高聚原花青素新型降解產物生物活性研究

陳夢穎，索昊，張舒婷*，孫寶山*

（1. 沈陽藥科大學功能食品與葡萄酒學院，遼寧沈陽 110016；2. 深圳大學高等研究院，廣東深圳 518060）

葡萄酒釀造過程中可產生大量的副產物——葡萄渣，常作為廢物被丟棄，成為環(huán)境污染源之一。利用葡萄渣制備具有生物活性的小分子物質無疑具有良好的經濟和社會效益。葡萄籽富含原花青素類成分，基于其強效的抗氧化特性，近年來備受關注。原花青素單倍體和低聚體可直接吸收入血，發(fā)揮功效[1-2]，而高聚體則由于聚合度高，難以被人體吸收，導致生物利用度低；還會抑制機體內的α-淀粉酶、脂肪酶、α-葡萄糖苷酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶的活性[3-5]。因此，將高聚原花青素降解轉化為低分子活性物質成為葡萄酒廢渣利用的新途徑。本研究選用葡萄酒生產過程中的副產物葡萄籽高聚原花青素作為研究對象，采用實驗室首次建立的降解方法，利用新型親核試劑硫普羅寧完全降解高聚原花青素，獲得新型降解產物。對所獲得降解產物進行應用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、2,2-連氮-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）自由基清除作用以及總抗氧化能力的體外抗氧化活性研究，建立H9C2和PC12細胞氧糖剝奪模型來研究新型降解產物對兩種細胞損傷的保護作用，并從構效關系角度探究降解產物活性的變化規(guī)律，對新型降解產物的潛在生物活性及構效關系進行初步探索。

1 材料和儀器

1.1 材料與試劑

葡萄籽原花青素提取物購自天津尖峰有限公司。

硫普羅寧購自瑪雅生物科技有限公司；L-抗壞血酸購自瑞士Fluka公司；過硫酸鉀、醋酸鈉、三氯化鐵、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均購自博迪化工有限公司；醋酸購自科密歐化工有限公司；濃鹽酸、甲醇（分析級）、乙酸乙酯（分析級）購自富宇精細化工有限公司；無糖DMEM培養(yǎng)液、高糖DMEM培養(yǎng)液、RPMI 1640均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、DPPH、ABTS、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪（TPTZ）、奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox）、DMSO均購自美國Sigma-Aldrich公司；CT、ECT、ECGT均為實驗室自制（純度＞96.5%）；大鼠H9C2（2-1）心肌細胞、大鼠PC12神經細胞均購于北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜ACQUITY UPLC H-CLASS、Waters 2695、Waters PDA檢測器、Empower 2工作站，均產自美國沃特世公司；高速逆流色譜儀（TBE-300C），上海同田生化技術有限公司；YMC ODS-A-HG和5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本YMC公司；KH-250DE超聲儀，禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；缺氧小室，加拿大Stemcell公司。

2 方法

2.1 高聚原花青素的制備降解與分離純化

2.1.1 高聚原花青素的制備

稱取適量葡萄籽原花青素提取物加入100 mL蒸餾水溶解。將溶液上樣于蒸餾水預處理后的YMC ODS-A-HG（200×25 mm，25～40 μm）C18色譜柱，依次加入蒸餾水（pH7.0）、乙酸乙酯各200 mL洗脫層析柱，最后以200 mL甲醇洗脫出高聚原花青素。將高聚原花青素粗提液蒸發(fā)去除溶劑、蒸餾水溶解、凍干，粉末于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 高聚原花青素的降解

稱高聚原花青素提取物約1 g，置于500 mL具塞反應瓶中，依次加入甲醇200 mL、濃鹽酸6.6 mL、硫普羅寧1 g，混勻密閉，于55 ℃反應60 min，冰浴終止反應。加入適量的水，并用0.1 mol NaHCO3調節(jié)pH7.0，旋轉蒸發(fā)替換甲醇溶劑，乙酸乙酯（200 mL）萃取3次。合并萃取層，加入適量的無水硫酸鈉除水，40 ℃減壓濃縮乙酸乙酯萃取層。真空凍干，粉末于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 高速逆流色譜法分離降解產物

高速逆流色譜法的（H S C C C）色譜條件參考索昊等[6]的方法以正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝0.12∶1.5∶0.5∶1（vol）為溶劑體系，采用正接正轉的洗脫模式。在25 ℃恒溫條件下，以流速35 mL/min和轉速950 r/min對400 mg降解產物進行分離制備。在波長254 nm下檢測記錄，根據色譜圖手動收集流出組分，35 ℃真空濃縮后，冷凍干燥備用。

2.1.4 降解產物的純化

色譜條件為YMC-Triart C18色譜柱（250 mm×10 mm，5μm）。柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量：100 μL；流速：2.5 mL/min；洗脫條件：A為0.2%甲酸水溶液，B為0.2%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序如表1。

2.2 降解產物的抗氧化活性研究

2.2.1 對照溶液及供試品溶液制備

稱取Trolox對照品約10.3 mg至10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，分別制得摩爾濃度為1.003 mmol的對照品儲備液。精密量取上述對照品溶液適量，用甲醇稀釋成濃度分別為0.201、0.401、0.602、0.802、1.003 mmol Trolox系列對照溶液。

精密稱取兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、兒茶素-4β-S-硫普羅寧甲酯（CT）、表兒茶素-4β-S-硫普羅寧甲酯（ECT）和表兒茶素沒食子酸酯-4β-S-硫普羅寧甲酯（ECGT）置于5 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，制得對照品儲備液，即C（4 mmol）、EC（4 mmol）、ECG（2 mmol）、CT（2 mmol）、ECT（2 mmol）、ECGT（2 mmol）。分別精密量取上述對照品溶液適量，用甲醇分別稀釋成一系列摩爾濃度的供試品溶液。

2.2.2 DPPH自由基清除能力測定

參考Sá和Brand-Williams等[7-8]的方法，略作修改。96孔板中每孔依次加入DPPH工作液200 μL，不同濃度的供試品溶液或Trolox對照溶液5 μL，以DPPH工作液200 μL+甲醇5 μL為空白，每個濃度設3個復孔。室溫下暗處放置60 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定供試品、對照和空白溶液在517 nm處的吸光度，計算清除率SR，同時將能夠有效清除50%自由基的樣品濃度定義為抗氧化活性（EC50）。

A0為空白液吸光度；Ai為對照或供試品液吸光度。

2.2.3 ABTS自由基清除能力的測定

在96孔板中依次加入200 μL的ABTS工作液和10 μL不同濃度的樣品溶液和VC、Trolox溶液，搖勻，室溫下動態(tài)測定波長734 nm處的吸光度A（n＝3）。空白組用pH 4.5醋酸緩沖液代替ABTS工作液，對照組用甲醇代替樣品溶液。計算清除率SR，同時將能夠有效清除50%自由基的樣品濃度定義為抗氧化活性（EC50）。

2.2.4 FRAP法測定總抗氧化能力

在96孔板中依次加入180 μL的FRAP工作液和5 μL不同濃度的樣品溶液，Trolox、FeSO4溶液，搖勻，在37 ℃下進行孵育，動態(tài)測定波長在593 nm處的吸光度A（n＝3）。對照組用甲醇代替樣品溶液，空白組用pH 3.6醋酸緩沖液代替FRAP工作液，以FeSO4溶液濃度為縱坐標，A為橫坐標繪制標準曲線。根據反應后A值，在標準曲線上求得相對應的FeSO4的濃度（mmol），將其定義為FRAP值[9]。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

2.3 降解產物對氧糖剝奪12h致大鼠PC12神經細胞及H9C2心肌細胞損傷的保護作用

2.3.1 細胞培養(yǎng)

將H9C2細胞培養(yǎng)于含有89%DMEM、10%Gibco FBS、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。PC12神經細胞的培養(yǎng)同H9C2細胞培養(yǎng)，但PC12神經細胞基本培養(yǎng)基為RPMI 1640。

2.3.2 氧糖剝奪試驗

將細胞正常培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內，待細胞飽和度達到80%～90%時進行傳代，待細胞貼壁穩(wěn)定24 h后，對照組換成正常培養(yǎng)液，于正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)；模型組換成無糖DMEM培養(yǎng)液，不含血清；給藥組換成無糖DMEM配置相應濃度藥物，不含血清。模型組和給藥組同時放入缺氧小室（95%N2＋5%CO2），氧糖剝奪12 h進行細胞存活率測定。

2.3.3 噻唑藍（MTT）法測定細胞存活率

氧糖剝奪時間結束后棄去細胞培養(yǎng)液，換成新鮮培養(yǎng)液；每孔加入10 μL配制好的MTT溶液（0.5 mg/mL），使細胞與MTT于37 ℃下共同作用4 h后，棄掉上清，加入100 μL DMSO于570 nm處測定OD值。

國內齒圈熱處理主要應用高頻感應淬火工藝，但是因感應器的結構會帶來不同的淬硬效果。通常齒圈上下兩端面的淬硬層深度相同，即兩端面的淬硬層硬度也相同，硬度高了就會產生齒心部脆易斷裂的缺陷，大大降低齒的耐用性。在齒圈的實際工作時，僅僅與嚙合齒輪接近的端面受較大的沖擊，而與飛輪連接貼合的端面應該保持較軟具有緩沖的功用最佳。這樣歸結起來就是齒面硬、齒心部相對較軟才是最佳的齒圈淬火狀態(tài)，倒梯形結構的淬火感應器可以達到這個“外硬內軟”的理想狀態(tài)。

數據處理：以一次實驗3個復孔計算每組樣品的平均OD值。按照公式：CV/%=OD(給藥組)/OD(對照組)×100，計算出細胞相對活力變異系數（CV）。相同實驗重復3次，以3次CV%平均值進行數據統(tǒng)計。

2.4 數據分析

試驗數據用SPSS 22.0軟件處理，用GrahPad Prism 6.0作圖。采用單因素方差分析（ANOVA）和雙變量相關性分析，并用Dunnett's test分析方法比較組間差異，結果表示為平均值±標準差（SD）。

3 結果與分析

3.1 高聚原花青素制備降解及分離純化

采用硫普羅寧作為親核試劑完全降解葡萄籽高聚原花青素，運用HSCCC結合半制備液相色譜分離高聚原花青素降解產物，共獲得3個原花青素單體成分，分別是兒茶素（C）、表兒茶素（EC）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）；3種新型降解產物分別為硫普羅寧衍生物兒茶素-4β-S-硫普羅寧甲酯（CT）、表兒茶素-4β-S-硫普羅寧甲酯（ECT）和表兒茶素沒食子酸酯-4β-S-硫普羅寧甲酯（ECGT）。一步HSCCC可以成功分離獲得3個單體降解產物和一個組分A，其中單體降解產物ECG、ECT、ECGT的產量為6.50 mg、29.8 mg、10.3 mg，純度分別為90.3%、93.7%、89.5%。組分A經半制備液相色譜分離與純化，獲得C、EC與CT，產量分別為12.2 mg、7.70 mg與11.8 mg，純度均可以達到95%以上。

3.2 降解產物的抗氧化活性

3.2.1 降解產物的體外DPPH自由基的清除能力

對不同濃度6種降解產物的體外DPPH自由基的清除能力進行測定，對它們的抗氧化性進行初步評價，EC50值與線性范圍見表2。6種降解產物的EC50值在210～350，均小于Trolox（陽性對照）的EC50788.24，表明6種降解產物清除DPPH自由基的能力強于Trolox（陽性對照）。其中活性最強的是ECG。C、CT、ECT的抗氧化活性相似。

3.2.2 降解產物的體外ABTS自由基的清除能力

6種降解產物的EC50值在72～141，均小于陽性對照Trolox的EC50值384，即6種降解產物清除ABTS自由基能力均強于陽性對照。C、EC和ECT之間以及ECG、CT和ECGT之間清除ABTS自由基能力無顯著性差異，其中ECG清除ABTS自由基的能力最強（表3）。

3.2.3 FRAP法測定總抗氧化能力

6種降解產物的FRAP值與范圍見表4。測定結果與DPPH和ABTS抗氧化的結果相似，各降解產物的FRAP值在2.21～2.96，大于Trolox（陽性對照）的FRAP 2.03，即6種降解產物的還原Fe3+-TPTZ能力均大于Trolox（陽性對照）。C和CT之間FRAP以及EC和ECT之間的FRAP還原能力無顯著差異。降解產物中ECG的還原能力最大，ECT的還原能力最小。

綜合分析DPPH、ABTS和FRAP三種方法的抗氧化活性測定結果，6種原花青素降解產物的抗氧化活性均大于陽性對照Trolox，活性順序為ECG＞ECGT＞CT≈C＞ECT≈EC＞Trolox。降解獲得到的6種化合物有希望作為強效的抗氧化劑使用。

3.3 降解產物對氧糖剝奪致大鼠PC12神經細胞及H9C2心肌細胞損傷的保護作用研究

3.3.1 降解產物對氧糖剝奪致大鼠PC12神經細胞損傷的保護作用

表2 DPPH法測定的6種化合物的抗氧化活性和線性范圍Table 2 Antioxidant activity and linear range of six compounds by DPPH assays

表3 ABTS法測定的6種化合物的抗氧化活性和線性范圍Table 3 Antioxidant activity and linear range of six compounds by ABTS assays

表4 FRAP測定的6種化合物的抗氧化活性和線性范圍Table 4 Antioxidant activity and linear range of six compounds by FRAP assays

如圖1所示，與對照組相比，氧糖剝奪12 h后模型組細胞存活率明顯下降，表明已成功建立了氧糖剝奪致PC12神經細胞損傷模型。在原花青素的6種降解產物中，ECGT在11 μmol和33 μmol時可以顯著提高氧糖剝奪的PC12神經細胞的存活率，并呈現(xiàn)出明顯地劑量依賴性，而降解產物C、EC和ECG未見其對氧糖剝奪12 h致PC12神經細胞存活率有明顯的積極作用。此外，通過C和CT、EC和ECT以及ECG和ECGT的三對母體與衍生物的結果對比中發(fā)現(xiàn)，在ECG對細胞損傷不具有明顯改善作用時，ECGT能夠表現(xiàn)出較好的改善作用。側面反映ECG在引入硫普羅寧甲酯基團結構發(fā)生改變后能夠對細胞損傷的保護起到積極作用，說明ECGT的活性強于ECG。

3.3.2 降解產物對氧糖剝奪致大鼠H9C2心肌細胞損傷的保護作用

如圖2所示，與對照組相比，氧糖剝奪12 h后模型組細胞存活率顯著降低，表明已成功建立氧糖剝奪致H9C2心肌細胞損傷模型。在原花青素的6種降解產物中，ECGT在33 μmol時可以顯著提高氧糖剝奪12 h致H9C2心肌細胞損傷的細胞存活率，而降解產物CT和ECT均未見其對氧糖剝奪12 h致H9C2心肌細胞存活率具有改善作用。

通過對氧糖剝奪致神經細胞和心肌細胞損傷兩種模型的作用結果可以得出，降解衍生物ECGT對兩種模型的細胞損傷均具有顯著的改善作用，其活性強于其它兩個降解產物CT、ECT。

圖1 降解產物對OGD誘導的PC12細胞活力降低的影響Figure 1 Effects of degradation products on OGD-induced reduction of PC12 cell viability###: P＜0.001 vs.ctrl, **: P＜0.01, ***: P＜0.001 vs.model

圖2 降解產物對OGD誘導的H9C2細胞活力降低的影響Figure 2 Effects of degradation products on OGD-induced reduction of H9C2 cell viability###: P＜0.001 vs.ctrl, ***: P＜0.001 vs.model

4 討論與結論

抗氧化研究方面，6種降解產物的抗氧化活性與其自身化學結構密切相關。總體趨勢是母體中的羥基數目越多，其抗氧化能力越強，因此原花青素ECG及其衍生物ECGT的抗氧化活性明顯高于非沒食子酰基的原花青素C、EC及其衍生物CT、ECT。研究表明，降解衍生物對母體進行修飾，引入帶有羥基的化合物，可以增強母體的抗氧化活性。在本課題組的前期研究中，Zhang等[10]采用間苯三酚作為親核試劑，在酸性條件下葡萄籽高聚原花青素能高效的降解為原花青素單體C、EC、ECG及其間苯三酚衍生物CP、ECP、ECGP。在上述6種降解產物中，連接有間苯三酚（P）的ECGP的抗氧化活性高于其他5種化合物，而相應的衍生物CP、ECP的抗氧化活性也高于其母核C、EC。而本研究中，在母體化合物中引入硫普羅寧甲酯后，其衍生產物的抗氧化活性并沒有得到顯著加強，這可能與硫普羅寧甲酯的化學結構有關。

氧糖剝奪致細胞損傷的保護作用方面，從新型降解產物CT、ECT和ECGT化學結構看，ECGT的羥基數目最多，說明羥基數目的多少影響對氧糖剝奪致細胞損傷的改善活性。羥基數目越多，其活性越強。在對比母體ECG和降解產物ECGT的活性時發(fā)現(xiàn)，在母體ECG沒有明顯改善作用的濃度下，降解衍生物ECGT對氧糖剝奪后的兩種細胞均具有較好的改善作用。從ECG與ECGT的結構分析，引入硫普羅寧甲酯后，新型降解產物ECGT的活性強于母體ECG，說明引入硫普羅寧甲酯也可以增加細胞的存活率。

眾所周知，原花青素具有強的抗氧化活性，其對心腦血管具有保護作用[11-13]。親核試劑硫普羅寧也有減輕阿霉素所致大鼠心肌組織的氧化損傷而達到對心肌組織的保護作用等報道[14]。原花青素-硫普羅寧衍生物的結構特點表明，其有可能成為一種新的抗氧化劑和心腦血管保護劑。本研究以葡萄酒生產過程中的廢棄物葡萄籽高聚原花青素為研究對象，采用新型親核試劑硫普羅寧對其進行降解轉化。首次對高聚原花青素的新型降解產物CT、ECT和ECGT的生物活性進行研究。結果表明，3種新型降解產物CT、ECT、ECGT及其母體化合物均具有強抗氧化活性。降解產物對氧糖剝奪致H9C2心肌細胞及PC12神經細胞損傷的保護作用研究中，引入硫普羅寧的新型降解衍生物ECGT對氧糖剝奪損傷后的細胞有顯著的改善作用。因此，ECGT等作為原花青素與硫普羅寧加成的降解衍生物，其抗氧化活性可顯著的改善細胞損傷活性，即高聚原花青素降解轉化為可利用的生物活性物質，為今后葡萄酒廢棄物高聚原花青素的開發(fā)利用提供又一有效方法。