HPLC 法同時測定退赤膠囊中8 種成分

朱應(yīng)成 余 靜 劉亮鏡 徐 斌

（蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心， 安徽 蕪湖241000）

退赤膠囊具有清熱、明目、退翳之功效，臨床上主要用于治療目赤腫痛、畏光、流淚之結(jié)膜炎、角膜炎、角膜云翳等外障眼疾［1］，為本課題組聯(lián)合蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院眼科專家根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)創(chuàng)制而成，是由金銀花、菊花、連翹、黃芩、桔梗、木賊、密蒙花、谷精草、蒺藜、車前子、甘草11 味藥材經(jīng)現(xiàn)代制藥技術(shù)加工而成的純中藥制劑（皖藥制字Z20050017）。方中君藥金銀花、菊花及臣藥連翹均具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，主治風(fēng)熱上攻之目赤腫痛［2?3］；臣藥黃芩含有黃芩苷，具有抗菌、抗病毒的藥理作用［4?5］。

退赤膠囊組方藥味較多，化學(xué)成分較復(fù)雜，但該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對連翹酯苷A 進(jìn)行定量分析，無法全面反映其內(nèi)在質(zhì)量，難以實(shí)現(xiàn)有效監(jiān)控。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時測定退赤膠囊中綠原酸［6?8］、咖啡酸［6?7］、阿魏酸［8］、蘆?。??8］、連翹酯苷A［9］、連翹苷［9］、黃芩苷［4］、甘草苷［10］的含有量，以期保障該制劑質(zhì)量的均一性和臨床療效的穩(wěn)定性。

1 材料

Waters e2695 型高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器（PDA）（美國Waters 公司）；XP?205型電子分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；KQ?500B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

退赤膠囊（自 制，批 號 181101、181102、181103、181104、181201、181202）。綠原酸（批號110753?201314，純度96.6%）、咖啡酸（批號110885?200102，純度100%，置于五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h 后使用）、阿魏酸（批號110773?201313，純度99.6%，置于五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h 后使用）、甘草苷（批號111610?201106，純 度 93.7%）、蘆 丁（批 號100080?201409，純度91.9%）、連翹酯苷A（批號111810?201707，純 度97.2%）、黃芩苷（批 號110715?201318，純 度93.3%）、連翹苷（批 號110821?201112，純度96.8%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（含0.1%磷酸）（A）?水（含0.1%磷酸）（B），梯度洗脫（0～22 min，9%A；22～23 min，9%～14%A；23～55 min，14%A；55～85 min，14%～28%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫20 ℃；檢測波長277 nm（甘草苷、黃芩苷、連翹苷）、330 nm（綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、連翹酯苷A）；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取咖啡酸、甘草苷、綠原酸、連翹酯苷A、阿魏酸、蘆丁、黃芩苷、連翹苷對照品適量，甲醇稀釋，搖勻，濾過，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為7.71、18.45、31.03、17.19、5.50、8.18、93.94、9.38 μg／mL），在4 ℃下避光保存。

2.2.2 供試品溶液 取膠囊內(nèi)容物適量，取約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得，在4 ℃下避光保存。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例，制備缺菊花、金銀花、甘 草、連翹、黃芩的陰性樣品，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性考察與專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰峰形良好，陰性無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1、3、5、10、15、20 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得各成分峰面積RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各成分峰面積RSD 均小于2.0%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批膠囊（批號181101）2 g，共6 份，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各成分含有量RSD 均小于2.0%，表明該方法重復(fù)性好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含有量已知的膠囊（批號181101）內(nèi)容物約1 g，共6 份，精密稱定，置于50 mL 錐形瓶中，加入對照品溶液適量，再精密加入50 mL 70%甲醇，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、甘草苷、蘆丁、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷平均加 樣回收 率（RSD）分別為 101.8%（0.7%）、102.6%（1.8%）、103.9%（1.5%）、96.9%（2.2%）、101.8%（0.9%）、99.9%（2.4%）、101.3%（2.5%）、102.8%（2.2%）。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.9 樣品含有量測定 取6 批膠囊，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，外標(biāo)法計算含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測定結(jié)果（μg／g）Tab.2 Results of content determination of various constituents（μg／g）

3 討論

3.1 檢測波長篩選 本實(shí)驗(yàn)采用PDA 檢測器，在210～400 nm 波長處進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)甘草苷、黃芩苷、連翹苷在277 nm 處有較強(qiáng)吸收，而綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、連翹酯苷A 在330 nm 處有較強(qiáng)吸收。因此，確定檢測波長為277、330 nm。

3.2 流動相篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈?磷酸［11］、甲醇?磷酸［12?13］、甲醇?冰醋酸［14］、甲醇?甲酸［9］等流動相，發(fā)現(xiàn)以乙腈?水（含0.1% 磷酸）洗脫時各成分均實(shí)現(xiàn)良好分離，與相鄰峰無干擾。另外，在乙腈中加入0.1%磷酸后各成分色譜峰峰形更對稱，系統(tǒng)穩(wěn)定性更好，可應(yīng)用于分析時間較長的多成分含有量測定［15］。

3.3 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溶劑（70% 甲醇、90% 甲醇）、提取方法（超聲、加熱回流）、提取時間（30 min、1 h）的效果，發(fā)現(xiàn)2 種提取方法下各成分含有量相差不大，從操作簡便的角度考慮，選擇超聲提??；70%甲醇提取時，各成分提取率最高；2 種超聲時間對提取影響不大。最終確定，供試品溶液制備方法為70%甲醇超聲提取30 min。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時測定退赤膠囊中綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、甘草苷、蘆丁、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷的含有量，該方法簡便可靠，重復(fù)性好，可用于該制劑質(zhì)量控制。