胰高血糖素樣肽-1對脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶CD36、ACAT1影響的研究

張 奎，韓永魁，岳云飛，申曉彧

巨噬細(xì)胞泡沫化是早期動脈粥樣硬化病變脂紋、脂斑主要成分，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇流入及合成、增加流出，抑制巨噬細(xì)胞泡沫化，對冠心病病人極為重要[1]。脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(CD36)、酯酰輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT1)是細(xì)胞內(nèi)的膽固醇合成關(guān)鍵酶[2-4]。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是結(jié)腸和小腸遠(yuǎn)端的L細(xì)胞分泌的胃腸激素，可刺激胰腺分泌胰島素而發(fā)揮其降糖主要作用[5]。體內(nèi)有兩種生物活性形式，分別為GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)，7-36a為7-37的酰胺化產(chǎn)物。GLP-1約80%的生物活性來自7-36a[6]。目前研究在人體內(nèi)的GLP-1具有抗動脈粥樣硬化作用，但具體機(jī)制不詳[7]，有證據(jù)顯示體外重組GLP-1(rhGLP-1，7-36)與人體內(nèi)活性GLP-1(7-36)結(jié)構(gòu)及功能高度一致[8]。本研究分析GLP-1(7-36)是否可以降低巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞CD36、ACAT1基因及蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇積累，減輕巨噬細(xì)胞泡沫化程度，最終抑制動脈粥樣斑塊的形成。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑和實(shí)驗設(shè)備 主要試劑：巨噬細(xì)胞株(上海中科院細(xì)胞中心)；GLP-1(7-36)(貨號：249125，上海吉爾生化有限公司生產(chǎn))；Exendin(9-39)(貨號：055285，上海吉爾生化有限公司生產(chǎn))；HPR標(biāo)記二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)(北京欣和佳源公司)；ACAT1一抗(武漢三鷹生物有限公司)；CD36一抗(上海拜力生物科技有限公司)； RNA提取試劑 TRIzol(索萊寶公司)。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒( 索萊寶公司)。主要儀器及設(shè)備：37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱( 美國Thermo公司，型號3141)；PCR儀和酶標(biāo)儀(美國 Bio-Rad公司)；超凈工作臺(上海思龍科學(xué)儀器公司，型號VFS-650)；相差倒置顯微鏡(日本Nikon公司，型號7650)；水平搖床(德國IKA公司，型號KS400i)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立 從液氮儲存罐中取出巨噬細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，加入15%的DMEM/F12培養(yǎng)液，3～4 d更換1次培養(yǎng)液，適宜的溫度下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至覆蓋80%～95%培養(yǎng)瓶體時，選擇含0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，按照1∶2進(jìn)行傳代。傳至3～5代時，選取生長狀況好的用于本實(shí)驗。將培養(yǎng)后生長狀況好的3～5代巨噬細(xì)胞調(diào)整合適的濃度，加入50 mg/L ox-LDL誘導(dǎo)，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，建立巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。

1.2.2 細(xì)胞實(shí)驗分組 巨噬細(xì)胞組：未干預(yù)傳至3～5代的泡沫細(xì)胞；泡沫細(xì)胞組：ox-LDL誘導(dǎo)3～5代的巨噬細(xì)胞；不同濃度(0 nmol/L、1.5 nmol/L、3.0 nmol/L、5.0 nmol/L、10.0 nmol/L)GLP-1(7-36)干預(yù)組：先用ox-LDL誘導(dǎo)3～5代的巨噬細(xì)胞，之后分別加入濃度為0 nmol/L、1.5 nmol/L、3.0 nmol/L、5.0 nmol/L、10.0 nmol/LGLP-1(7-36)；GLP-1(7-36)+Exendin(9-39)組：先用ox-LDL誘導(dǎo)3～5代的巨噬細(xì)胞，后同時加入濃度為5.0 nmol/L GLP-1(7-36)和濃度為50.0 nmol/L的GLP-1(7-36)抑制劑，即Exendin(9-39)。

1.2.3 用RT-PCR分析各組細(xì)胞中的CD36、ACAT1 mRNA表達(dá)情況 首先等待細(xì)胞干預(yù)后，分離培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗細(xì)胞2次或3次，用RNA提取試劑提取RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA及進(jìn)行PCR擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄過程引物選擇，CD36上游引物序列為：5′-CTTTGAAAGAACTCTTGTGGGG -3′，下游引物序列為：5′-GTCTGTGCCATTAATCATGTCG -3′。ACAT1上游引物序列為：5′-ACGTAATGAGCAGAGGAGCAACAC -3′，下游引物序列為：5′-CGTATCCTGTTCCTGCCGTGAG-3′。β-Actin上游引物序列為：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3，下游引物序列為：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)保證在95 ℃預(yù)變性30 s循環(huán)40次，60 ℃退火30～50 s，并且循環(huán)40次。RT-PCR反應(yīng)結(jié)果獲得Ct值。用2-△△Ct進(jìn)行分析mRNA的表達(dá)?！鳌鰿t=(CtCD36或ACAT1-Ctβ-actin)處理組-(Ct實(shí)驗組-Ctβ-actin)未處理。

1.2.4 用Western Blot法分析各組細(xì)胞中的CD36、ACAT1蛋白表達(dá)水平 用PBS沖洗各實(shí)驗組2次或3次，然后加入適當(dāng)?shù)牡鞍琢呀庖? ℃環(huán)境下靜置30 min，再將上述液體置入新的EP管，在4 ℃離心機(jī)12 000 r/min 離心15 min，將上清液置入另一新EP管(即各組收集的蛋白)在-80 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩Ｓ肂CA蛋白定量法測定蛋白濃度，行十二烷基酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，用含 5%牛奶 TBST 封閉 1 h，后孵育一抗(1∶1 000)，在 4 ℃環(huán)境下?lián)u床過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，二抗(1∶2 000) 室溫?fù)u床孵育2 h，凝膠成像分析系統(tǒng)中采集圖像，測定條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞ACAT1、CD36mRNA的表達(dá) 與巨噬細(xì)胞組相比，泡沫細(xì)胞組ACAT1、CD36mRNA表達(dá)水平較高(P<0.05)；與泡沫細(xì)胞組相比，GLP-1組ACAT1、CD36mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與GLP-1組相比，GLP-1+Exendin組ACAT1、CD36mRNA表達(dá)水平較高(P<0.05)。詳見圖1。

與巨噬細(xì)胞組比較，＊P<0.05；與泡沫細(xì)胞組比較，#P<0.05；與GLP-1組比較，△P<0.05。

2.2 各組ACAT1、CD36蛋白的表達(dá) 與巨噬細(xì)胞組相比，泡沫細(xì)胞組ACAT1、CD36蛋白表達(dá)水平較高(P<0.05)；與泡沫細(xì)胞組相比，GLP-1組ACAT1、CD36蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與GLP-1組相比，GLP-1+Exendin組ACAT1、CD36蛋白表達(dá)水平較高(P<0.05)。詳見圖2。

2.3 GLP-1(7-36)干預(yù)組ACAT1、CD36mRNA的表達(dá) 不同濃度(0 nmol/L、1.5 nmol/L、3.0 nmol/L、5.0 nmol/L、10.0 nmol/L)GLP-1(7-36)組CD36、ACAT1 mRNA表達(dá)低于泡沫細(xì)胞組，但只有GLP-1(7-36)5.0 nmol/L干預(yù)組與0 nmol/L組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3。

2.4 GLP-1(7-36)干預(yù)組ACAT1、CD36蛋白的表達(dá) 不同濃度(0 nmol/L、1.5 nmol/L、3.0 nmol/L、5.0 nmol/L、10.0 nmol/L)GLP-1(7-36)組CD36、ACAT1蛋白表達(dá)低于泡沫細(xì)胞組，但只有GLP-1(7-36)5 nmol/L干預(yù)組與0 nmol/L組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖4。

與巨噬細(xì)胞組比較，＊P<0.05；與泡沫細(xì)胞組比較，#P<0.05；與GLP-1組比較，△P<0.05。

與0 nmol/L組比較，＊P<0.05。

3 討 論

巨噬細(xì)胞吞噬內(nèi)皮下氧化的低密度脂蛋白膽固醇形成泡沫細(xì)胞，隨著泡沫細(xì)胞增多、融合，逐漸形成動脈粥樣硬化斑塊的脂質(zhì)核心[1]。CD36作為一個脂肪酸轉(zhuǎn)移酶，是一種多功能跨膜糖蛋白，可以與游離脂肪酸結(jié)合，并促使他們進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，此功能是脂質(zhì)在脂肪細(xì)胞內(nèi)蓄積的基礎(chǔ)介導(dǎo)細(xì)胞對ox-LDL的攝取，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞[9]。另有研究證明細(xì)胞內(nèi)一部分游離膽固醇被運(yùn)輸至質(zhì)膜，而另一部分多余的游離膽固醇被運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)，在此處，由ACAT1進(jìn)行催化，游離膽固醇酯化生成膽固醇酯，并以脂滴的形式儲存在細(xì)胞內(nèi)[10]。近年來研究表明上調(diào)CD36、ACAT1蛋白的表達(dá)，可以增加膽固醇攝取，脂滴在細(xì)胞內(nèi)積聚，從而使得巨噬細(xì)胞泡沫化，形成泡沫細(xì)胞[11]。因此，研究減少巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)CD36、ACAT1蛋白的表達(dá)，可有效抑制巨噬細(xì)胞泡沫化。

目前研究證明GLP-1(7-36)激動劑可以改善超重成年人冠狀動脈微循環(huán)障礙(CMD)，GLP-1使得小冠狀動脈增加血管舒張劑儲備以應(yīng)對氧需求量增加的能力，從而減輕冠狀動脈微循環(huán)障礙后引起的動脈粥樣硬化[12]。另有研究證明早期、低負(fù)荷動脈粥樣硬化病變的ApoE-/-小鼠，GLP-1(7-36)激動劑通過部分依賴性途徑，抑制血小板的活化及穩(wěn)定血小板，進(jìn)而抑制早期、低負(fù)荷動脈粥樣硬化病變的進(jìn)展[13]。而本實(shí)驗研究結(jié)果顯示，不同濃度GLP-1(7-36)干預(yù)組中CD36、ACAT1的mRNA及蛋白表達(dá)均低于泡沫細(xì)胞組表達(dá)，并且表達(dá)在一定范圍內(nèi)(濃度<5.0 nmol/L)與GLP-1(7-36)激動劑濃度呈負(fù)相關(guān)。實(shí)驗證明GLP-1(7-36)一定程度上可以減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇攝取、積聚過程的關(guān)鍵酶CD36、ACAT1的表達(dá)，從而抑制巨噬細(xì)胞泡沫化，減少脂紋、脂斑形成的成分，抑制動脈粥樣化進(jìn)展。隨著對GLP-1的深入研究，很多實(shí)驗均證實(shí)了GLP-1在心血管領(lǐng)域的獲益，但現(xiàn)階段卻很少有研究涉及GLP-1能否通過影響巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)CD36、ACAT1基因及蛋白的表達(dá)從而抑制動脈粥樣硬化。近年來，他汀類藥物一直作為降脂首選藥物，盡管新型他汀類藥物已經(jīng)問世，但也仍存在誘發(fā)肝損害和肌病的風(fēng)險，因此，GLP-1類似物能否聯(lián)合他汀抑制膽固醇合成，以減少他汀類藥物的劑量，減少肝損傷及肌病發(fā)生，提供了新的降脂治療研究方向。

不同濃度GLP-1(7-36)激動劑均能抑制膽固醇攝取、積聚關(guān)鍵酶的CD36、ACAT1基因及蛋白的表達(dá)，從而減少巨噬細(xì)胞泡沫化。尤其當(dāng)GLP-1(7-36)激動劑濃度為5.0 nmol/L時，這種抑制效果最為顯著。本實(shí)驗研究結(jié)果顯示，GLP-1(7-36)能通過抑制CD36、ACAT1基因及蛋白的表達(dá)，延緩動脈粥樣硬化，但尚不能確定是否可以通過其他通路實(shí)現(xiàn)這一過程，尚需進(jìn)一步研究。