砂仁復(fù)方為砂仁、滇黃精、人參按1 ∶1 ∶1 比例配伍而成，滇黃精用其提取液制成每1 mL 含1 g 生藥的流浸膏備用，砂仁、人參分別粉碎過(guò)100 目篩備用。根據(jù)砂仁復(fù)方人服用每日劑量，折算大鼠的等效劑量約為1.6 g生藥／kg，為本實(shí)驗(yàn)的中劑量，同時(shí)分別以0.8、3.2 g 生藥／kg 作為低劑量、高劑量。再配制0.32 g／mL砂仁復(fù)方高劑量藥液、0.16 g／mL 砂仁復(fù)方中劑量藥液、0.08 g／mL 砂仁復(fù)方低劑量藥液。

2.2 分組、造模及給藥 雄性SD 大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性（思連康）組及砂仁復(fù)方低、中、高劑量組，每組8 只。動(dòng)物模型參照課題組前期實(shí)驗(yàn)研究及郭炳勛［7］、杜靜等［8］報(bào)道的方法，空白組每天灌胃生理鹽水（1 mL／100 g）1 次至第19 天；模型組除每天灌胃生理鹽水至第19 天外，于第8、14 天灌胃生理鹽水4 h 后腹腔注射5?FU（35 mg／kg）1 次。陽(yáng)性組每天灌胃生理鹽水至第7 天，第8 天灌胃思連康溶液（0.45 g／kg），每天1 次，至第19 天，于第8、14 天給藥4 h 后腹腔注射5?FU（35 mg／kg）1 次；砂仁復(fù)方低、中、高劑量組每天灌胃相應(yīng)劑量的藥液1 次，于第8、14 天給藥4 h 后腹腔注射5?FU（35 mg／kg）1 次。每天測(cè)量大鼠飲食量、體質(zhì)量，觀察其狀態(tài)和活動(dòng)情況，體質(zhì)量增量＝體質(zhì)量第19天-體質(zhì)量第1天。

2.3 HE 染色 每組隨機(jī)抽取3 只大鼠，處死后取回腸，于10% 中性福爾馬林中固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精?伊紅染色，中性樹(shù)膠進(jìn)行封片，觀察各組織切片形態(tài)，測(cè)量小腸絨毛高度及隱窩深度。

2.4 Western blot 檢測(cè)

2.4.1 總蛋白的提取、測(cè)定和變性 取小腸組織，磷酸緩沖鹽溶液快速清洗，稱定質(zhì)量，每1 mg 加入1 mL 細(xì)胞組織裂解液（RIPA），置玻璃勻漿器中快速勻漿，冰上裂解0.5 h，離心（13 000 r／min、4 ℃）20 min，收集上清，即得小腸組織總蛋白。蛋白定量采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行，利用酶標(biāo)儀在562 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定小腸組織總蛋白含有量，提取液按1 ∶1比例加入電泳樣品緩沖液，于95 ℃水浴鍋中煮5 min進(jìn)行變性。

2.4.2 Western blot 制備含10%分離膠、5%濃縮膠的15 孔1.2 mm 聚丙烯酰胺凝膠（dodecyl sulfate，sodium salt?polyacrylamide gel electrophoresis，SDS?PAGE）。蛋白液按空白組、模型組、陽(yáng)性組及砂仁復(fù)方低、中、高劑量組順序依次上樣，兩邊分別加入4 μL 標(biāo)記（marker），80 V 電泳2 h，120 V 轉(zhuǎn)膜2 h 到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，PVDF 膜于室溫?fù)u床上用5%脫脂奶粉?三甲胺?生理鹽水和吐溫20 緩沖液（tris?buffered saline and Tween 20，TBST）于搖床上振搖均勻封閉2 h，封閉后用TBST 緩沖液洗滌3 次（5 min／次），加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，第2 天用TBST 洗膜3 次（5 min／次），再加入偶聯(lián)的二抗，于室溫?fù)u床上孵育1.5 h，用TBST 洗膜3 次（5 min／次）后用ECL顯影液顯影，凝膠成像儀拍照。采用Quantity One軟件對(duì)條帶進(jìn)行光密度分析，以目的蛋白光密度與內(nèi)參蛋白光密度比值代表目的蛋白的相對(duì)含有量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用最小顯著性差異法（least sig?nificant difference，LSD）檢驗(yàn)，方差不齊者采用Tamhane’s 法檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 砂仁復(fù)方對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響 如表1 所示，模型組體質(zhì)量增量低于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，砂仁復(fù)方各劑量組體質(zhì)量增量無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量增量（， n＝8）Tab.1 Weight gain of rats in each group（， n＝8）

表1 各組大鼠體質(zhì)量增量（， n＝8）Tab.1 Weight gain of rats in each group（， n＝8）

注：與空白組比較，△P＜0.05。

3.2 砂仁復(fù)方對(duì)大鼠回腸病理形態(tài)學(xué)及絨毛高度的影響 如圖1 所示，空白組腸絨毛結(jié)構(gòu)清晰、完整，黏膜下層、肌層完整，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組腸絨毛斷裂嚴(yán)重、結(jié)構(gòu)改變，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)至黏膜下層，形成潰瘍，部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)至肌層，杯狀細(xì)胞消失；陽(yáng)性組腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞，炎細(xì)胞浸潤(rùn)至黏膜下層、部分腸上皮細(xì)胞；砂仁復(fù)方低劑量組腸絨毛結(jié)構(gòu)部分改變、絨毛部分?jǐn)嗔?，黏膜下層有炎?xì)胞浸潤(rùn)，部分肌層增生；砂仁復(fù)方中劑量組中腸絨毛結(jié)構(gòu)部分改變、斷裂，黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；砂仁復(fù)方高劑量組炎性細(xì)胞不同程度浸潤(rùn)至腸絨毛、黏膜下層，上皮細(xì)胞脫落。

圖1 HE 染色檢測(cè)各組大鼠回腸組織病理學(xué)（×10）Fig.1 Histopathological detection of rat ilea in each group by HE staining（×10）

如表2 所示，空白組小腸絨毛高度大于模型組（P＜0.01），砂仁復(fù)方各劑量組小腸絨毛高度均大于模型組（P＜0.05，P＜0.01），初步表明砂仁復(fù)方對(duì)5?FU 所致大鼠回腸絨毛降低具有調(diào)節(jié)作用。

表2 各組大鼠小腸絨毛高度（， n＝3）Tab.2 Intestinal villus heights of rats in each group（，n＝3）

表2 各組大鼠小腸絨毛高度（， n＝3）Tab.2 Intestinal villus heights of rats in each group（，n＝3）

注：與空白組比較，△△P ＜0.01；與模型組比較，?P ＜0.05，??P＜0.01。

3.3 砂仁復(fù)方對(duì)大鼠小腸隱窩深度的影響 如表3 所示，空白組小腸隱窩深度大于模型組（P＜0.05）；陽(yáng)性組、模型組小腸隱窩深度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；砂仁復(fù)方低、中、高劑量組小腸隱窩深度大于模型組（P＜0.05），初步表明砂仁復(fù)方對(duì)5?FU 所致大鼠回腸隱窩深度降低具有調(diào)節(jié)作用。

表3 各組大鼠小腸隱窩深度（， n＝3）Tab.3 Depths of small intestinal crypts of rats in each group（， n＝3）

表3 各組大鼠小腸隱窩深度（， n＝3）Tab.3 Depths of small intestinal crypts of rats in each group（， n＝3）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，?P＜0.05。

3.4 砂仁復(fù)方對(duì)大鼠腸道緊密連接occludin 蛋白表達(dá)的影響 如圖2 所示，與空白組比較，模型組occludin 表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，砂仁復(fù)方各劑量組occludin 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），初步表明5?FU 腹腔注射致大鼠occludin 表達(dá)降低，而砂仁復(fù)方對(duì)其具有調(diào)高作用。

圖2 砂仁復(fù)方對(duì)大鼠腸道組織occludin 蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of AVLC on the expression of occludin protein in intestinal tissue of rats

3.5 砂仁復(fù)方對(duì)大鼠腸道緊密連接Claudin?1 蛋白表達(dá)的影響 如圖3 所示，與空白組比較，模型組Claudin?1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，砂仁復(fù)方中劑量組（P＜0.05）、高劑量組（P＜0.01）Claudin?1 蛋白表達(dá)升高。

4 討論

化療是腫瘤治療的主要手段之一，但相關(guān)藥物的毒副作用影響著化療能否順利進(jìn)行，而胃腸道反應(yīng)是常見(jiàn)的不良反應(yīng)之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物可直接損傷腸黏膜上皮細(xì)胞，引起腸上皮細(xì)胞損傷、凋亡；影響細(xì)胞增殖，阻礙腸黏膜修復(fù)；引起免疫細(xì)胞數(shù)量變化，導(dǎo)致免疫調(diào)控異常［9?10］，在能使用的藥物中，很少有能夠達(dá)到有效拮抗化療后胃腸損傷的效果。化療藥物對(duì)胃腸損傷的機(jī)制比較復(fù)雜，本研究中陽(yáng)性藥思連康是一種復(fù)方制劑，其主要成分為雙歧桿菌、糞腸球菌、蠟樣芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌，部分是人體腸道空白的腸菌群，可直接補(bǔ)充機(jī)體空白生理細(xì)菌，在腸道形成一個(gè)生物屏障，繼而促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，緩解臨床癥狀以調(diào)節(jié)胃腸功能［11］，但可能因其對(duì)胃腸道保護(hù)作用單一，導(dǎo)致在整個(gè)化療藥對(duì)胃腸損傷實(shí)驗(yàn)中保護(hù)性作用微弱。結(jié)果，思連康在調(diào)節(jié)隱窩深度、絨毛高度等方面都有一定積極作用，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖3 砂仁復(fù)方對(duì)大鼠腸道組織Claudin?1 蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of AVLC on the expression of Claudin?1 protein in intestinal tissue of rats

體質(zhì)量直接顯示胃腸道功能的高低，也是治療惡性腫瘤的臨床療效指標(biāo)之一，可間接反映腫瘤患者的生存質(zhì)量［12］。模型組體質(zhì)量增量低于空白組；砂仁復(fù)方各劑量組體質(zhì)量增量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；砂仁復(fù)方中劑量組對(duì)5?FU 所致大鼠體質(zhì)量增量降低，具有一定調(diào)節(jié)作用。所以，進(jìn)一步進(jìn)行砂仁復(fù)方有效化合物的提取、純化，增加有效成分的血藥濃度，有望能達(dá)到有效調(diào)節(jié)體質(zhì)量的目的，但高、低劑量調(diào)節(jié)作用較弱，可能是因?yàn)榈蛣┝窟_(dá)不到有效血藥濃度，而高劑量表現(xiàn)出一定的不良反應(yīng)。

小腸絨毛是吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要部位，腸絨毛的高低決定著絨毛上皮細(xì)胞數(shù)量的多少，進(jìn)而影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收［13］；隱窩深度反映了上皮細(xì)胞的生成率，上皮細(xì)胞不斷從隱窩基部向絨毛端部遷移、分化，形成具有吸收能力的絨毛細(xì)胞，以補(bǔ)充空白的脫落［14］，因此，腸絨毛高度及隱窩深度一定程度間接反映了腸道的結(jié)構(gòu)和功能?？瞻捉M小腸絨毛高度、隱窩深度顯著高于模型組，砂仁復(fù)方各劑量組也均顯著高于模型組，初步表明砂仁復(fù)方對(duì)化療藥5?FU 所致大鼠回腸絨毛降低具有明顯調(diào)節(jié)作用，其途徑可能是通過(guò)對(duì)腸道生理功能及屏障功能的恢復(fù)，增加腸道對(duì)體內(nèi)儲(chǔ)留的代謝物的排出，以低、中劑量調(diào)節(jié)作用最顯著，這可能與砂仁揮發(fā)油成分可通過(guò)對(duì)抗胃腸黏膜的攻擊因子來(lái)產(chǎn)生胃腸保護(hù)作用有關(guān)［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小腸緊密連接occludin 蛋白表達(dá)顯著低于空白組，砂仁復(fù)方各劑量組其表達(dá)均明顯高于模型組，表明5?FU 腹腔注射致大鼠oc?cludin 蛋白表達(dá)降低，而砂仁復(fù)方對(duì)其具有明顯調(diào)高作用；模型組中Claudin?1 蛋白表達(dá)低于空白組，砂仁復(fù)方中劑量組、高劑量組中其表達(dá)明顯高于模型組。腸道黏膜屏障主要由上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接構(gòu)成，是阻礙有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的重要屏障［16］，腸道緊密連接主要位于腸上皮細(xì)胞頂端表面，是上皮細(xì)胞間連接最為重要的結(jié)構(gòu)復(fù)合物，在維持腸黏膜的屏障功能方面發(fā)揮著重要的作用，多種蛋白參與了緊密連接的形成，包括Claudin、oc?cludin 等，因此，腸道緊密連接蛋白被用來(lái)作為評(píng)價(jià)腸道黏膜屏障和腸道通透性的指標(biāo)［17?18］。結(jié)果顯示，砂仁復(fù)方可以增加多種蛋白的表達(dá)，參與腸道緊密連接結(jié)構(gòu)的形成，為胃腸道損傷提供保護(hù)。

綜上所述，砂仁復(fù)方可以從多方面、多層次調(diào)節(jié)5?FU 所致大鼠腸道功能的損傷作用，為該方開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了調(diào)節(jié)胃腸道作用的初步研究，今后還需深入系統(tǒng)地探索。