隱丹參酮對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制

黃治偉，譚鵬,2，杜毅超,2，石昊，陳浩，錢保林，劉羽，付文廣,2，李秋

[西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1.普通外科（肝膽） 2.四川省院士（專家）工作站，四川 瀘州 646000；3.西昌市人民醫(yī)院 普通外科，四川 涼山 615000]

胰腺癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率在消化道腫瘤里排名第6位。由于胰腺特殊的解剖學(xué)位置，及腫瘤早期癥狀不典型，患者就診時(shí)多已是晚期，因此臨床治療預(yù)后極差[1]。目前臨床治療胰腺癌的方式首選手術(shù)，但確診后僅有20%的患者適合手術(shù)，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)80%，對于局部晚期不能切除或者轉(zhuǎn)移性胰腺癌的患者，可采用吉西他濱、舒尼替尼等進(jìn)行化療或靶向藥物治療，有研究[2]表明，化療及靶向藥物聯(lián)合使用比單獨(dú)用藥具有更好的療效。盡管近年來胰腺癌的診治獲得了一定的發(fā)展，但患者的5年總體生存率仍低于10%，究其原因還是癌細(xì)胞的高生長性與轉(zhuǎn)移性[3-4]。因此，研發(fā)新藥物用以抑制癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移是治療胰腺癌的基礎(chǔ)。

中醫(yī)藥用于腫瘤的治療在我國由來已久，其作用靶點(diǎn)多、療效顯著等優(yōu)勢使得越來越多的中草藥研發(fā)得以開展[5]。隱丹參酮（cryptotanshinone，CPT）是一種從植物丹參中提取的天然產(chǎn)物，除具有抗炎、抗纖維化的作用外還能抑制腫瘤細(xì)胞的生長，如宮頸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞等[6-9]。但其對胰腺癌細(xì)胞抑制作用的機(jī)制鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究隱丹參酮對人胰腺癌細(xì)胞BxPC-3及SW1990生長和遷移的影響，以及其潛在的分子機(jī)制，為其作為胰腺癌的臨床治療手段提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3和SW1990，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。隱丹參酮（分子式：C??H??O?），純度≥98%，規(guī)格20 mg/瓶，貨號(hào)SC8640，購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA強(qiáng)裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、CCK-8試劑、結(jié)晶紫染色液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CDK4抗體、GAPDH抗體、山羊抗鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；vimentin抗體購自武漢塞維爾生物科技有限公司；Akt抗體購自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司；p-Akt抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)、分組及處理采用含10% 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3 和SW1990，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)傳代，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞分別分為4 組：對照組（DMSO）以及低、中、高3個(gè)濃度（10、20、40 μmol/L）CPT 處理組。

1.2.2 細(xì)胞的活力檢測取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，將實(shí)驗(yàn)組與對照組BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞以2×103/ 孔接種于96 孔板中培養(yǎng)，每組設(shè)置5 個(gè)重復(fù)，分別在0、1、2、3 d 時(shí)，加入CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后，用全光譜分光光度計(jì)測量光密度（OD450nm）。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞克隆形成的能力將實(shí)驗(yàn)組及對照組的BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞以2×103/孔均勻接種于6 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)24 h 后將液體換為正常培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)10 d，甲醇固定30 min 后PBS 洗凈，用結(jié)晶紫染色液染色25 min，PBS 洗凈，拍照并對鏡下細(xì)胞數(shù)多于50 個(gè)細(xì)胞的克隆細(xì)胞團(tuán)計(jì)數(shù)，計(jì)算相對克隆形成率= 實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/ 對照組克隆數(shù)×100%。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力的改變將對數(shù)生長期的BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞均勻接種于6 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到6 孔板80%～90% 時(shí)，用無菌槍頭在培養(yǎng)皿中央劃出直線，換液時(shí)，實(shí)驗(yàn)組給予CPT（10、20、40 μmol/L）處理24 h，對照組給予等量DMSO 處理, 分別在0 h 和24 h 時(shí)置于顯微鏡下觀察并拍照。計(jì)算劃痕愈合程度=（24 h 劃痕距離-0 h 劃痕距 離）/0 h 劃痕距離×100%。

1.2.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力DMEM培養(yǎng)基與Matrigel 基質(zhì)膠與冰上等比混勻，每個(gè)Transwell 小室加入100 μL 震蕩混勻，將小室連同24 孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中凝固，實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞以2×105/孔鋪于小室中，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后將濾膜固定在4% 多聚甲醛中并用結(jié)晶紫染色，拍照后對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.6 Western blot 檢測采用濃度為20 μmol/L的CPT 處理BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞，將等量的DMSO 處理作為對照，分別在1、2、3 d 時(shí)收集細(xì)胞，加入裂解液充分裂解，提取上清液，BCA 法測定蛋白濃度，加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，煮沸制備成樣品，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳，冰浴恒流轉(zhuǎn)膜后5%BSA 室溫封閉。加入1:1000 稀釋的Akt、p-Akt、vimentin、E-cadherin、CDK4、cyclin D1、GAPDH 一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育后顯影，并對灰度值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CPT 對BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞活力的影響

不同濃度CPT作用于人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3和SW1990不同時(shí)間后，CCK-8法檢測細(xì)胞活力。與對照組比較，低、中、高3個(gè)濃度CPT處理組細(xì)胞活力明顯降低，且作用時(shí)間越長，細(xì)胞活力越低（均P＜0.05）（圖1）。提示CPT能明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的生長，且呈濃度和時(shí)間依耐性。

2.2 CPT 對BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞克隆形成能力的影響

不同濃度CPT處理BxPC-3 和SW1990細(xì)胞 24 h后更換為正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10 d，觀察細(xì)胞克隆形成情況并計(jì)算相對克隆形成率，結(jié)果顯示，CPT處理后細(xì)胞克隆形成數(shù)量明顯減少，并且CPT濃度越大，抑制作用越強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01）（圖2）。

圖1 不同濃度CPT 處理不同時(shí)間對BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞活力的影響Figure 1 Effects of treatment of different concentrations of CPT for different times on the viability of BxPC-3 and SW1990 cells

圖2 不同濃度的CPT 對人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞克隆形成能力的影響Figure 2 Effects of different concentrations of CPT on the colony forming ability of human pancreatic cancer BxPC-3 and SW1990 cells

2.3 CPT 對BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞遷移能力的影響

不同濃度藥物作用24 h 后，BxPC-3 細(xì)胞劃痕愈合程度分別為（58.20±2.67）%、（23.45±10.00）%、（17.05±3.79）%，對照組為（84.93±9.19）%，SW1990細(xì)胞對照組與藥物處理組劃痕愈合程度分別（53.72±3.40）%、3（39.37±6.78）%、（9.42±2.01）%、（6.36±0.20）%，兩種細(xì)胞對照組與實(shí)驗(yàn)組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）（圖3）。

圖3 不同濃度的CPT 處理24 h 對BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞遷移能力的影響Figure 3 Effect of treatment of different concentrations of CPT for 24 h on migration abilities of BxPC-3 and SW1990 cells

2.4 CPT 對BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞侵襲能力的影響

不同濃度CPT處理BxPC-3和SW1990細(xì)胞24 h后，與對照組比較，穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表明CPT能夠有效降低胰腺癌細(xì)胞的侵襲力，并且這一作用具有濃度依賴性（均P＜0.01）（圖4）。

圖4 不同濃度的CPT 處理24 h 對BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 4 Effect treatment of different concentrations of CPT for 24 h on the invasion ability of BxPC-3 and SW1990 cells

2.5 CPT 對BxPC-3 和SW1990 細(xì) 胞Akt 相 關(guān)蛋白表達(dá)的影響

CPT 20 μmol/L處理細(xì)胞1、2、3 d后，Akt、p-Akt、蛋白隨著時(shí)間的延長，表達(dá)量逐漸下降，EMT相關(guān)蛋白vimentin、E-cadherin以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4、cyclin D1的表達(dá)也在逐漸下降（P＜0.05或P＜0.01）（圖5），表明CPT可能通過影響Akt的表達(dá)，并進(jìn)一步下調(diào)vimentin、E-cadherin、CDK4、cyclin D1的表達(dá)。

圖5 CPT 對BxPC-3 和SW1990 細(xì)胞Akt、EMT 相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of CPT on expressions of Akt, EMT-associated proteins and cell cycle-related proteins

3 討 論

胰腺癌早期診斷的不明確性以及癌細(xì)胞的高生長與轉(zhuǎn)移能力導(dǎo)致患者死亡率增加，僅15%～20%的患者在診斷時(shí)為早期，具有手術(shù)指征，并且術(shù)前采用新輔助治療可在一定程度上延長患者術(shù)后的生存時(shí)間[10-11]。對于失去手術(shù)指征，或不能耐受手術(shù)的患者，目前常用5-氟尿嘧啶和吉西他濱單獨(dú)或聯(lián)合化療，化療藥物能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但同時(shí)對正常組織細(xì)胞也具有抑制作用，因此治療效果仍不理想[12-13]。而對于局部晚期不能切除或者轉(zhuǎn)移性胰腺癌的患者，可采用厄洛替尼、舒尼替尼、依維莫司等進(jìn)行靶向治療，但其治療費(fèi)用太過昂貴，且大多藥物在我國內(nèi)地還未上市。因此，新治療藥物的研發(fā)，用以抑制胰腺癌細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移，是一個(gè)亟待解決的問題。

CPT是一種從藥用植物丹參中提取的天然產(chǎn)物，除對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等良性疾病具有良好的治療效果外[14-16]，還被證實(shí)具有多種抗癌作用。葉歡等[17]總結(jié)國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，CPT可抑制腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，對腫瘤的生長、侵襲等諸多過程產(chǎn)生影響。其菲醌結(jié)構(gòu)中的菲環(huán)能夠抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成，并通過抑制STAT3磷酸化及降低核轉(zhuǎn)位過程，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)，引起細(xì)胞周期阻滯在G1/G0階段，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；并且CPT可有效阻礙HIF-1α與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合，發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用；此外，CPT通過影響凋亡相關(guān)基因p53、Bcl-2等的表達(dá)，啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡過程；而在腫瘤細(xì)胞侵襲過程中，CPT可通過抑制ICAM-1、VCAM-1以及MMP-9的表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[18-21]。

Akt作為關(guān)鍵蛋白，在胃癌、食管癌、胰腺癌以及肝癌等眾多腫瘤的生長、侵襲、遷移中發(fā)揮著重要作用，Akt的高表達(dá)加快了許多腫瘤的惡性進(jìn)程，如增殖加快，侵襲、遷移能力增強(qiáng)以及EMT的發(fā)生等[22-27]。近來研究表明，Akt蛋白是CPT發(fā)揮抗癌作用的重要靶點(diǎn)，Kim等[28]發(fā)現(xiàn)CPT可下調(diào)Akt/GSK3β通路蛋白表達(dá)，從而抑制非小細(xì)胞肺癌增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Zhang等[29]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)，CPT可通過抑制Akt/mTOR通路，降低結(jié)腸癌的侵襲和遷移能力。已有研究[30]發(fā)現(xiàn)，CPT可通過降低STAT3的表達(dá)，抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡，但其對胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響暫未報(bào)道，并且CPT是否能抑制胰腺癌的EMT進(jìn)程仍未可知，而Akt作為加速腫瘤惡性生物學(xué)行為的重要蛋白，CPT能否通過下調(diào)Akt的表達(dá)而發(fā)揮抗胰腺癌的作用仍需探究。

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的CPT處理胰腺癌BxPC-3和SW1990細(xì)胞，結(jié)果顯示，CPT能夠明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的生長及遷移能力，并且具有濃度依賴性。CDK4作為調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，隨著20 μmol/L CPT處理胰腺癌細(xì)胞時(shí)間的延長，表達(dá)逐漸下降，其下游cyclin D1表達(dá)也隨著CDK4的下調(diào)而減少，這表明CPT可能導(dǎo)致了BxPC-3和SW1990細(xì)胞生長周期阻滯，從而抑制了生長。EMT標(biāo)志蛋白vimentin以及E-cadherin蛋白的表達(dá)也隨著CPT作用時(shí)間的延長而下調(diào)，表明CPT能夠抑制胰腺癌的EMT過程，降低胰腺癌的惡性程度。此外，本研究進(jìn)一步檢測了PI3K/Akt通路中的關(guān)鍵蛋白Akt及其磷酸化后p-Akt的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPT可明顯下調(diào)Akt 蛋白總量，提示CPT下調(diào)磷酸化Akt的表達(dá)可能是通過下調(diào)總Akt蛋白表達(dá)引起的，并不是通過抑制Akt的磷酸化過程引起的。而總Akt蛋白表達(dá)的減少，則可能是由上游PI3K的表達(dá)變化所引起的，但本研究中未檢測Akt上游PI3K的變化，在后續(xù)的研究中將考慮進(jìn)一步完善。

綜上所述，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Akt可能是CPT抑制胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的機(jī)制中的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)。CPT能夠同時(shí)下調(diào)Akt及p-Akt的表達(dá)，并進(jìn)一步影響CDK4、cyclin D1、vimentin以及E-cadherin的表達(dá)，從而抑制BxPC-3和SW1990細(xì)胞的生長和遷移能力，同時(shí)影響其EMT 的進(jìn)程。但其確切機(jī)制還有待深入研究，接下來還需在胰腺癌異種移植瘤模型上進(jìn)一步驗(yàn)證CPT對胰腺癌的抑制作用，并且該藥對臨床患者的安全性及療效還有待評估。本研究為進(jìn)一步將CPT作為治療胰腺癌的潛在藥物提供了重要的理論依據(jù)。