微酸性電解水對(duì)黃豆發(fā)芽的影響

趙之怡，申盼盼，張運(yùn)龍，施丹，李昂，石藝琦，張春玲

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌，712100)

黃豆芽是黃豆在適宜環(huán)境條件下發(fā)芽得到的蔬菜。與種子相比，發(fā)芽可以提高VC、黃酮類化合物和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的含量，同時(shí)可以降低一些抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響，促進(jìn)消化吸收[1-2]。豆芽生長周期短，全年均可生產(chǎn)，生產(chǎn)方便快捷，深受廣大生產(chǎn)者和消費(fèi)者的歡迎。然而，黃豆在發(fā)芽、收獲、包裝、運(yùn)輸和銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)中都有可能被來源于人類、動(dòng)物或環(huán)境的微生物污染，如果未被合理消毒，污染微生物會(huì)在種子發(fā)芽所需的高溫高濕環(huán)境中快速生長繁殖，造成豆芽的生產(chǎn)失敗甚至食源性疾病的暴發(fā)[3]。目前，輻照、有機(jī)酸、次氯酸鈉、熱處理、酒精處理等微生物控制方法被應(yīng)用于芽苗菜生產(chǎn)[3-6]，但這些方法主要是在種子浸泡或清洗階段用于種子消毒，但浸泡、清洗階段的殺菌消毒無法完全滅活種子攜帶的微生物，在發(fā)芽期間如果不采取控制措施，殘留的微生物在高溫高濕的發(fā)芽環(huán)境中會(huì)迅速生長繁殖，最終數(shù)量達(dá)到較高水平；次氯酸鈉、酒精等高濃度消毒劑的使用將導(dǎo)致化學(xué)殘留并影響種子的正常發(fā)芽。因此，尋求一種既能有效控制微生物數(shù)量，又不影響豆芽生長和食用安全的消毒方法勢(shì)在必行。

微酸性電解水(slightly acidic electrolyzed water, SAEW)是在無隔膜的電解槽中電解稀鹽或稀HCl溶液生成的具有特殊理化性質(zhì)的水溶液，pH為5.0～6.5，具有較強(qiáng)的殺菌活性。相比其他化學(xué)消毒劑，SAEW的制備只需簡(jiǎn)單的電解過程，無需復(fù)雜操作、制取方便、成本低廉；SAEW的有效氯成分易分解，pH接近中性，化學(xué)殘留小，對(duì)人體、設(shè)備、環(huán)境的影響小；在微酸性pH范圍內(nèi)，SAEW中的有效氯成分主要以HClO形式存在，其殺菌效力為ClO-的80～150倍，且SAEW殺菌過程的作用時(shí)間短，不利于微生物抗性的形成，殺菌高效、廣譜。研究表明，SAEW對(duì)純培養(yǎng)的大腸桿菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿假單胞菌都有較強(qiáng)的殺滅能力[7-8]。經(jīng)過SAEW處理，新鮮蔬菜(如芹菜、香菜、藕)和多種芽苗菜(如豌豆芽、綠豆芽、蕎麥芽)的微生物數(shù)量均顯著下降[9-13]。因其殺菌高效廣譜、價(jià)格低廉、安全環(huán)保等特點(diǎn)，SAEW被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，日本、美國、韓國已經(jīng)批準(zhǔn)SAEW為食品添加劑[12-13]。因此，本研究將SAEW代替常規(guī)生產(chǎn)用水用于黃豆發(fā)芽過程。

植物生長環(huán)境中的離子種類和濃度會(huì)對(duì)植物造成不同程度的影響，研究表明，在含有一定量Na+的環(huán)境中發(fā)芽，可以提高西蘭花芽和花椰菜芽的抗氧化活性[14]、提高苦蕎芽的營養(yǎng)價(jià)值[15]。因此，本研究利用不同電解質(zhì)(NaCl和HCl溶液)電解生成含有Na+和不含有Na+的SAEW，并將其應(yīng)用到黃豆的清洗、浸泡、發(fā)芽過程，考察不同SAEW的殺菌效果，以及其對(duì)黃豆發(fā)芽特性、黃豆芽生長品質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar, PCA)、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violet red bile agar, VRBA)、孟加拉紅瓊脂(rose bengal agar)，北京陸橋技術(shù)有限公司；NaCl、HCl均為分析純，四川西隴化工有限公司；抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)含量測(cè)試盒、植物類黃酮測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；黃豆種子[(17.23±0.04)g/100粒]，陜西省楊凌區(qū)好又多超市。

1.2 儀器與設(shè)備

Chlorometer Duo雙量程氯量計(jì)，英國Palintest公司；Harmony-II微酸性電解水生成設(shè)備，北京睿安德科技有限公司；HD-240L微酸性電解水生成設(shè)備，上海富強(qiáng)旺衛(wèi)生用品有限公司；DH-11L拍打式無菌均質(zhì)機(jī)，寧波洛尚智能科技有限公司；Five Easy Plus FE28雙標(biāo)度pH/ORP計(jì)，Mettler Toledo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 SAEW的制備

為比較不同電解質(zhì)產(chǎn)生的不同有效氯濃度(available chlorine concentrations, ACC)的SAEW對(duì)黃豆發(fā)芽的影響，本研究以實(shí)驗(yàn)室前期研究所采用的參數(shù)為基礎(chǔ)[12]，由發(fā)生器1(Harmony-II，電解質(zhì)60 g/L NaCl)和發(fā)生器2(HD-240L，電解質(zhì)60 g/L HCl)制備ACC為35、70 mg/L的SAEW，在制備完成后立即檢測(cè)其理化參數(shù)。ACC由氯量計(jì)測(cè)定。pH和氧化還原電位(oxidation-reduction potential, ORP)由雙標(biāo)度pH/ORP計(jì)測(cè)量。本研究所用處理溶液的理化參數(shù)如表1所示。

表1 處理溶液的理化參數(shù)Table 1 The physicochemical parameters of the treatment solutions

注: CK指自來水，NaCl 70、NaCl 35、HCl 70和HCl 35指電解NaCl或HCl溶液得到的ACC分別為70 mg/L或者35 mg/L 的SAEW

1.3.2 浸種與發(fā)芽

剔除蟲蛀、干癟、畸形、超小粒黃豆。每組稱取黃豆200 g，用200 mL相應(yīng)溶液輕柔清洗，棄去清洗液，重復(fù)3次。將清洗過的種子在600 mL相應(yīng)溶液中浸泡12 h，棄去浸泡液，將種子置于發(fā)芽筐(直徑16 cm)中，覆蓋8層無菌紗布，避光發(fā)芽。每天用相應(yīng)處理溶液淋洗5次，第4天收獲。收獲后黃豆芽置于4 ℃冰箱暫存。

1.3.3 微生物分析

采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)黃豆發(fā)芽過程中的微生物數(shù)量。黃豆發(fā)芽期間，每天在第1次淋水后3 h隨機(jī)采樣25 g，置于無菌自封袋。自封袋中加入100 mL質(zhì)量濃度為8.5 g/L NaCl溶液，以12次/s的速度在均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)2 min以充分洗脫樣品表面微生物，充分混勻后取1 mL均質(zhì)液進(jìn)行梯度稀釋。取稀釋梯度合適的菌液0.1 mL，分別涂布于PCA平板、VRBA平板和孟加拉紅瓊脂平板，PCA平板置于37 ℃培養(yǎng)48 h，VRBA平板置于37 ℃培養(yǎng)24 h，孟加拉紅平板置于28 ℃培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后分別進(jìn)行菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母計(jì)數(shù)，記錄為3次重復(fù)測(cè)定的平均值，以lg CFU/g表示。本實(shí)驗(yàn)采用的平板菌落計(jì)數(shù)法的檢出限為1.70 lg CFU/g，即結(jié)果表示為無法檢出或0時(shí)，表示微生物數(shù)<1.70 lg CFU/g。

1.3.4 黃豆的發(fā)芽特性

將150粒黃豆按照1.3.2方法清洗、浸泡12 h后瀝干水分，平鋪于濾紙靜置10 min。測(cè)定浸泡前后黃豆的質(zhì)量。吸水率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：W1為樣品浸泡前黃豆質(zhì)量，g；W2為樣品浸泡后黃豆質(zhì)量，g。

在直徑18 cm的培養(yǎng)皿底部鋪1層濾紙，將種子均勻鋪在濾紙上，并在種子上覆蓋2層濾紙待其發(fā)芽，每天噴淋相應(yīng)溶液5次以保持水分，每12 h檢測(cè)1次發(fā)芽種子數(shù)。黃豆發(fā)芽以種子破皮露白超過1 mm為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)芽率按公式(2)計(jì)算：

(2)

1.3.5 黃豆芽的生長指標(biāo)

豆芽成熟后，從每個(gè)發(fā)芽筐中隨機(jī)抽取50株黃豆芽，用直尺(最小刻度為0.5 mm)測(cè)量芽長，用游標(biāo)卡尺(最小刻度為0.02 mm)測(cè)量莖粗。取平均值作為黃豆芽芽長和莖粗。

每組隨機(jī)取出100株豆芽稱重，測(cè)量黃豆芽鮮重/百株重(g/100株)。

1.3.6 黃豆芽的營養(yǎng)特性

黃豆芽收獲后4 h內(nèi)，隨機(jī)取樣，用VC試劑盒和植物類黃酮試劑盒檢測(cè)VC和類黃酮的含量，VC含量以μg/g表示，類黃酮含量以mg/g表示。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

本研究的數(shù)據(jù)來源于3次獨(dú)立的重復(fù)試驗(yàn)。以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(IBM SPSS Statistics 25)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用SNK法分析差異顯著性，顯著性水平設(shè)置為0.05；采用Origin 2017繪圖軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 SAEW對(duì)黃豆發(fā)芽過程中微生物的控制效果

SAEW處理的黃豆在發(fā)芽過程中的菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母總數(shù)變化如圖1所示。第4天收獲時(shí)，CK處理組黃豆芽的菌落總數(shù)達(dá)到8.59 lg CFU/g。研究表明，細(xì)菌可以在種子的縫隙中隱藏而免受消毒劑的傷害[16]。即使經(jīng)消毒劑處理后殘留微生物極少，經(jīng)過發(fā)芽，微生物數(shù)量也會(huì)呈指數(shù)增長，最終可達(dá)到7～8 lg CFU/g[17]。糙米經(jīng)ACC為50 mg/L的SAEW浸泡30或60 min后，微生物降至無法檢出(平板菌落計(jì)數(shù))的水平，但是在發(fā)芽48 h后，存活于糙米表皮褶皺或縫隙中的微生物快速生長繁殖，數(shù)量達(dá)到8～9 lg CFU/g[18]。如果將大腸桿菌接種在蘿卜種子上，其數(shù)量經(jīng)ACC為20 000 mg/L的次氯酸鈉溶液處理后顯著減少，而發(fā)芽72 h后與未經(jīng)消毒處理的對(duì)照組大腸桿菌數(shù)量處于同一水平[6]。以上研究表明，在種子的清洗、浸泡階段很難將微生物徹底殺滅，而存活下來的微生物會(huì)在發(fā)芽過程中利用合適的環(huán)境條件和種子本身的營養(yǎng)物質(zhì)快速繁殖，數(shù)量增至較高水平。因此，在種子發(fā)芽的整個(gè)過程中都應(yīng)當(dāng)采取消毒措施。

本研究將SAEW應(yīng)用于黃豆清洗、浸泡、發(fā)芽全過程。如圖1-a所示，第1天，經(jīng)過12 h的浸泡，CK、NaCl 70、NaCl 35,、HCl 70和HCl 35處理組黃豆表面菌落總數(shù)分別為4.33、0、2.67、0、2.53 lg CFU/g，第2天分別增至7.81、5.43、6.03、5.63和6.14 lg CFU/g。菌落總數(shù)在第2天出現(xiàn)明顯增長，原因可能是，附著在種子上的微生物在種子發(fā)芽初期仍然處于休眠狀態(tài)，在合適條件下,一段時(shí)間后微生物被激活并迅速生長繁殖。在第4天時(shí)，CK、NaCl 70、NaCl 35、HCl 70和HCl 35處理組黃豆芽菌落總數(shù)分別為8.59、6.19、7.28、6.40和7.26 lg CFU/g，SAEW處理組顯著降低了黃豆芽表面菌落總數(shù)(P< 0.05)。與ACC為35 mg/L的SAEW相比，ACC為70 mg/L的SAEW具有更好的殺菌效果。不同電解液產(chǎn)生的相同ACC的SAEW對(duì)微生物的控制效果沒有顯著差異，說明ACC是SAEW殺菌的主要影響因素，電解質(zhì)對(duì)其殺菌效果沒有明顯影響。各處理組大腸菌群、霉菌和酵母數(shù)與菌落總數(shù)的變化趨勢(shì)相似。

a-菌落總數(shù);b-大腸菌群;c-霉菌和酵母圖1 黃豆發(fā)芽過程中不同處理組的微生物數(shù)Fig.1 The counts of natural microbiota on soybean sprouts treated by different solutions during seed germination注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 SAEW對(duì)黃豆發(fā)芽特性的影響

2.2.1 SAEW對(duì)黃豆吸水率的影響

如圖2-a可知，各處理組間黃豆的吸水率無顯著差異。在萌芽階段，種子需要吸收充足的水分而膨大，進(jìn)而種皮破裂、出現(xiàn)萌芽，因此，充分吸水是種子萌發(fā)的必要條件[19]。研究表明，糙米在SAEW中浸泡24 h后，與自來水處理相比，吸水率沒有顯著差異[18]，與本研究結(jié)果相似。與自來水相比，SAEW處理對(duì)黃豆種子萌發(fā)時(shí)的吸水過程沒有不利影響。

2.2.2 SAEW對(duì)黃豆發(fā)芽率的影響

由圖2-b可知，SAEW處理組12 h時(shí)的黃豆發(fā)芽率與自來水處理組無明顯差異，但24 h的發(fā)芽率顯著高于自來水組，在發(fā)芽結(jié)束時(shí)，不同處理組的黃豆發(fā)芽率接近。有研究表明，SAEW處理對(duì)蕎麥和蘿卜的發(fā)芽率沒有顯著影響[13, 20]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。周艷鑫等[21]用掃描電鏡觀察SAEW浸泡過的綠豆表面，發(fā)現(xiàn)SAEW可加重對(duì)綠豆表面的蠟狀表皮結(jié)構(gòu)的破壞。水被電解以后，水分子團(tuán)簇結(jié)構(gòu)變小，更容易進(jìn)入細(xì)胞。因此經(jīng)SAEW處理，黃豆種子表皮受到破壞，相比自來水處理組更容易破裂，從而有利于萌芽較早出現(xiàn)，但最終發(fā)芽率與自來水處理組趨于一致。

a-吸水率;b-發(fā)芽率圖2 不同處理組黃豆的發(fā)芽特性Fig.2 The geimination properties soybean sprouts treated by different solutions

2.3 SAEW對(duì)黃豆芽生長指標(biāo)的影響

黃豆發(fā)芽4 d后收獲并測(cè)定其芽長、莖粗、鮮重，結(jié)果如表2所示。SAEW處理組黃豆芽的芽長較自來水處理組芽長短，ACC較大的SAEW對(duì)芽長的抑制更明顯；然而，經(jīng)SAEW處理的黃豆芽莖粗均大于自來水處理組；各處理組間黃豆芽鮮重沒有顯著差異。自來水處理的豆芽長而細(xì)，SAEW處理的豆芽短而粗。有研究表明，相比自來水處理組，經(jīng)SAEW處理后蕎麥芽的芽長較短，且高ACC(90 mg/L)的SAEW相比低ACC(10、30 mg/L)的SAEW有更顯著的抑制作用[13]，與本研究結(jié)果相似。SAEW處理雖然對(duì)黃豆芽的長度有抑制作用，但對(duì)其鮮重沒有不利影響，因此，SAEW可以用于黃豆發(fā)芽。

表2 不同處理組黃豆芽的生長指標(biāo)Table 2 The growth properties of soybean sprouts treated by different solutions

2.4 SAEW對(duì)黃豆芽營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

2.4.1 SAEW對(duì)黃豆芽VC含量的影響

如圖3所示，CK、NaCl 70、NaCl 35、HCl 70和HCl 35處理組的黃豆芽VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.02、5.74、6.37、6.90和7.78 μg/g。以NaCl為電解質(zhì)的SAEW對(duì)黃豆芽VC含量沒有顯著影響；HCl 35處理組黃豆芽中VC含量顯著提高(P<0.05)。VC又稱為抗壞血酸，是一種重要的水溶性抗氧化劑，有利于人體健康，并在植物生長中起著重要調(diào)節(jié)作用[22]。劉瑞等[23]發(fā)現(xiàn)，SAEW處理可以增加綠豆芽中的VC含量；趙德錕等[24]用SAEW處理鮮切云南紅梨，雖然在貯藏期間樣品VC含量降低，但從貯藏第3天開始，SAEW處理可以顯著延緩VC的衰減，所以SAEW造成的微酸性環(huán)境可能有利于提高或保持果蔬中VC含量。研究表明，NaCl溶液處理降低黃豆芽、西蘭花芽、鹽芥的VC含量[25-27]，在本研究中，以NaCl為電解質(zhì)的SAEW中含有一定量的Na+，因此經(jīng)其處理的黃豆芽VC含量小于以HCl為電解質(zhì)的SAEW處理組。含Na+的SAEW處理如何影響成熟黃豆芽中的VC含量有待進(jìn)一步研究。

2.4.2 SAEW對(duì)黃豆芽類黃酮含量的影響

類黃酮是蔬菜中常見的酚類化合物，具有較高的抗氧化活性[28]。如圖3所示，CK、NaCl 70、NaCl 35、HCl 70、HCl 35處理組黃豆芽的類黃酮含量分別為1.58、1.48、1.42、1.78、1.85 mg/g，以NaCl為電解質(zhì)的SAEW處理對(duì)類黃酮含量沒有顯著影響，HCl 35處理組黃豆芽的類黃酮含量顯著提高(P<0.05)。有研究表明，SAEW能夠提高綠豆萌發(fā)過程中多種抗氧化酶活性[29]；賈國梁[30]研究發(fā)現(xiàn)，在山藥的儲(chǔ)存過程中，SAEW處理組樣品的抗氧化能力較強(qiáng)，且保持了較高的類黃酮含量。由此可見，SAEW可能提高了黃豆芽的抗氧化能力，通過提高類黃酮合成酶(如苯丙氨酸解氨酶、查爾酮異構(gòu)酶等)活性促進(jìn)黃豆芽中類黃酮的積累。本研究中，在其他條件都相同的情況下，電解質(zhì)為HCl的SAEW處理組黃豆芽的類黃酮含量均高于電解質(zhì)為NaCl的SAEW處理組。研究表明，NaCl溶液處理降低了黃豆芽中多酚、黃酮的含量[25]。經(jīng)過SAEW浸泡處理，綠豆表皮結(jié)構(gòu)的破壞加重[21]；次氯酸鈉處理削弱了兜蘭種子細(xì)胞壁的完整性[31]；LIANG等[13]的研究表明，經(jīng)過SAEW處理，相比自來水，蕎麥吸收了更多的SAEW。經(jīng)電解后，水分子團(tuán)簇結(jié)構(gòu)變小，水分子協(xié)同各種離子更容易進(jìn)入植物細(xì)胞。因此，以NaCl溶液為電解質(zhì)的SAEW可能破壞了黃豆芽表面組織結(jié)構(gòu)，使大量Na+進(jìn)入豆芽。黃豆是鹽敏感型作物[32]，Na+主要在大豆根中積累[33]，大量Na+造成的離子毒性使細(xì)胞膜透性增加，豆芽生理紊亂、滲透失衡，耐受性降低，影響正常發(fā)芽過程，使類黃酮的合成受阻[34]。SAEW處理對(duì)黃豆芽類黃酮含量的影響機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

圖3 不同處理組黃豆芽的營養(yǎng)特性Fig.3 The nutritional properties of soybean sprouts treated by different solutions

3 結(jié)論

不同電解質(zhì)(NaCl和HCl溶液)、不同ACC(35和70 mg/L)的SAEW應(yīng)用于黃豆發(fā)芽過程，能夠有效降低菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母數(shù)，對(duì)黃豆的發(fā)芽和黃豆芽產(chǎn)量沒有不利影響。并且以HCl為電解質(zhì)的SAEW可提高黃豆芽的VC和類黃酮含量。不同電解質(zhì)(NaCl和HCl溶液)對(duì)SAEW的殺菌效果、對(duì)黃豆芽的發(fā)芽特性和生物特性沒有明顯影響。同樣以HCl為電解質(zhì)，相比ACC為35 mg/L的SAEW，ACC為70 mg/L的SAEW對(duì)微生物的控制效果更好，但經(jīng)較高ACC的SAEW處理的黃豆芽芽長較短、VC和類黃酮含量均略低。因此，從微生物安全性、芽苗菜食用性及營養(yǎng)等方面考慮，電解HCl溶液產(chǎn)生的ACC為35 mg/L的SAEW更適合黃豆芽的生產(chǎn)。