泰妙菌素高產(chǎn)菌的紫外誘變選育

陳亞蘭 陳德剛 張冰瑩

摘 要：為了進(jìn)一步提高泰妙菌素的發(fā)酵水平，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定生產(chǎn)菌T19-127L最佳種瓶培養(yǎng)時(shí)間為4d，最佳發(fā)酵周期為9d，最佳紫外照射時(shí)間為160s;采用紫外誘變技術(shù)，篩選到1株突變菌株，遺傳性狀穩(wěn)定;通過(guò)發(fā)酵搖瓶驗(yàn)證，其搖瓶效價(jià)為13352u·mL-1，比出發(fā)菌株（9605u·mL-1）提高39%，連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：泰妙菌素;紫外誘變;選育;效價(jià)

中圖分類(lèi)號(hào)：S-3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200930016

泰妙菌素（Tiamulin，TML）別稱(chēng)泰妙靈、支原凈等[1]，是一種常見(jiàn)的半合成的雙萜烯類(lèi)獸用抗生素[2]。TML是擔(dān)子菌側(cè)耳屬發(fā)酵得到截短側(cè)耳素后，再經(jīng)化學(xué)合成方法得到其氫化延胡索酸鹽，TML是首個(gè)截短側(cè)耳素（Pleuromulin）類(lèi)的獸用藥物[3]。

目前，為獲得滿(mǎn)足生產(chǎn)需求的目的菌株，常采用自然選育、誘變育種、全局轉(zhuǎn)錄工程等技術(shù)手段來(lái)改造菌株[4]。紫外線(xiàn)誘變（Ultraviolet Mutagenesis，UV mutagenesis）是常見(jiàn)的物理誘變方式，廣泛用于微生物菌種的誘變處理，并且有著悠久的歷史[5，6]。紫外線(xiàn)能量低，對(duì)核酸造成的傷害比較單一，具有操作簡(jiǎn)便、效率高、安全性好、誘變效率高等優(yōu)點(diǎn)，在避光條件下誘變結(jié)束后已產(chǎn)生突變的性狀不易恢復(fù)，因此應(yīng)用較廣泛[7，8]。UNDERT等[9]利用紫外線(xiàn)照射裂褶菌，獲得了3株突變株;MUKHERJEE等[10]利用紫外線(xiàn)處理的草菇原生質(zhì)體，獲得了4株形態(tài)發(fā)生突變的菌株和1個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株;鄭哲等人利用紫外誘變得到1株較出發(fā)菌株產(chǎn)纖維素酶活力提高了40.08%的突變菌株[11]。目前與擔(dān)子菌相關(guān)的紫外誘變育種的報(bào)道較少，本研究為擔(dān)子菌誘變育種提供了參考，也為工業(yè)生產(chǎn)提供了有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

泰妙菌素生產(chǎn)菌（Clitopilus prunulus），菌種號(hào)為T(mén)19-127L，由寧夏泰瑞制藥集團(tuán)股份有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面/平板培養(yǎng)基：葡萄糖40g·L-1、胰蛋白胨10g·L-1，瓊脂20g·L-1，pH自然。

種瓶培養(yǎng)基：葡萄糖50g·L-1、酵母提取物20g·L-1、MgSO4·7H2O 0.55g·L-1、FeSO4 0.05g·L-1、Ca（NO3）2 0.5g·L-1，pH 6.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60g·L-1、玉米漿25g·L-1、黃豆餅粉4g·L-1、MgSO4·7H2O 0.4g·L-1、CaCO3 0.9g·L-1、豆油0.6g·L-1，pH 6.7。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2014N分析天平，北京東南儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;LDZX-50KBS立式高壓滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng);HR40-A2生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司;MJX-160-Z霉菌培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng);FE20 PLUS pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;YT-CJ-2N雙人雙面凈化工作臺(tái)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司;HZQ-F280全溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市華美生化儀器廠(chǎng);PSX智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波萊福科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 T19-127L菌的活化和菌懸液的制備

無(wú)菌環(huán)境中，取約3cm2的菌絲斜面于研磨器中，加入適量的無(wú)菌水，充分研磨，使菌絲斷裂;吸取1mL研磨液于斜面，涂布均勻后，置于27℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.2 T19-127L菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

無(wú)菌環(huán)境中，取約3cm2的菌絲斜面于研磨器中，加入適量的無(wú)菌水，充分研磨，將其全部轉(zhuǎn)移至種瓶培養(yǎng)基，27℃、220r·min-1培養(yǎng)。每隔24h取1次樣，稱(chēng)取10g種瓶培養(yǎng)物于3000r·min-1離心10min，除去上清液，記錄沉淀質(zhì)量，計(jì)算菌濃。用菌濃反應(yīng)菌體的生長(zhǎng)情況，并繪制培養(yǎng)時(shí)間—菌濃曲線(xiàn)，菌濃的計(jì)算公式：

W=mM×100%（1）

式中，W為菌濃，%;m為沉淀的質(zhì)量，g;M為種瓶培養(yǎng)物質(zhì)量，g。

1.3.3 T19-127L發(fā)酵周期的測(cè)定

無(wú)菌環(huán)境中，按照10%的接種量將種瓶培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至發(fā)酵瓶，27℃、220r·min-1培養(yǎng)。每隔24h取1次樣，測(cè)定發(fā)酵液的pH和效價(jià)。

1.3.4 紫外誘變實(shí)驗(yàn)

無(wú)菌環(huán)境中，取約3cm2的菌絲斜面于研磨器中，加入適量的無(wú)菌水，充分研磨，制得菌懸液，備用。將菌懸液稀釋1000倍，取0.1mL稀釋液于培養(yǎng)皿，并涂布均勻，置于27℃培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)48h后，用紫外燈照射0s、10s、20s、40s、80s、160s、320s、420s（培養(yǎng)皿至紫外燈的垂直距離保持30cm，15W紫外燈），照射結(jié)束后繼續(xù)于27℃避光培養(yǎng)，防止光復(fù)活，平板計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，隨機(jī)選取單菌落制成試管斜面保藏，進(jìn)行效價(jià)驗(yàn)證。致死率的計(jì)算公式：

z=xX×100%（2）

式中，z為致死率，%;x為紫外線(xiàn)處理后的單菌落數(shù)，個(gè);X為對(duì)照組的單菌落數(shù)，個(gè)。

1.3.5 最適生長(zhǎng)pH實(shí)驗(yàn)

將突變株菌懸液稀釋1000倍后，吸取0.1mL稀釋液，分別接種到pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的固體培養(yǎng)基中，并設(shè)置3組平行試驗(yàn)。于27℃恒溫培養(yǎng)，觀(guān)察菌落的形成情況。

1.3.6 發(fā)酵特性驗(yàn)證

將出發(fā)菌株T19-127L與篩選出的突變菌株按照10%的接種量分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并設(shè)置3組平行試驗(yàn)，于27℃，220r·min-1的振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)8d后測(cè)定發(fā)酵液的pH值和效價(jià)。

1.3.7 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將篩選出的突變菌株進(jìn)行5次傳代培養(yǎng)，并將每代突變菌株菌懸液按照5%的接種量接種于pH7.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并設(shè)置3組平行試驗(yàn)，27℃、220r·min-1振蕩培養(yǎng)8d后，測(cè)定每代突變菌株的產(chǎn)素能力，從而驗(yàn)證菌株的突變性能是否能夠穩(wěn)定遺傳。

1.3.8 檢測(cè)方法

pH值，采用pH酸度計(jì)對(duì)發(fā)酵液的pH值進(jìn)行測(cè)定。

截短側(cè)耳素高效液相色譜法檢測(cè)，配制濃度分別為0.25mg·mL-1、0.125mg·mL-1、0.0625mg · mL-1、0.03125mg · mL-1、0.015625mg · mL-1、0.007813mg · mL-1的截短側(cè)耳素標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液，進(jìn)行高效液色譜測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)3次。HPLC液相條件為乙腈：0.02mol·L-1KH2PO4=45：55，UV205nm，流速1mL·min-1，柱溫27℃[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)

微生物發(fā)酵產(chǎn)物的含量與接入發(fā)酵瓶的種子的活性有直接關(guān)系，通常選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子進(jìn)行轉(zhuǎn)接發(fā)酵。通過(guò)圖1可知，菌株T19-127L在第2～7天處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別將培養(yǎng)3d、4d、5d的種子轉(zhuǎn)接發(fā)酵瓶。培養(yǎng)8d后，測(cè)截?cái)鄠?cè)耳素的含量發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)4d的種子具有較高的產(chǎn)素能力，因此將種瓶培養(yǎng)時(shí)間確定為4d。

2.2 發(fā)酵周期

出發(fā)菌株T19-127L產(chǎn)素能力與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系如圖2所示。效價(jià)呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，培養(yǎng)至第9天效價(jià)達(dá)到最大;pH則呈現(xiàn)出先增后平的趨勢(shì)，同樣培養(yǎng)至第9天發(fā)酵液pH出現(xiàn)最大值，發(fā)酵第9～11天一直處于7.78左右。因此，將發(fā)酵周期確定為9d。

2.3 正向突變菌株的篩選

將預(yù)培養(yǎng)物用紫外線(xiàn)處理后，單菌落數(shù)隨處理時(shí)間的變化情況如圖3所示。隨紫外燈照射時(shí)間的增加，培養(yǎng)皿中單菌落數(shù)依次減少，而致死率則依次增加。其中，紫外燈照射80～160s時(shí)，致死率在50%～80%;紫外燈照射420s時(shí)，致死率達(dá)97%，說(shuō)明紫外照射時(shí)間對(duì)致死率有著重要的影響。通常正向突變一般都出現(xiàn)在70%～80%致死率中[13]，因此實(shí)驗(yàn)選擇的最佳輻照時(shí)間為160s，此時(shí)菌株致死率為80%，較符合正向突變的理想致死率。隨機(jī)挑選14株單菌落制備試管斜面，4℃保藏，備用。

2.4 菌種發(fā)酵能力測(cè)試結(jié)果

分別將14株突變株接種于種瓶培養(yǎng)基中，27℃培養(yǎng)，220r·min-1培養(yǎng)4d后，按照10%的接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)9d后用液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液的效價(jià)。其中，3株菌種的效價(jià)提高了5%～10%;有7株菌種的效價(jià)提高了10%～20%;有2株菌種的效價(jià)提高了20%～30%，正突變率達(dá)到85.7%。

2.5 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)生產(chǎn)需求，選擇9號(hào)菌株連續(xù)培養(yǎng)5代，每代菌株均進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)酵液的效價(jià)如圖4所示。圖4可以直觀(guān)反映出突變株的第3代和第4代具有較高的產(chǎn)素能力，但是這5代的產(chǎn)素能力的差異性不顯著（P>0.05），說(shuō)明突變株在傳代過(guò)程中具有穩(wěn)定的遺傳性。

3 結(jié)論

工業(yè)生產(chǎn)中，誘變育種是獲得高產(chǎn)菌株常用的方法，都雯玥[14]對(duì)Clitopiluspinsitus的原生質(zhì)體進(jìn)行重離子輻照誘變，最終選育出C.pin15I5E和C.pin15II6B2株正變異株，其產(chǎn)量較出發(fā)菌株分別提高16.17%和15.47%;何海燕[15]等人通過(guò)微波誘變獲得果膠酶高產(chǎn)菌株;陳曉麗利用制霉菌素篩選得到截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌，其效價(jià)提高了38.5%。本研究為提高泰妙菌素的發(fā)酵水平，采用經(jīng)典的紫外誘變技術(shù)對(duì)泰妙菌素生產(chǎn)菌T19-127L進(jìn)行選育。經(jīng)紫外誘變，正突變率達(dá)到了85.7%，通過(guò)大量篩選得到2株菌泰妙菌素突變株，比出發(fā)菌株效價(jià)提高20%～40%，其中T19-20（13352u·mL-1）的效價(jià)最高，比出發(fā)菌株T19-127L（9605u·mL-1）提高了39%，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

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（責(zé)任編輯 ?周康）