天麻鉤藤膏改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的作用及其機(jī)制研究

田夢影，宋雪云，李曉屏，蔡嘉洛，徐則林，蔡虎志

高血壓病是嚴(yán)重危害人類健康的一種常見、高發(fā)慢性疾病[1]。心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF) 是高血壓病心肌病變的主要病理變化，也是導(dǎo)致多種心血管疾病及猝死發(fā)生的重要原因之一[2]。許多研究表明，心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及膠原的合成降解失衡是導(dǎo)致心肌纖維化的重要機(jī)制之一。天麻鉤藤膏是目前臨床上用于治療肝腎陰虛型、肝陽上亢型高血壓病的經(jīng)典方劑，其臨床療效確切且副作用輕微，較西藥有一定優(yōu)勢。本研究以自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)為模型，觀察天麻鉤藤膏對(duì)SHR心肌纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組干預(yù) SHR，雄性，16周齡，50只，SPF級(jí)，體質(zhì)量230～250 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。合格證號(hào)編號(hào)：scxk(滬)2017-002。正常血壓(Wistar-Kyoto，WKY)大鼠，雄性，16周齡，10只，SPF級(jí)，體質(zhì)量230～250 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。合格證號(hào)編號(hào)：scxk(滬)2017-023。

1.1.2 藥物制備 天麻鉤藤膏組方：丹參15 g，天麻9 g，鉤藤12 g(后下)，石決明18 g(先煎)，梔子9 g，黃芩9 g，杜仲9 g，桑寄生9 g，夜交藤9 g，茯神9 g，牛膝12 g，益母草9 g。以上藥物20劑，浸泡12 h后用武火加熱至沸騰，改調(diào)文火加熱煎煮，常壓煎煮時(shí)間為2 h，煎液濾出，置潔凈桶內(nèi)；第2次煎煮再加8倍量水，繼續(xù)加熱至沸騰，常壓煎煮時(shí)間不少于1 h，將煎液濾出置潔凈桶內(nèi)，合并兩次濾液。藥渣壓榨，壓榨液與濾液合并后靜置10 h，取上清液過100目篩。將2次煎液混合后濃縮至密度1.10～1.15，沖入預(yù)先烊化的阿膠500 g，最后加入元貞糖516 g(膏方總量的20%)、鱉甲膠387 g(膏方總量的15%)。煉制收膏，每毫升膏劑約含生藥2.8 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制作?？ㄍ衅绽?廣東彼迪藥業(yè)有限公司生產(chǎn))0.25 mg，研磨成粉后經(jīng)雙蒸水溶解，制備成每毫升含生藥 10 mg的藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑及實(shí)驗(yàn)儀器 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)分型檢測試劑盒均購于珠海市泛海生物科技有限公司。JA11001型電子精密天平(上海雙旭電子有限公司)，SYNGENE ChemGenius成像系統(tǒng)(Syngene公司)，WMF-3650研究型倒置熒光顯微鏡(上海無陌光學(xué)儀器有限公司)，HT7700透射電鏡(日本日立公司)，DRM+Q550型病理圖像分析儀(德國LEICA公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及灌胃 SHR應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：即模型組、卡托普利組(予卡托普利片陽性藥物0.025 g/kg)、天麻鉤藤膏高劑量組(給予天麻鉤藤膏24.36 g/kg)、天麻鉤藤膏中劑量組(給予天麻鉤藤膏11.34 g/kg)、天麻鉤藤膏低劑量組(給予天麻鉤藤膏5.36 g/kg)，另以10只16周齡WKY大鼠為空白對(duì)照組。以人等效量=[1×大鼠體表面積/成人平均體表面積×成人每日用量]的方法計(jì)算卡托普利片和天麻鉤藤膏每日灌胃劑量，每日1次灌胃。療程為4周。6組均以蒸餾水同時(shí)開始灌胃，空白對(duì)照組自由飲水，療程 4周。

1.2.2 心臟重量指數(shù)測定 在最后1次給藥后即刻停止喂食，提供飲水，飼養(yǎng)12 h后，稱重，10%水合氯醛麻醉(0.35 mL/100 g)，腹主動(dòng)脈采血后取心臟，生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分，稱取重量作為心臟重量。沿房室交界處剪去心房和右心室，剩余的左心室稱取重量作為左室重量(LVW)。并計(jì)算左室質(zhì)量指數(shù)(LVWI)。

1.2.3 心肌組織膠原病理形態(tài)定性定量分析 病理標(biāo)本的制備，取左室中段橫截面( 冠狀切面) 心肌組織做病理切片，常規(guī)固定(10%中性甲醛)、包埋和制片，每只鼠取切片2張，切片厚4～5 μm，進(jìn)行HE染色和VG染色，清晰顯示心肌細(xì)胞和膠原組織。在VG染色下，心肌細(xì)胞呈黃色，膠原呈紅色。

1.2.4 病理標(biāo)本檢測 以電子透鏡和圖像分析系統(tǒng)測量心肌膠原容積分?jǐn)?shù)心肌膠原含量(collagen volume fraction，CVF)和心肌血管周圍膠原面積和管腔面積比例(perivascular circumferential area，PVCA)。通過灰度調(diào)節(jié)區(qū)別膠原和非膠原成分。計(jì)算方法：CVF=膠原面積/總面積，其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積。隨機(jī)分析5個(gè)視野，取其均值作為該心臟的CVF。PVCA=壁內(nèi)小動(dòng)脈管腔周圍膠原面積/動(dòng)脈管腔面積。每一標(biāo)本取4根壁內(nèi)小動(dòng)脈橫切面進(jìn)行測量，取其均值作為該心臟的PVCA。

1.2.5 血清TNF-α、MCP-1、G-CSF檢測 嚴(yán)格按照TNF-α、MCP-1、G-CSF檢測試劑盒說明書方法進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠LVW、LVWI、心肌膠原含量變化比較 模型組大鼠LVWI、LVW及心肌膠原含量均高于空白對(duì)照組大鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；卡托普利組及天麻鉤藤膏高、中、低劑量組大鼠LVWI、LVW及心肌膠原含量均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；表明天麻鉤藤膏能明顯減輕心臟質(zhì)量并降低膠原含量。詳見表1。

表1 各組大鼠LVW、LVWI、心肌膠原含量變化比較 (±s)

2.2 各組大鼠PVCA、CVF的變化 模型組PVCA和CVF均高于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；天麻鉤藤膏高、中、低劑量組及卡托普利組PVCA和CVF與模型組比較均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；天麻鉤藤膏高劑量組與卡托普利組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明天麻鉤藤膏可有效促進(jìn)心肌膠原的降解。詳見表2。

表2 各組大鼠PVCA、CVF變化比較 (±s) 單位：%

2.3 各組大鼠血清中TNF-α、MCP-1、G-CSF的變化模型組 TNF-α、MCP-1、G-CSF均高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) ；與模型組比較，天麻鉤藤膏高、中、低劑量組及卡托普利組TNF-α、MCP-1、G-CSF均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；天麻鉤藤膏高劑量組與卡托普利組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；說明天麻鉤藤膏可明顯降低炎癥反應(yīng)。詳見表3。

表3 各組大鼠血清中TNF-α、MCP-1、G-CSF變化比較 (±s) 單位：nmol/L

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)變化(見圖1)

圖1 電鏡下各組大鼠心肌細(xì)胞組織的顯微結(jié)構(gòu)(×100)

3 討 論

近年來研究表明，高血壓病是一種慢性炎癥性疾病，其引起的心肌纖維化是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一[3]。心肌纖維化是機(jī)體對(duì)于心肌細(xì)胞損傷修復(fù)的一種失控的炎癥表現(xiàn)，一旦心肌細(xì)胞發(fā)生損傷，大量的炎性細(xì)胞浸潤、炎性因子分泌，形成一個(gè)炎癥環(huán)境，促使成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，同時(shí)分泌細(xì)胞外基質(zhì)，造成纖維化。

中醫(yī)學(xué)將高血壓病稱“眩暈”，認(rèn)為“正虛邪戀，邪盛致虛”是高血壓病發(fā)病的根本之所在[4]。《素問·至真要大論》曰：“諸風(fēng)摔眩，皆屬于肝”[5]?！额愖C治裁·眩暈》也認(rèn)為：“良由肝膽乃風(fēng)木之臟……震眩不定”。由此說明肝在高血壓病發(fā)病機(jī)制中的重要地位[6]。天麻鉤藤膏是經(jīng)方天麻鉤藤湯調(diào)制而成，具有滋補(bǔ)肝腎、平肝潛陽的功效，是歷代醫(yī)家用于治療高血壓病的經(jīng)典方劑之一。本研究發(fā)現(xiàn)SHR的LVWI、LVW、心肌膠原含量、PVCA、CVF等指標(biāo)從不同層面反映左室肥厚以及心肌纖維化的程度，其中LVWI和LVW能較好地反映左心室肥厚程度，但對(duì)高血壓病早期的心肌纖維化敏感性較差；心肌膠原含量則可直接反映心肌細(xì)胞膠原含量水平。有研究表明PVCA和CVF這兩項(xiàng)指標(biāo)分別代表高血壓病心肌纖維化病變的兩種主要形式，即血管周圍纖維化程度與間質(zhì)纖維化的病變程度[7]。本研究顯示：天麻鉤藤膏能明顯降低SHR的LVWI、LVW、心肌膠原含量、PVCA及CVF，從而逆轉(zhuǎn)左室重構(gòu)以及阻滯心肌纖維化的進(jìn)程，其效果與卡托普利比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而藥物治療過程中，大鼠血清中炎性因子TNF-α、MCP-1、G-CSF均降低，說明天麻鉤藤膏可一定程度上抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，降低炎性因子濃度。

天麻鉤藤膏具有改善高血壓病心肌纖維化的作用，其可能是通過降低炎性因子TNF-α、MCP-1、G-CSF水平，從而抑制心肌膠原合成，達(dá)到其逆轉(zhuǎn)心肌纖維化及左室肥厚的作用。但高血壓病引起的心肌纖維化病理機(jī)制較復(fù)雜，天麻鉤藤膏對(duì)心肌纖維化的干預(yù)作用是否有其他因素參與，尚待更深入的研究進(jìn)一步確定。