脂多糖對(duì)河南華溪蟹免疫能力的調(diào)節(jié)作用

周妍英 王蘭

摘要：以河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）血淋巴細(xì)胞為材料，不同濃度脂多糖（1.0、2.0、4.0和8.0μg/mL）分別刺激溪蟹12h、24h后，收集各處理組溪蟹血淋巴細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定酸性磷酸酶（ac-id phosphatase ， ACP ）、 堿性鱗酸酶（alkaline phosphatase ， AKP） 和 溶菌酶（lysozyme ， LSZ） 等溶酶體酶的活性及酚氧化酶（Phenoloxidase，P0）的活性;采用中性紅染色法測(cè)定溶酶體膜的穩(wěn)定性;采用實(shí)時(shí)焚光定量PCR法檢測(cè)紛氧化酶原（prophenoloxidase，proPO）、溶菌酶2個(gè)基因mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明：與空白對(duì)照組相比，注射脂多糖后，溪蟹血淋巴細(xì)胞酸性磷酸酶、堿性嶙酸酶、溶菌酶活性和酚氧化酶活性均有所升高;溶酶體酶膜穩(wěn)定性下降;在脂多糖注射24h后，酚氧化酶原和溶菌酶mRNA表達(dá)水平均有顯著上調(diào)。可見(jiàn)，脂多糖可以誘導(dǎo)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞溶酶體穩(wěn)定性下降并且釋放其中的溶酶體酶，免疫相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)，在一定程度上對(duì)溪蟹免疫能力有增強(qiáng)效果。

關(guān)鍵詞：免疫能力;脂多糖;河南華溪蟹

中圖分類(lèi)號(hào) S948 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2020）16-0128-05

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境和新陳代謝等急劇變化的應(yīng)激條件容易對(duì)各類(lèi)水生動(dòng)物造成疾病，甚至死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。以往使用各種抗生素來(lái)防治水生動(dòng)物養(yǎng)殖病害，其負(fù)面影響較為嚴(yán)重，我國(guó)相關(guān)部門(mén)已逐步限制其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的使用。近年來(lái)，對(duì)水生動(dòng)物尤其是蟹類(lèi)免疫機(jī)理的深入探索和認(rèn)識(shí)，加上對(duì)免疫增強(qiáng)劑的研究，為水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害防治開(kāi)辟了一條新的思路[1]。為了防控水產(chǎn)養(yǎng)殖中出現(xiàn)的病害，國(guó)內(nèi)外的一些學(xué)者開(kāi)始將關(guān)注點(diǎn)投向了免疫增強(qiáng)劑。目前發(fā)現(xiàn)，多種化合物已經(jīng)作為免疫增強(qiáng)劑投入到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[2-3]。

目前發(fā)現(xiàn)，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，不僅可以引起機(jī)體體液免疫應(yīng)答，也可以提高機(jī)體的非特異性免疫功能，有效增強(qiáng)蝦蟹類(lèi)、魚(yú)類(lèi)免疫能力[4-7]，效果明顯，已被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的相關(guān)研究。研究表明，脂多糖可以分別激活凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）[5]、中華絨螯蟹（Eriocheir si-nensis）[6]酚氧化酶原系統(tǒng)釋放酚氧化酶（Phenoloxidase，PO），進(jìn)而將酚氧化成醌，最終形成黑色素，黑色素能夠使外來(lái)病菌和宿主隔離，從而達(dá)到免疫效果。還有文獻(xiàn)表明，脂多糖刺激鋸緣青蟹（Scylla paramamosain）血淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)酶活性升高[7]，血細(xì)胞吞噬功能也增強(qiáng)。脂多糖作為飼料添加劑可以增加黑虎蝦（Alpheus bellulus）的存活率，誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào)[8]。王玉芬等[9]研究指出，竹筍多糖能增強(qiáng)中華絨螯蟹（Eriocheir si-nensis）的非特異性免疫反應(yīng)，可添加在中華絨螯蟹詞料里來(lái)提高其免疫功能。趙紫越等[10]報(bào)道，黃芪多糖可以誘導(dǎo)中華絨螯蟹血細(xì)胞中的抗脂多糖因子、抗菌肽、酚氧化酶和Toll樣受體基因表達(dá)水平普遍上調(diào)，提高了蟹體免疫能力。此外，大黃多糖刺激擬穴青蟹（Scyllparamamo-sain）后，血清中非特異性免疫指標(biāo)活性均顯著提高[11]。

甲殼動(dòng)物缺乏免疫球蛋白，其體液免疫主要是一些非特異性的酶或其他免疫因子來(lái)共同完成的。據(jù)報(bào)道，甲殼動(dòng)物血淋巴細(xì)胞主要分為顆粒細(xì)胞和無(wú)顆粒細(xì)胞兩大類(lèi)，體液免疫因子酚氧化酶一般以酶原的形式即存在于顆粒細(xì)胞中[12，13]。當(dāng)血細(xì)胞脫顆粒時(shí)，將酚氧化酶原釋放到胞外，被激活轉(zhuǎn)變成有活性的酚氧化酶。還有研究報(bào)道，溶酶體是甲殼動(dòng)物血淋巴細(xì)胞中重要的亞細(xì)胞器。在一些外來(lái)物的刺激作用下，溶酶體酶的膜很容易破裂而釋放出其中的水解酶（酸性磷酸酶（acid phospha-tase，ACP ）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase ，AKP） 和溶菌酶（lysozyme，LSZ）等），進(jìn)一步發(fā)揮免疫作用[14]。本研究以河南華溪蟹（Sinopotamon henaneme）血淋巴細(xì)胞為試驗(yàn)材料，用脂多糖作為免疫刺激劑，研究其對(duì)溪蟹免疫相關(guān)酶（酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶和酚氧化酶）活性、溶酶體膜的穩(wěn)定性、溶菌酶和酚氧化酶原基因mRN-NA表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用，探索脂多糖對(duì)溪蟹免疫功能的影響，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 河南華溪蟹購(gòu)自太原市五龍口水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。采用曝氣自來(lái)水，于循環(huán)系統(tǒng)的水族缸中暫養(yǎng)兩周以上，溫度為15～18℃，連續(xù)充氣，養(yǎng)殖密度為4～5只/L，每2d喂食1次。

1.1.2 主要試劑 脂多糖（E. Coli，055： B5，L2880，Sig-ma）;中性紅（Sigma）;乙醇、氯仿和異丙醇均為分析純;四種酶的活性及蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所?？俁NA提取試劑盒（RNA isoPlus）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒PremkTaqTM（Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye）均為T(mén)akara試劑盒。ProO、LSZ和內(nèi)參基因β-actin的引物均由上海生工有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 超低溫冰箱（Thermo Forma，美國(guó)）;冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5804R，德國(guó)）;多功能酶標(biāo)儀（Spec-tra max，M5，美國(guó)）。普通PCR儀（Eppendorf Mastercyclergradient，德國(guó)）、凝膠成像系統(tǒng)（Alpha FluorChem HD2，美國(guó)）、微量分光光度計(jì)（Eppendorf，Hamburg，德國(guó)）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI 7500，美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 暫養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)選取健康活潑和個(gè)體大小一致（平均濕重為20.0±0.5g）的，附肢完整的溪蟹個(gè)體，分成5組，每組10只個(gè)體。設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組（無(wú)菌生理鹽水）和4個(gè)脂多糖作用組，濃度分別是1.0、2.0、4.0和8.0μg/mL，刺激12h、24h，取血淋巴進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 樣品制備 將每組溪蟹個(gè)體分別置于冰上，用無(wú)菌注射器從溪蟹第4步足基部抽取血淋巴，將所取得的血液與等體積的抗凝劑同時(shí)裝入離心管混勻，離心棄上清，制成106的細(xì)胞懸液，0.5mL的樣品經(jīng)液氮速凍，以備提取RNA用;一部分用于溶酶體膜穩(wěn)定性的測(cè)定;剩余的樣品-80℃保存，待用。

1.2.3 溶酶體膜的穩(wěn)定性將20μL的血細(xì)胞懸浮液放入離心管中，每管加入40μL的中性紅溶液（用TBS緩沖液配制成0.33%的液體），在10℃孵育2h，200g離心5min，用TBS緩沖液洗滌;加入200μL的混合液（1%冰醋酸：50%乙醇=1：1）混勻后，孵育。在多功能酶標(biāo)儀上，測(cè)定其吸光值，結(jié)果用O.D./mg/mL蛋白來(lái)表示。

1.2.4 酶活性測(cè)定 ACP、AKP、LSZ和P0活性均依據(jù)南京建成試劑盒中說(shuō)明書(shū)中的方法來(lái)測(cè)定。

1.2.5 proPO，LSZ mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)以所有處理組合成的cDNA為模板，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量試驗(yàn)。每個(gè)樣品重復(fù)3次進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)結(jié)果由公式2-△△Ct計(jì)算出基因的表達(dá)量。試驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0中的AN0VA法對(duì)各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，其中P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異。用軟件Origin 10.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂多糖對(duì)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞溶酶體膜穩(wěn)定性的影響 由圖1可知，脂多糖刺激溪蟹12h，血淋巴細(xì)胞溶酶體膜的穩(wěn)定性有所下降，其中，當(dāng)脂多糖濃度是4.0μg/mL時(shí)，溶酶體膜的穩(wěn)定性較對(duì)照組相比顯著下降。脂多糖刺激溪蟹24h，脂多糖濃度分別是4.0和8.0μg/mL時(shí)，與對(duì)照組相比，血淋巴細(xì)胞溶酶體膜的穩(wěn)定性極顯著下降（P<0.01）。

2.3 脂多糖對(duì)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞酚氧化酶原基因表達(dá)水平的影響 由圖3可知，脂多糖刺激溪蟹后，血淋巴細(xì)胞中酚氧化酶原基因表達(dá)水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在脂多糖（2.0、4.0和8.0μg/mL）作用12h時(shí)，酚氧化酶原

2.2 脂多糖對(duì)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞ACP、AKP、LZM及PO活性的影響 由圖2可知，溪蟹血淋巴細(xì)胞中酸性磷酸酶活性隨著脂多糖注射濃度增加而逐漸升高，在脂多糖為4.0和8.0μg/mL時(shí)，酸性磷酸酶活性顯著升高。堿性磷酸酶活性和溶菌酶活性變化與酸性磷酸酶活性變化趨勢(shì)大體上一致（圖2B、2C）。當(dāng)脂多糖注射時(shí)間延長(zhǎng)至24h，除低濃度組（1.Oμg/mL）外，其他脂多糖濃度組作用下，堿性磷酸酶活性出現(xiàn)了極顯著升高（P<0.01）。溶菌酶活性在較高濃度的脂多糖（4.0和8.0μg/mL）作用時(shí)，也出現(xiàn)了顯著升高現(xiàn)象（P<0.05或者P<0.01）。從圖2D看出，隨著脂多糖作用時(shí)間延長(zhǎng)，酚氧化酶活性一直升高。當(dāng)脂多糖濃度是4.0μg/mL時(shí)，其活性達(dá)到峰值，在較高濃度8.0μg/mL時(shí)，酚氧化酶活性有所下降?；虮磉_(dá)水平分別是對(duì)照組的3.6、5.5、5.6倍。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至24h，酚氧化酶原基因表達(dá)水平一直升高，在較高濃度時(shí)，其表達(dá)水平達(dá)到對(duì)照組的8.6倍。

2.4 脂多糖對(duì)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞溶菌酶基因表達(dá)水平的影響 由圖4可知，在脂多糖（2.0和8.0μg/mL）作用12h時(shí)，溶菌酶基因表達(dá)水平分別是對(duì)照組的3.3和5.5倍（P<0.01）。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至24h，溶菌酶基因表達(dá)水平一直升高，在較高濃度（8.0μg/mL）時(shí)，其表達(dá)水平達(dá)到對(duì)照組的6.7倍。注射脂多糖后，溪蟹血淋巴細(xì)胞中溶菌酶基因表達(dá)水平整體上呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

3 討論

甲殼動(dòng)物的免疫機(jī)能主要依賴非特異性免疫，由血淋巴細(xì)胞或者從血淋巴細(xì)胞釋放出來(lái)的免疫因子來(lái)共同完成。其中，血淋巴細(xì)胞中的亞細(xì)胞器溶酶體在免疫識(shí)別和防御中起著重要作用。溶菌酶是甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)中的重要成分，能夠水解革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的多糖，并使之水解釋放出來(lái)，形成水解酶體系，破壞和消除入侵外來(lái)物。酸性磷酸酶是動(dòng)物體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶[15]，也是甲殼動(dòng)物溶酶體酶的重要組成部分，它可以通過(guò)水解表面帶有磷酸酯的異物而破壞異物。堿性磷酸酶活性的提高，可以加速相應(yīng)組織的物質(zhì)代謝，為機(jī)體提供所需的無(wú)機(jī)磷，積累更多的能量。楊季芳等人報(bào)道，從南極海洋寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌提取的脂多糖能顯著提高三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）血清中酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性[16]，免疫增強(qiáng)效果較好。同樣，本研究結(jié)果顯示，微量的脂多糖可以引起河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞溶酶體膜穩(wěn)定性下降，溶酶體酶（酸性磷酸酶和堿性磷酸酶）活性升高，這與謝鵬關(guān)于脂多糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞的研究結(jié)果也類(lèi)似[17]。文英等研究發(fā)現(xiàn)，大黃多糖刺激擬穴青蟹后，血清中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、酚氧化酶和溶菌酶等非特異性免疫指標(biāo)活性均顯著提高[11]，與本研究結(jié)果一致。

據(jù)報(bào)道，脂多糖可以刺激甲殼動(dòng)物血淋巴細(xì)胞脫顆粒釋放免疫因子如酚氧化酶來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫能力[18]。甲殼動(dòng)物體內(nèi)酚氧化酶激活系統(tǒng)在免疫識(shí)別和防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，該系統(tǒng)以非活化狀態(tài)存在于顆粒細(xì)胞中，脂多糖可引起細(xì)胞胞吐作用，激活酚氧化酶原系統(tǒng)，伴隨著大量免疫活性因子的產(chǎn)生，通過(guò)多條途徑參與免疫作用。Soderhall等曾報(bào)道了脂多糖可以促使機(jī)體產(chǎn)生一種激活蛋白酶，從而使無(wú)活性的酚氧化酶原轉(zhuǎn)化為有活性的酚氧化酶[19]。研究發(fā)現(xiàn)，大黃多糖刺激擬穴青蟹4d后，血細(xì)胞中的酚氧化酶原基因表達(dá)水平上調(diào)至對(duì)照組的2.1倍，酚氧化酶活性也顯著升高[11]。潘清清[20]。證實(shí)大黃多糖可顯著提高鋸緣青蟹血淋巴酚氧化酶活力，這與本論文中脂多糖刺激河南華溪蟹后，血淋巴細(xì)胞中酚氧化酶原表達(dá)水平上調(diào)，酚氧化酶活性也增加的結(jié)果相似。脂多糖可以通過(guò)改變梭子蟹血清中的溶菌酶活力及血細(xì)胞吞噬活性來(lái)提高梭子蟹的非特異性免疫功能[21]。還有研究報(bào)道，脂多糖能顯著提高三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）血清中溶菌酶活力[16]。尼羅羅非魚(yú)（Ore-chromis niloticus）在脂多糖刺激后，參與其非特異性免疫的結(jié)構(gòu)域接合子蛋白（TIRAP）基因表達(dá)上調(diào)[22]。本研究結(jié)果表明，注射脂多糖后，河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞中的溶菌酶基因表達(dá)水平上調(diào)，伴隨著溶菌酶活力也升高，這與上述報(bào)道結(jié)果是相同的。

綜上所述，脂多糖可以通過(guò)改變河南華溪蟹血清中的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶和酚氧化酶活力及免疫相關(guān)酶基因表達(dá)來(lái)提高溪蟹的非特異性免疫功能，但是否影響溪蟹血淋巴細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)，是否對(duì)非特異性免疫其他相關(guān)因子有影響，以及通過(guò)什么途徑來(lái)提高溪蟹免疫能力，還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)編：張宏民）

基金項(xiàng)目：山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（2019L0844）;忻州師范學(xué)院科研基金項(xiàng)目（2018KY20）。

作者簡(jiǎn)介：周妍英（1984-，女，山西人，博士，講師，研究方向：重金屬污染對(duì)水生動(dòng)物毒性效應(yīng)。 *通訊作者 收稿日期：2020-06-30