核桃國內外主栽品種種質資源搜集及DNA提取保存

王晶 李建 史根生

摘 要：本研究搜集了211個國內外核桃主栽品種，采集了核桃品種的枝條，并對采集的品種枝條的芽進行嫁接，試驗在山西省農業(yè)大學經(jīng)濟作物研究所核桃資源圃內進行，建立引種檔案。取當年新生枝條的頂端嫩葉，進行核桃品種DNA的提取，并于山西省農業(yè)大學園藝實驗室-80℃冰箱內保存。

關鍵詞：核桃;引種;DNA提取

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200930010

核桃（Juglans regia L.）屬胡桃科核桃屬，是核桃屬中栽培最為廣泛的種。核桃是一種果材兼用的落葉樹種，在我國核桃的栽培歷史悠久，種植資源豐富，形成了眾多特異優(yōu)良的地方品種。我國核桃的分布很廣，遼寧、天津、北京、河北、山東、山西、陜西、寧夏、青海、甘肅、新疆、河南、安徽、江蘇、湖北、湖南、廣西、四川、貴州、云南及西藏等21個省份都有分布。

核桃是重要的堅果和木本糧油樹種，位列世界4大干果（核桃、扁桃、腰果和榛子）之首。核桃被醫(yī)學界公認為抗衰老食品，并素有“長壽果”的美譽。核桃仁中富含蛋白質、脂肪、纖維素、維生素等營養(yǎng)元素，含有最適宜人體健康的ω-3脂肪酸、褪黑激素、生育酚和抗氧化劑等，可有效減緩和預防心臟病、癌癥、動脈疾病、糖尿病、高血壓、肥胖癥和臨床抑郁癥的發(fā)生。

地方品種是在特定地區(qū)經(jīng)過長期栽培和自然選擇而形成的品種，對所在地區(qū)氣候和生產(chǎn)條件一般具有較強適應性，并含有豐富的基因型，具有豐富的遺傳多樣性，常存在特殊優(yōu)異的性狀基因，是果樹品種改良的重要基礎和優(yōu)良基因來源。所以，搜集地方核桃品種資源是非常有意義的。

1 核桃品種的枝條采集及保存

1.1 枝條采集

在山西省、東北省、山東省、河南省、陜西省、河北省等核桃主要種植省份，采集了211個品種，具體采集信息見表1。將采集的品種枝條用濕布包裹運回基地，嫁接于優(yōu)質的實生核桃品種上。

1.2 嫁接

于2020年6月，選擇長勢良好的實生核桃樹木，將引入的核桃品種芽嫁接，保存品種。

1.2.1 選砧木

選用生長旺盛、無病蟲害的1～2a的實生苗，要求距地面5～6cm處的直徑在0.5cm以上。芽接前10d左右，將選定的砧木下部距地面7～8cm以上的分枝剪去，以便于操作。

1.2.2 選削接穗

選要取樣品種健壯、豐產(chǎn)、無病蟲害的中年核桃樹冠外圍部位，選取葉芽飽滿的當年生發(fā)育枝。選好枝條后，剪除葉片，只留葉柄。左手拿好枝條，右手持芽接刀，先在枝條上選定1個芽，在選定的葉芽上方0.5cm處橫切1刀，然后用刀自下端橫切處緊貼枝條的木質部向上削去，一直削到上端橫切處，削成1個上寬下窄的盾形芽片接穗。為了保持接穗的濕度，可將接穗含在口里或用濕布蓋好。

1.2.3 切砧木

在砧木的北邊距枝底2～3cm處橫切1刀，長約1cm，深度以切斷砧木皮層為度，再從橫口中間向下垂直切1刀，長約1～1.2cm，切成T形。然后用芽接刀骨柄挑開砧木皮層，以便插進接穗。

1.2.4 插接穗

用芽接刀挑開砧木上的T字形切口，將接穗插入切口中，插入時接穗的葉柄要朝上。插入后，要使接穗上端同T字形橫切口對齊，如果接穗過長，可自上端切去一些。

1.2.5 綁縛

用塑料袋或其它綁縛材料，先從接口上邊綁起，逐漸往下纏，葉芽和葉柄要留在外邊。

1.2.6 接后管理

接后3～4d要檢查嫁接是否成活。如果接穗的葉柄用手輕輕一碰立即脫落，接穗皮色鮮綠，說明已經(jīng)接活;如果葉柄不落，接穗干枯，即沒有接活，需要補接。成活10d后，要將綁縛解除，以免阻礙結合部位生長。在此以后，要進行剪貼。夏季接的要在當年剪砧。剪砧的位置是在T字形橫口上方2cm左右。當接穗萌發(fā)長到一定高度時，應在一旁插1個支柱，將接穗枝條綁縛在支柱上，使接穗枝條直立生長，并可防止被風吹折。

1.3 建立引種檔案

用卡片登記核桃品種的詳細農藝特性，并裝訂成冊，建立引種檔案。

2 核桃品種的DNA提取及保存

2.1 核桃品種DNA提取

剪取0.2～0.3g新鮮葉片于2mL離心管中（剛好淹沒管底），迅速放入液氮罐中，在管蓋及管壁上標注好樣品名稱。采樣結束回到實驗室后，用鑷子將2mL離心管夾出，向管內加入3mm鋼珠2粒，再次放入液氮桶中。將2mL離心管置入430組織破碎儀樣品板中，液氮澆在樣品板上，使樣品保持速凍狀態(tài)，待液氮消散，將樣品板置于組織破碎儀中振蕩破碎3min。需注意，2塊板中的樣品要對稱放置。

破碎結束后，加入2×CTAB 1000μL，將離心管放入浮板置于65℃水浴中2h;水浴過程中隔0.5h顛倒混勻1次;插入浮板后，浮板位于離心管中部靠上位置，既能使下部充分水浴，也能防止上部由于管口未蓋緊而浸入水。

水浴后，待離心管冷卻至室溫，加入24∶1氯仿-異戊醇800μL，輕柔顛倒混勻，靜置15min，4℃12000rpm·min-1離心15min，吸取上清至新管中。若上清不夠澄清，重復上一步驟。

加入-20℃預冷的無水乙醇1200μL，輕柔顛倒混勻，-20℃條件下放置20min，4℃ 12000rpm·min-1離心15min，去掉上清;若-20℃空間不足，也可放置于-40℃中;離心后管底可以觀察到白色絮狀沉淀。加入75%乙醇800μL，顛倒混勻，4℃ 12000rpm·min-1離心15min，去掉上清。將離心管插到浮板上開口斜放，過夜干燥直到沉淀透明。

2.2 溶解核桃品種DNA及濃度檢測

加入TE buffer100μL及2‰RNase，4℃條件下靜置溶解4h;若短期內可做完使用ddH2O溶解，長期保存使用TE buffer。使用NanoDrop Spectrometer測定DNA濃度及純度。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

2.3 制備核桃品種DNA工作液

DNA濃度稀釋至50ng·μL-1左右（標準濃度），260/230最低不要低于1.3，否則PCR及PAGE效果很差。

A 260nm：核酸最高吸收峰的吸收波長;A 280nm：蛋白質最高吸收峰的吸收波長;A 270nm：酚的最大吸收峰;A 230nm：碳水化合物最高吸收峰的吸收波長。

純DNA的260/280一般在1.8左右，大于1.9表明有RNA污染，小于1.6表明有蛋白質、酚等污染。

2.4 核桃品種DNA保存

稀釋好的DNA樣品放入置物盒，標號存檔，置于-80℃冰箱保存。

參考文獻

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（責任編輯 ?李媛媛）