香菇草根部浸提液對(duì)偽魚腥藻化感作用的研究

周利，姚苗苗，匡兵，高靜思，朱佳

1. 青島理工大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，青島 266033

2. 山東省調(diào)水工程運(yùn)行維護(hù)中心青島分中心，青島 266033

3. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)深圳研究生院，深圳 518055

4. 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院建筑與環(huán)境工程學(xué)院，深圳 518055

0 前言

水體富營養(yǎng)化已經(jīng)成為嚴(yán)重的水環(huán)境問題之一，2012年Tian等[1]在研究中國的南四湖時(shí)發(fā)現(xiàn)偽魚腥藻(Pseudanabaenasp.)為優(yōu)勢(shì)種，占比高達(dá) 32.94%，之后在中國的東平湖[2]，豐慶湖[3]等均發(fā)現(xiàn)偽魚腥藻占優(yōu)勢(shì)。偽魚腥藻屬于藍(lán)藻門，常見于淡水魚蝦池和水庫中[4-7]，一般作為微囊藻的伴生種一起在富營養(yǎng)化水體中形成水華[8]。可產(chǎn)生典型嗅味物質(zhì) 2-甲基異莰醇(2-MIB)[9-10]，Teneva等[11]證實(shí)了它還可以產(chǎn)生神經(jīng)毒素和肝毒素，需要引起足夠的關(guān)注和重視。

化感作用是植物產(chǎn)生的次代謝物質(zhì)進(jìn)入到環(huán)境中從而對(duì)生物的生長產(chǎn)生作用[12]?；幸衷逵捎诰邆渖锝到庑院谩⒉晃廴经h(huán)境，經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種頗有前景的控藻方式[13-14]。近年來，關(guān)于化感作用在水生生態(tài)系統(tǒng)中的研究十分活躍，也發(fā)現(xiàn)了多種能夠抑制藻類生長的水生植物，如菖蒲(Acorus calamus L.)、梭魚草(Pontederia cordata)、南美蟛蜞菊(Wedelia trilobata)、美人蕉(Canna indica)[15-18]等。香菇草(Hydrocotyle vulgaris)也被證實(shí)化感作用明顯[19]，朱嘉成[20]2014年發(fā)現(xiàn)香菇草對(duì)銅綠微囊藻有明顯的化感抑制作用，但關(guān)于香菇草對(duì)偽魚腥藻化感作用的研究還未見報(bào)道。香菇草是傘形科(Umbelliferae)天胡荽屬(Hydrocotyle)多年生草本，原產(chǎn)于歐美的挺水或濕生觀賞植物，國內(nèi)多用做觀賞植物[21]，多分枝，節(jié)生根且根莖發(fā)達(dá)[22]，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，生物量大[19]，具有良好的應(yīng)用前景。本文通過設(shè)置不同的香菇草根部浸提液的投加量，來研究香菇草根部浸提液對(duì)偽魚腥藻的化感作用，以期為防控偽魚腥藻提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)植物香菇草來自于深圳市南山花卉世界，長勢(shì)均勻，生長良好，無病蟲害，植株高約 10—20 cm，購買后將香菇草用自來水沖洗干凈，置于無菌玻璃瓶中，用 BG11培養(yǎng)基培養(yǎng) 2天，排除外界條件對(duì)試驗(yàn)的干擾。試驗(yàn)所需偽魚腥藻(FACHB-1277)購自中科院水生生物研究所淡水藻種庫。試驗(yàn)正式開始前將偽魚腥藻藻種擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長期，并反復(fù)接種擴(kuò)大培養(yǎng)，待藻種數(shù)量達(dá)到試驗(yàn)用量后接種試驗(yàn)。試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基，經(jīng)高溫高壓滅菌后使用。

1.2 試驗(yàn)方法

浸提液的制備:將新鮮的香菇草根部分離后，取100 g 于60 ℃下干燥48 h后研磨成粉末，然后用500 mL的 BG11培養(yǎng)基浸泡 48 h，離心去除殘?jiān)?，上清液先用定量濾紙過濾，再經(jīng)孔徑為0.2 μm 濾膜減壓抽濾排除微生物的影響，所得濾液即為浸提液母液，其香菇草根部浸提液濃度為200 g·L-1(以香菇草根部鮮重計(jì))，置于冰箱(4 ℃)中貯存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)設(shè)置:在無菌條件下將香菇草根部浸提液、藻種置于500 mL錐形瓶內(nèi)，加入BG11 培養(yǎng)基使培養(yǎng)體系總體積為 250 mL，藻葉綠素 a濃度為 90 μg·L-1，香菇草根部浸提液添加量分別為 0、2 g·L-1，4 g·L-1，6 g·L-1，8 g·L-1、10 g·L-1(以香菇草根部鮮重計(jì))共6個(gè)處理組，每組設(shè)三個(gè)平行。

培養(yǎng)條件: 試驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，光照強(qiáng)度2500 lx，光暗比 12 h:12 h，溫度 25 ℃，每天定時(shí)手動(dòng)搖瓶3次，并任意交換錐形瓶位置，以減少由于培養(yǎng)箱內(nèi)光照不均勻而產(chǎn)生的試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)所用所有玻璃器皿均經(jīng)121 ℃，20 min高溫滅菌后使用。

1.3 檢測(cè)儀器及檢測(cè)參數(shù)

試驗(yàn)期間，采用調(diào)制熒光儀(PHYTO-PAM，Walz 公司，德國)檢測(cè)偽魚腥藻的ρ(Chl a)及藻細(xì)胞PSⅡ(光合系統(tǒng)Ⅱ)的光合活性。采用分光光度計(jì)及相關(guān)試劑盒(A001-1 南京建成生物工程研究所)測(cè)定SOD活性。

表1 香菇草根部浸提液濃度Table 1 The concentration gradient of water extract of Hydrocotyle vulgaris root

測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)前將樣品暗適應(yīng)5 min，各參數(shù)可在儀器上直接讀出。PS Ⅱ光合活性的參數(shù): 1.Fv/Fm表示最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，在光抑制條件下，F(xiàn)v/Fm的降低表明藻類受到了環(huán)境的脅迫。2.rETR為光抑制時(shí)的相對(duì)電子傳遞速率，相當(dāng)于一定光強(qiáng)下單位生物量內(nèi)的光合作用速率。以葉綠素a的濃度〔ρ(Chl a)〕來反映藻細(xì)胞密度，采用特征熒光法測(cè)定ρ(Chl a)，即每天定時(shí)采用調(diào)制熒光儀直接測(cè)定，該方法便捷高效。

1.4 數(shù)據(jù)處理

香菇草根部浸提液對(duì)藻類的抑制率計(jì)算:IR=(1-N/N0)×100，式中:IR為抑制率%；N, N0分別為試驗(yàn)組和對(duì)照組ρ(Chl a)，μg·L-1。

藻的比生長速率計(jì)算:μ= (lnX2-lnX1) /(T2-T1)，式中T1、T2為培養(yǎng)時(shí)間，X1、X2為培養(yǎng)T1、T2時(shí)間的偽魚腥藻ρ(Chl a)，μg·L-1。

EC50值是藻細(xì)胞生長抑制率為 50%時(shí)香菇草根部浸提液的濃度。以藻類ρ(Chl a)的變化作為衡量藻類活力的毒理響應(yīng)指標(biāo)，香菇草浸提液濃度取10的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，通過查生物統(tǒng)計(jì)機(jī)率值換算表，以ρ(Chl a)抑制率對(duì)應(yīng)的機(jī)率值作為縱坐標(biāo)，求出回歸方程，以抑制率為 50%時(shí)對(duì)應(yīng)的機(jī)率值求出EC50的值[23]。

利用 Microsoft Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同香菇草根部浸提液濃度對(duì)偽魚腥藻葉綠素a濃度的影響

偽魚腥藻與不同濃度的香菇草根部浸提液共培養(yǎng)22天后有不同程度的生長。由圖1可見，在前4天，各試驗(yàn)組處于穩(wěn)定期，第 4—10天各試驗(yàn)組出現(xiàn)緩慢增長，第 10天之后均進(jìn)入了對(duì)數(shù)增長期，且各試驗(yàn)組偽魚腥藻生長出現(xiàn)了較為明顯的差距。添加低濃度香菇草根部浸提液(2 g·L-1，4 g·L-1)的試驗(yàn)組和對(duì)照組偽魚腥藻ρ(Chl a)數(shù)值區(qū)別不大，且趨勢(shì)相近，促進(jìn)和抑制效果均不明顯。添加高濃度香菇草浸提液(6 g·L-1，8 g·L-1，10 g·L-1)的試驗(yàn)組偽魚腥藻的生長則出現(xiàn)不同程度的抑制作用。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)添加量為 0，2 g·L-1，4 g·L-1，6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1的試驗(yàn)組ρ(Chl a)分別為 7171.18 μg·L-1，6727.15 μg·L-1，6942.45 μg·L-1，4873.97 μg·L-1，3357.73 μg·L-1和 2437.08 μg·L-1。

各試驗(yàn)組應(yīng)用ρ(Chl a)計(jì)算得到的藻類生長比增長速率如圖2所示。將添加量按照偽魚腥藻比增長速率從高到低排列依次為: 0，4 g·L-1，2 g·L-1，6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1。最高比增長速率為 0.187 d-1，最低比增長速率為 0.143 d-1。

由圖3可見，各試驗(yàn)組ρ(Chl a)抑制率差異顯著，10 g·L-1添加量組最高，其次是 8 g·L-1和 6 g·L-1，最后為 2 g·L-1和 4 g·L-1。低濃度組(2 g·L-1和 4 g·L-1)在培養(yǎng)期內(nèi)出現(xiàn)了促進(jìn)藻細(xì)胞葉綠素a增長的現(xiàn)象。吳湘等[24]在研究黃花水龍對(duì)銅綠微囊藻化感作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)低濃度組的化感物質(zhì)在試驗(yàn)開始 1—2 d 內(nèi)對(duì)藻細(xì)胞生長反而起促進(jìn)作用，肖晗等[25]也發(fā)現(xiàn)低濃度海菖蒲浸提液對(duì)錐狀斯氏藻起促進(jìn)作用。添加量2 g·L-1組IR變化在-11.98%—9.88%之間，添加量4g·L-1組IR變化在-10.92%—8.60%之間，因此低濃度添加量組整體對(duì)藻葉綠素a作用效果不明顯。高濃度處理組(6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1)在培養(yǎng)期一直表現(xiàn)為抑制，最后一天抑制出現(xiàn)了下降趨勢(shì)。最高抑制率為 73.43%(添加量 10 g·L-1，第 8 天時(shí))。

圖1 不同香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻葉綠素a的濃度Figure 1 The ρ(Chl a) of Pseudanabaena sp. under different concentrations of water extract of Hydrocotyle vulgaris root

圖2 第22天時(shí)不同香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻的比生長速率Figure 2 Specific growth rates of Pseudanabaena sp. under different concentrations of water extract of Hydrocotyle vulgaris root on the 22 day

圖3 不同香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻的葉綠素a抑制率Figure 3 The ρ(Chl a) inhibition rates of Pseudanabaena sp.under different concentrations of water extract of Hydrocotyle vulgaris root

2.2 不同香菇草根部浸提液濃度對(duì)偽魚腥藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

圖4為不同香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm的變化?？梢钥闯鯢v/Fm總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)，添加量為 4 g·L-1，6 g·L-1，8 g·L-1，10 g·L-1的試驗(yàn)組Fv/Fm值在第三天達(dá)到了峰值，10 g·L-1的值最大為 0.38，說明在初始階段，香菇草根部浸提液對(duì)偽魚腥藻有刺激作用，使得偽魚腥藻最大光化學(xué)量子產(chǎn)量產(chǎn)生快速的變動(dòng)，之后由于藻自身的調(diào)節(jié)系統(tǒng)趨于穩(wěn)定。各組在第五天之后整體呈下降趨勢(shì)，對(duì)照組的下降趨勢(shì)最為緩慢，在第 13 天之后Fv/Fm值始終高于其他試驗(yàn)組，整個(gè)培養(yǎng)期Fv/Fm變化范圍0.23—0.32。添加量為 2 g·L-1，4 g·L-1和 6 g·L-1三組Fv/Fm變化趨勢(shì)較為相似，在 11天之后Fv/Fm值低于對(duì)照組，大于添加量8 g·L-1，10 g·L-1的試驗(yàn)組。添加量8 g·L-1，10 g·L-1試驗(yàn)組的下降趨勢(shì)最大，第 7天之后，添加量為8 g·L-1的試驗(yàn)組Fv/Fm始終大于添加量為10 g·L-1的試驗(yàn)組，添加量為8 g·L-1試驗(yàn)組的Fv/Fm變化范圍為 0.35—0.12，添加量為 10 g·L-1試驗(yàn)組的Fv/Fm變化范圍 0.38—0.08。結(jié)合圖 5，10 g·L-1添加量下0—14天Fv/Fm抑制率穩(wěn)步上升，14天之后穩(wěn)定在40%左右，而最大抑制率為44.44%。

圖4 香菇草根部浸提液對(duì)偽魚腥藻最大光化學(xué)量子產(chǎn)量的影響Figure 4 The effects of water extract of Hydrocotyle vulgaris root on Fv/Fm of Pseudanabaena sp.

圖5 10 g·L-1香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻最大光化學(xué)量子產(chǎn)量抑制率Figure 5 Inhibition rates of the Fv/Fm of Pseudanabaena sp. under 10 g·L-1 water extract of Hydrocotyle vulgaris root

不同香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻最大相對(duì)電子傳遞速率rETR如圖6所示，與Fv/Fm變化趨勢(shì)相似。對(duì)照組偽魚腥藻最大相對(duì)電子傳遞速率數(shù)值在 72—86.7之間上下波動(dòng)，整體較為平穩(wěn)?；形镔|(zhì)添加量為 2 g·L-1，4 g·L-1和 6 g·L-1的試驗(yàn)組rETR值變化趨勢(shì)基本一致且數(shù)值差別不大，且第 5天之后，數(shù)據(jù)都低于對(duì)照組。添加量為 8 g·L-1，10 g·L-1的試驗(yàn)組偽魚腥藻的下降趨勢(shì)最大，第6天之后，添加量為 8 g·L-1的試驗(yàn)組rETR始終大于添加量為 10 g·L-1的試驗(yàn)組，添加量為 8 g·L-1試驗(yàn)組的rETR變化范圍為59—87.3，添加量為10 g·L-1試驗(yàn)組的rETR變化范圍52—86.1。由圖7可以看出，添加量為10g·L-1抑制率隨時(shí)間延長波動(dòng)上升，最后穩(wěn)定在20%上下，最大抑制率可達(dá)到28.63%。

2.3 不同香菇草根部浸提液濃度對(duì)偽魚腥藻酶活性的影響

圖6 香菇草根部浸提液對(duì)偽魚腥藻電子相對(duì)傳遞速率的影響Figure 6 The effects of water extract of Hydrocotyle vulgaris root on rETR of Pseudanabaena sp.

圖7 10 g·L-1香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻電子相對(duì)傳遞速率抑制率Figure 7 Inhibition rates of the rETR of Pseudanabaena sp.under 10 g·L-1 water extract of Hydrocotyle vulgaris root

圖8 第 13天時(shí)不同香菇草根部浸提液濃度下偽魚腥藻SOD活性Figure 8 The SOD activities of Pseudanabaena sp. under different concentrations of water extract of Hydrocotyle vulgaris root on the 13th day

圖8為試驗(yàn)第13天時(shí)不同香菇草根部浸提液添加量下偽魚腥藻SOD活性?？梢钥闯龈髟囼?yàn)組SOD活性都大于對(duì)照組，且添加量越高，SOD升高越大。添加量為 10 g·L-1的試驗(yàn)組 SOD 值為 6.627 U·mg-1，遠(yuǎn)大于對(duì)照組SOD值0.623 U·mg-1，說明藻細(xì)胞生長受到了外界極大脅迫。

3 討論

化感作用的抑藻機(jī)理主要是破壞藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，改變光合作用，影響生物體酶的活性，改變核酸代謝等[12]。本研究結(jié)果表明，香菇草根部浸提液濃度從6 g·L-1的試驗(yàn)組開始對(duì)偽魚腥藻產(chǎn)生持續(xù)明顯的化感抑制效果，(EC50，96h)值為 9.33 g·L-1。李慶華等[26]研究柳樹葉浸提液化感抑藻效應(yīng)，結(jié)果表明對(duì)蛋白核小球藻有顯著的化感抑制作用，半效應(yīng)濃度(EC50，96h) 值為 11.82 g·L-1，白羽等[27]研究發(fā)現(xiàn)加拿大一枝花對(duì)銅綠微囊藻具有化感抑制作用，(EC50，72h)值為 9.57 g·L-1，表明香菇草根部浸提液具有抑制水華藍(lán)藻的潛能，在篩選植物來化感抑制藻類水華方面值得引起關(guān)注。

在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)低濃度的香菇草根部浸提液組(2 g·L-1，4 g·L-1)對(duì)偽魚腥藻ρ(Chl a)的促進(jìn)或抑制 效 果 不 明 顯 ，而 高 濃 度 添 加 量 組 (6 g·L-1，8 g·L-1，10 g·L-1)ρ(Chl a)顯著低于對(duì)照組，最高抑制率可達(dá) 73.43%(添加量 10 g·L-1，第 8 天時(shí))。有報(bào)道稱附著在鳳眼蓮根部的藻細(xì)胞中葉綠素a 濃度明顯下降，而它的降解產(chǎn)物脫鎂葉綠素 a酸酯的含量顯著升高，表明鳳眼蓮抑藻成分可能促進(jìn)了葉綠素 a的降解[28]。由此推測(cè)高濃度的香菇草根部浸提液可能促進(jìn)藻類葉綠a的降解，減少藻類的同化產(chǎn)物，進(jìn)而抑制偽魚腥藻的生長。添加量為6 g·L-1，8 g·L-1和10 g·L-1組在培養(yǎng)到第22天偽魚腥藻葉綠素a抑制率明顯低于第16天時(shí)，造成這種現(xiàn)象的原因有可能是香菇草的抑藻成分不穩(wěn)定，易分解或者具有揮發(fā)性，亦或是抑藻成分被藻細(xì)胞吸收。添加量為 6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1組比生長速率分別為 0.173 d-1，0.158 d-1和0.143 d-1?？梢婋S著香菇草根部浸提液濃度的增加，其抑藻效果逐漸增強(qiáng)。

在整個(gè)培養(yǎng)周期加入化感物質(zhì)的試驗(yàn)組，F(xiàn)v/Fm，rETR整體都低于對(duì)照組，可以推測(cè)，香菇草根部浸提液會(huì)影響藻類的光合系統(tǒng)，降低光合系統(tǒng)的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量和相對(duì)電子傳遞速率，進(jìn)而達(dá)到降低生物量的效果。杜彩麗等[29]研究發(fā)現(xiàn)高濃度的蟛蜞菊水提液嚴(yán)重破壞了藻細(xì)胞內(nèi)部的類囊體膜和氣囊等結(jié)構(gòu)，類囊體膜的溶解會(huì)導(dǎo)致葉綠素和藻膽體等光合色素失去載體，氣囊的破壞將造成細(xì)胞沉降，不利于光合作用。這可能是造成高濃度香菇草根部浸提液下偽魚腥藻最大光化學(xué)量子產(chǎn)量和相對(duì)電子傳遞速率明顯減小的原因。添加量10 g·L-1的Fv/Fm和rETR值顯著低于對(duì)照組，且數(shù)值最低，與葉綠素a結(jié)果一致。說明10 g·L-1試驗(yàn)組偽魚腥藻受到外界的威脅最大。高濃度組(6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1)偽魚腥藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)都小于對(duì)照組，藻類的光合速率減弱，推測(cè)香菇草根部浸提液通過降低藻的光合速率來達(dá)到化感抑藻的效果。Fv/Fm最大抑制率為 44.44%(添加量為 10 g·L-1，第 16 天時(shí))，rETR最大抑制率為28.68%(添加量為10 g·L-1，第20天時(shí))，可能化感作用對(duì)Fv/Fm的抑制效果強(qiáng)于rETR。

本試驗(yàn)研究中，SOD的活性隨著香菇草根部浸提液添加量的增多而應(yīng)激性增加，表明香菇草根部浸提液添加量越多，偽魚腥藻受到的威脅越大，化感作用越強(qiáng)。低濃度(2 g·L-1，4 g·L-1)組 SOD 值較對(duì)照組略有上升，可見低濃度香菇草根部浸提液對(duì)偽魚腥藻有一定的脅迫致使一定量的氧自由基產(chǎn)生，但 SOD也隨之呈現(xiàn)一定的應(yīng)激活性來對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，這可能是低濃度香菇草根部浸提液對(duì)偽魚腥藻化感作用不明顯的原因。當(dāng)添加量上升到 6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1時(shí)，SOD的活性大幅度升高，說明藻類已經(jīng)受到了較大的威脅，使細(xì)胞內(nèi)的氧自由基過量產(chǎn)生，雖然 SOD活性隨之上升，但機(jī)體本身的抗氧化體系已經(jīng)不能完成清除氧自由基，活性氧大量累積可造成植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)生過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，使機(jī)體功能受損[30]，最終抑制偽魚腥藻生長，由此推測(cè)過藻細(xì)胞氧化損傷為香菇草根部浸提液的化感抑藻機(jī)理之一。

本研究發(fā)現(xiàn)添加量為 6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1的香菇草根部浸提液對(duì)偽魚腥藻有化感抑制作用，表現(xiàn)為偽魚腥藻生物量的減少，藻光合系統(tǒng)受損以及對(duì)藻抗氧化體系酶有一定影響，其抑藻能力隨著香菇草根部浸提液添加量增多而增強(qiáng)，因此香菇草可作為一種潛在生態(tài)控藻生物，為控制偽魚腥藻水華發(fā)生提供一種新思路。需要說明的是，本試驗(yàn)是在排除細(xì)菌作用，光照不勻，營養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)等條件下進(jìn)行的，與自然水體環(huán)境條件尚不能完全吻合，究竟香菇草根部浸提液在實(shí)際生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)藻類的影響如何，還需進(jìn)一步研究。