胚胎形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)與胚胎整倍性的關(guān)系

鄒曜宇，徐彥，谷瑞環(huán)，李志超，伏靜，孫貽娟

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院上海集愛遺傳與不育診療中心，上海 200011)

胚胎染色體異常是導(dǎo)致胚胎著床失敗和反復(fù)流產(chǎn)的主要因素，給人類輔助生殖技術(shù)(ART)帶來(lái)了嚴(yán)重障礙。近年來(lái)胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)技術(shù)的應(yīng)用有效避免了染色體異常導(dǎo)致的妊娠失敗或新生兒缺陷，顯著提高了移植成功率和活產(chǎn)率[1]。但是，PGT的操作存在一定局限性：(1)費(fèi)用不菲，等待時(shí)間長(zhǎng)，且必須先行胚胎冷凍；(2)操作復(fù)雜，操作的侵入性和復(fù)雜性可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果[2]；(3)為有創(chuàng)性檢測(cè)，目前缺乏對(duì)新生兒乃至子代健康狀況的長(zhǎng)期隨訪，故可能存在一定的安全隱患。因此，建立快速、無(wú)創(chuàng)、安全、可靠的方法預(yù)測(cè)胚胎整倍性，將對(duì)輔助生殖工作帶來(lái)巨大的幫助。

時(shí)差成像技術(shù)(Time-lapse)是近年來(lái)發(fā)展的一項(xiàng)無(wú)創(chuàng)胚胎培養(yǎng)技術(shù)，可獲取胚胎發(fā)育各階段的形態(tài)，記錄特定事件發(fā)生時(shí)間，被越來(lái)越多地應(yīng)用于研究胚胎發(fā)育潛能和整倍性預(yù)測(cè)。但是，利用該技術(shù)獲得的胚胎形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)是否與染色體整倍性之間存在聯(lián)系尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論，有效參數(shù)如何選擇也一直存在很大爭(zhēng)議[3-7]。為了解決這一問(wèn)題，本研究比較了形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)在整倍體和非整倍體胚胎之間的差異，旨在為更好地實(shí)施選擇性單胚胎移植奠定可靠的理論基礎(chǔ)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2016年6月至2019年12月間在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院上海集愛遺傳與不育診療中心接受第三代試管嬰兒治療的150例患者的臨床資料。女方年齡23～49歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者不孕年限≥1年；滿足PGT指征，包括夫妻雙方或一方為遺傳病患者或攜帶者/反復(fù)種植失敗/不明原因反復(fù)流產(chǎn)/高齡(年齡≥38歲)。

納入患者共獲得561枚評(píng)分在4BC/4CB及以上的可用囊胚。由于無(wú)法對(duì)逆分裂胚胎進(jìn)行形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)標(biāo)記，故去除了逆分裂胚胎共11枚，最終550枚胚胎納入統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)囊胚整倍性分為整倍體胚胎組(250枚)和非整倍體胚胎組(300枚)，并對(duì)兩組胚胎進(jìn)行比較。

二、方法

1.控制性促排卵：采用常規(guī)拮抗劑或短期GnRH激動(dòng)劑促排方案，當(dāng)B超監(jiān)測(cè)下至少有1個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡平均直徑達(dá)18 mm以上時(shí)，于當(dāng)晚注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠)，36 h后在超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道行卵泡穿刺，獲得卵母細(xì)胞復(fù)合物。

2.胚胎體外培養(yǎng)：卵母細(xì)胞采集后剝除顆粒細(xì)胞，選出MⅡ卵，2～4 h后行ICSI注射。胚胎立刻放置于Time-lapse培養(yǎng)箱EmbryoScope(Vitrolife，瑞典)的培養(yǎng)皿Embryoslide(Vitrolife，瑞典)中，培養(yǎng)環(huán)境6%CO2、5%O2、37℃，在G-1培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)至受精后66～68 h(D3)，短暫取出換成G-2培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)并透明帶激光打孔，繼續(xù)培養(yǎng)至授精后113～139 h(D5～D6)。Time-lapse機(jī)器拍攝間隔頻率為15 min，有效監(jiān)測(cè)胚胎發(fā)育全過(guò)程。選擇D5或D6發(fā)育至囊胚、Gardner評(píng)分[8]在5BC/5CB及以上的可用囊胚且未發(fā)生逆分裂的胚胎共550枚納入分析。

3.單核苷酸多態(tài)性(SNP)芯片檢測(cè)：在D5或D6選擇5BC/5CB及以上的可用囊胚進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢，將活檢胚胎置于顯微操作皿中，用顯微固定針固定胚胎，活檢針輕輕吸取孵出的滋養(yǎng)層細(xì)胞，利用激光破膜儀(Hamilton Thorne，美國(guó))切割4～5個(gè)細(xì)胞。通過(guò)REPLI-g Single Cell Kit 試劑盒(Qiagen，德國(guó))對(duì)獲取的胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用Human Cyto-12 microarray芯片(Illumina，美國(guó))進(jìn)行第二輪擴(kuò)增、DNA片段化、沉淀、重懸、芯片雜交、洗滌、SNP單堿基延伸、著色等。芯片結(jié)果通過(guò)iScan reader儀(Illumina，美國(guó))掃描，并利用Bluefuse-Multi軟件(Illumina，美國(guó))進(jìn)行胚胎染色體拷貝數(shù)變異分析。

4.胚胎評(píng)估：利用EmbryoViewer軟件(UnisenseFertilitech，丹麥)記錄胚胎發(fā)育過(guò)程中的時(shí)間參數(shù)。14個(gè)胚胎早期形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)：以授精時(shí)間為起點(diǎn)，第二極體排出時(shí)間標(biāo)記為tPB2，原核出現(xiàn)和消失時(shí)間分別為tPNa和tPNf，發(fā)育至2細(xì)胞至8細(xì)胞的時(shí)間分別為t2、t3、t4、t5、t6、t7、t8，第二、三個(gè)細(xì)胞周期間隔時(shí)間為cc2(t3-t2)和cc3(t5-t3)，標(biāo)志第二、三次細(xì)胞分裂同步性指標(biāo)分別為s2(t4-t3)和s3(t8-t5)；5個(gè)晚期形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)：開始致密化的時(shí)間為tC，形成桑椹胚時(shí)間為tM，形成囊胚時(shí)間為tSB，囊胚孵出時(shí)間為tHB。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般情況及胚胎一般資料

納入患者的平均年齡為(32.20±4.61)歲，平均體重指數(shù)(BMI)為(21.73±2.92) kg/m2。PGT指征中，94例(62.67%)為遺傳病患者或攜帶者，11例(7.33%)為反復(fù)種植失敗患者，42例(28.00%)為反復(fù)流產(chǎn)患者，3例(2.00%)為高齡患者。68例患者(45.33%)采用短方案促排卵，82例患者(54.67%)采用拮抗劑方案促排卵?；颊叩幕A(chǔ)FSH、E2、LH、P、抗苗勒管激素(AMH)水平分別為(7.40±1.78)U/L、(169.31±71.30)pmol/L、(5.49±4.36)U/L、(2.12±3.04)nmol/L和(5.00±3.29)ng/ml。平均獲卵數(shù)、D3有效胚胎數(shù)和可用囊胚數(shù)分別為(14.24±6.04)枚、(8.85±4.18)枚和(3.53±2.25)枚。

二、早期形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

對(duì)授精至卵裂前的形態(tài)動(dòng)力學(xué)指標(biāo)進(jìn)行比較，整倍體胚胎和非整倍體胚胎的tPB2、tPNa與tPNf比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。對(duì)卵裂期的形態(tài)動(dòng)力學(xué)指標(biāo)進(jìn)行比較，整倍體胚胎的t4和s2均顯著小于非整倍體胚胎(P<0.05)，t2、t3、t5、t6、t7、t8、cc2、cc3和s3兩組間比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 整倍體和非整倍體胚胎的早期形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較[h，M(P25，P75)]

三、晚期形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

對(duì)胚胎致密化后的晚期形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較，整倍體胚胎的tHB顯著小于非整倍體胚胎(P<0.05)，tC、tM、tSB、以及囊胚孵出與囊胚形成的間隔時(shí)間(tHB-tSB)的兩組間比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 整倍體和非整倍體胚胎致密化后形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較[h，M(P25，P75)，(-±s)]

討 論

選擇最具發(fā)育潛力的胚胎，獲得單胎、足月的健康子代是輔助生殖工作的宗旨。然而年輕女性體外授精后D3胚胎的非整倍體概率約為65%，D5囊胚的非整倍體概率約為45%，且這一比例在35歲以上女性中更高[9]，即使在自然人群中染色體異常概率也有約0.5%[10]。因此，如何在大量胚胎中剔除非整倍體胚胎、挑選出最具發(fā)育潛能的胚胎和整倍體胚胎，以得到良好的臨床結(jié)局是生殖技術(shù)的目標(biāo)[11]。目前已有一些研究希望借助無(wú)創(chuàng)的囊胚液或培養(yǎng)液中胚外DNA檢測(cè)對(duì)胚胎整倍性進(jìn)行預(yù)測(cè)[12]，但這些方法經(jīng)濟(jì)成本較高，耗時(shí)長(zhǎng)，且準(zhǔn)確性有待提高。

近年來(lái)Time-lapse技術(shù)在輔助生殖領(lǐng)域大量應(yīng)用，研究者發(fā)現(xiàn)胚胎的形態(tài)動(dòng)力學(xué)蘊(yùn)含了大量關(guān)于胚胎發(fā)育潛能的信息[13-14]，借助Time-lapse系統(tǒng)進(jìn)行整倍性預(yù)測(cè)，不僅具有無(wú)創(chuàng)、快速、安全性高的特點(diǎn)，而且成本低，具有較為突出的優(yōu)點(diǎn)。然而關(guān)于各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)的有效性仍未達(dá)成共識(shí)，已有多篇文章認(rèn)為卵裂期和(或)囊胚期的形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以預(yù)測(cè)胚胎整倍性，但是有效指標(biāo)不盡相同，預(yù)測(cè)方法也不一樣[3，6，15-16]；也有學(xué)者認(rèn)為Time-lapse并不能幫助預(yù)測(cè)胚胎整倍性[5，7，17-18]。這些差異可能是由不孕原因、促排方案、染色體異常情況、胚胎培養(yǎng)液和培養(yǎng)氣體環(huán)境等因素不同導(dǎo)致[19]，也可能與研究方法不同有關(guān)，例如有些研究對(duì)年齡等混雜因素進(jìn)行了校正[4，7，20]，而有些則沒有校正[16-17]。

在本研究中，由于逆分裂胚胎無(wú)法標(biāo)記其細(xì)胞分裂時(shí)間點(diǎn)，且多項(xiàng)研究表明逆分裂胚胎的移植成功率為0%[21-22]，因此本研究均以未發(fā)生逆分裂的胚胎作為研究對(duì)象。本研究結(jié)果顯示整倍體和非整倍體胚胎的t4和s2存在顯著性差異，表明非整倍體胚胎發(fā)育至四細(xì)胞的時(shí)間延長(zhǎng)、第二次細(xì)胞周期同步性較差。我們發(fā)現(xiàn)s2在整倍體和非整倍體胚胎間的中位數(shù)相差很小(0.01 h)，但第三分位數(shù)相差較大(0.25 h)，提示非整倍體胚胎的s2分布向后偏移，即有較多非整倍體胚胎的三、四細(xì)胞發(fā)育間隔較長(zhǎng)。胚胎發(fā)育是一個(gè)有序且復(fù)雜的過(guò)程，多個(gè)階段都可能發(fā)生染色體異常，包括受精前的卵源性染色體非整倍性及染色體變異拷貝數(shù)異常，體外授精過(guò)程中因環(huán)境變化和體外操作導(dǎo)致的染色體重組、排列和分離異常，以及后續(xù)每一次細(xì)胞分裂都可能存在的染色體復(fù)制和分離異常。染色體狀態(tài)是胚胎的內(nèi)在因素，合適的細(xì)胞分裂時(shí)間與染色體狀態(tài)保持著一定聯(lián)系，例如，一旦姐妹染色單體錯(cuò)誤附著在紡錘體微管上，M期細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)將被激活，繼而啟動(dòng)修復(fù)過(guò)程，但這一過(guò)程延長(zhǎng)了細(xì)胞周期，使得細(xì)胞分裂變慢，因此分裂過(guò)慢可能提示發(fā)生了DNA損傷或染色體畸變[23]。如果細(xì)胞周期檢查點(diǎn)也發(fā)生了錯(cuò)誤，將導(dǎo)致非整倍體的出現(xiàn)。這可能可以解釋非整倍體胚胎的t4、s2比整倍體胚胎延長(zhǎng)的原因。在臨床工作中，優(yōu)先選擇t4數(shù)值小的胚胎、同時(shí)降低s2較大胚胎的移植順序，可能會(huì)提高整倍體胚胎的選擇概率，提高胚胎種植率、降低流產(chǎn)率，后續(xù)工作中需要對(duì)此進(jìn)行深入研究。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，致密化后兩組胚胎間tC和tM比較沒有顯著性差異，非整倍體胚胎的tSB具有增大的趨勢(shì)，但尚無(wú)顯著性差異(P=0.095)，直至tHB兩組間出現(xiàn)了顯著性差異，提示非整倍體胚胎在致密化后逐漸發(fā)育減慢。囊胚的孵出時(shí)間直接影響與移植窗口期的對(duì)接，因此具有重要的臨床意義。由于我們?cè)谂咛グl(fā)育D3進(jìn)行了人工輔助孵化，因此該數(shù)據(jù)并不能完全反映自然情況下的囊胚孵出時(shí)間。但是，tHB更短的胚胎可能具有更強(qiáng)的活力，優(yōu)先選擇tHB短的胚胎進(jìn)行移植可能會(huì)提高整倍體胚胎的選擇概率，提高胚胎種植率。

Minasi等[4]通過(guò)對(duì)928枚囊胚進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢，比較基因組雜交芯片染色體檢測(cè)和胚胎形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)整倍體胚胎的t4、 s2和tHB顯著短于非整倍體。我們的研究結(jié)果與之相似。但由于不同中心得出的有效指標(biāo)不盡相同，多中心大樣本研究可能具有更加廣泛的意義。通過(guò)Time-lapse平臺(tái)獲取的胚胎形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)不僅在區(qū)分整倍體和非整倍體胚胎中具有一定作用，還可預(yù)測(cè)D3胚胎發(fā)育成囊胚的潛能[13-14]、預(yù)測(cè)移植胚胎的臨床結(jié)局[24]，并且與傳統(tǒng)胚胎選擇方法相比，利用 Time-lapse技術(shù)選擇早期胚胎，可以在顯著減少移植胚胎數(shù)的基礎(chǔ)上，維持穩(wěn)定的臨床妊娠結(jié)局[25]，因此Time-lapse具有巨大的臨床應(yīng)用前景。這些研究均發(fā)現(xiàn)第2次細(xì)胞周期分裂同步性較好的胚胎即s2短的胚胎具有更強(qiáng)的發(fā)育潛能，提示形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)s2是胚胎選擇的重要參考指標(biāo)[13-14，24]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，采用常規(guī)促排方案、對(duì)滿足PGT指征患者的胚胎在EmbryoScope機(jī)器中行G1G2序貫培養(yǎng)，于D3行激光輔助孵化后，發(fā)育至有效囊胚的早期形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)t4、s2和晚期形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)tHB可能成為預(yù)測(cè)胚胎整倍性的有效指標(biāo)。由于在輔助生殖工作中難以對(duì)染色體狀態(tài)等影響胚胎發(fā)育潛能的關(guān)鍵因素進(jìn)行及時(shí)的判斷，利用Time-lapse技術(shù)進(jìn)行胚胎選擇可能具有重要的參考意義。