化瘀消癥軟膠囊對子宮肌瘤大鼠的干預(yù)作用及其機制

郝星，翁艷潔，任武，白劍

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430030)

子宮肌瘤又稱為纖維肌瘤、子宮纖維瘤，是女性生殖器官中最為常見的一種良性腫瘤，主要是子宮平滑肌增生引起的[1-2]。目前，子宮肌瘤確切病因尚未明確，可能與正常肌層的體細胞突變、性激素及局部生長因子間的相互作用有關(guān)[3]。子宮肌瘤在祖國醫(yī)學(xué)理論中屬于“癥瘕”的范疇，病因以瘀血內(nèi)阻為主[4]。化瘀消癥軟膠囊主要成分為桂枝、芍藥、牡丹皮等，具有活血化瘀、消癥散結(jié)的作用。已有研究顯示，化瘀消癥軟膠囊對大鼠子宮肌瘤有一定的防治作用，可改善子宮病理狀況[5]，但并未闡明其具體作用機制。有研究報道顯示，作為化瘀消癥軟膠囊主要成分的桂枝和芍藥具有抗血管生成的作用[6-7]。然而，新血管形成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必備條件[8]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)均具有強烈的促血管生成作用，在腫瘤組織血管形成中扮演核心作用。而缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是腫瘤缺氧微環(huán)境的核心調(diào)控因子，可促進VEGF、bFGF等促血管因子的表達進而調(diào)控腫瘤血管形成[9]。化瘀消癥軟膠囊是否通過調(diào)控相關(guān)促血管生成因子表達抑制血管形成來改善子宮肌瘤進程，目前鮮有報道。因此，本研究將觀察化瘀消癥軟膠囊對子宮肌瘤的干預(yù)作用及對VEGF、bFGF、HIF-1α等促血管生成相關(guān)蛋白表達的影響，探索其干預(yù)機制，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、動物和材料

1.實驗動物：SD雌性大鼠，6～8周齡，SPF級，體重180～220 g(北京維通利華)，實驗動物許可證號SCXK(京)2019-0050。所有大鼠飼養(yǎng)于溫度為(22±2)℃，相對濕度為50%～70%，12 h/12 h明暗交替的環(huán)境中，且給予充足的水和食物。動物實驗獲得華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2.主要試劑：化瘀消癥軟膠囊由合肥天眾藥物研究所提供，主要成分為桂枝、芍藥、牡丹皮、烏賊骨、山碴、黃芩、白術(shù)等，每1 g顆粒相當(dāng)于6 g生藥材。米非司酮(國藥準(zhǔn)字：H20010633，10 mg/片)購自北京紫竹藥業(yè)有限公司；雌二醇(E2)、孕酮(P)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)等ELISA檢測試劑盒均購自上海鈺博生物科技有限公司；兔抗人bFGF多克隆抗體、兔抗人HIF-1α單克隆抗體、兔抗人VEGF多克隆抗體和兔抗人GAPDH單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

3.主要儀器：光學(xué)顯微鏡購自德國Bresser公司；酶標(biāo)儀購自上海美谷分子儀器公司；全自動凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

二、方法

1.動物的分組、建模與干預(yù)：適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將60只雌性SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為空白組、模型對照組、化瘀消癥軟膠囊低、中、高劑量組(簡稱低、中、高劑量組)和陽性對照米非司酮組(簡稱米非司酮組)，每組10只。采用雌激素負荷法構(gòu)建子宮肌瘤大鼠模型，除空白組外，其余各組大鼠均給予肌肉注射苯甲酸雌二醇(100 μg/只)，3次/周連續(xù)注射16周；從第13周時，每只大鼠增加注射黃體酮(0.9 mg/只)，3次/周，連續(xù)注射4周。造模期間，空白組給予注射相同體積生理鹽水。從建模第9周起，經(jīng)大鼠子宮病理學(xué)顯示腺體增生及肌纖維明顯增生提示造模成功，開始灌胃給藥。將化瘀消癥軟膠囊中的藥物顆粒按照不同組別中的劑量要求(低劑量組：1.0 g/kg；中劑量組：2.0 g/kg；高劑量組：4.0 g/kg)以大鼠體重所需的每日用量溶于3 ml蒸餾水中；米非司酮組所用劑量為1.25 mg/kg，制成混懸液3 ml；空白組和模型對照組均給予生理鹽水3 ml。1次/d，連續(xù)灌胃給藥8周。末次給藥24 h后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，用于后續(xù)實驗。

2.子宮的一般觀察：取出大鼠子宮，用電子游標(biāo)卡尺測量子宮兩側(cè)最粗處直徑，取其均值作為子宮腫脹度；稱量子宮重量，并計算子宮系數(shù)(子宮濕重/體重)。

3.HE染色：子宮浸于中性多聚甲醛溶液中固定過夜，石蠟包埋后制成組織切片，進行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察子宮組織形態(tài)學(xué)變化。

4.血清性激素含量的檢測：采集大鼠腹主動脈血，參照ELISA試劑盒說明書，檢測血清中E2、P、LH及FSH的含量。

5.Western Blot檢測：取適量大鼠子宮組織，采用BCA蛋白濃度檢測法(Thermo Scientific，美國)標(biāo)定組織中的蛋白質(zhì)濃度，對蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE凝膠電泳，待蛋白完全分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，美國)上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，將bFGF(1∶1 000稀釋)、HIF-1α(1∶500)、VEGF(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)等抗體分別與山羊抗兔HRP酶標(biāo)二抗(1∶10 000)進行蛋白免疫印跡雜交，超敏ECL發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影及拍照，利用Image J軟件(National Institutes of Health，美國)進行灰度分析，以GADPH為內(nèi)參，根據(jù)灰度數(shù)據(jù)分別計算bFGF、HIF-1α和VEGF蛋白的相對表達量。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組大鼠子宮腫脹度、子宮重量及子宮系數(shù)的比較

與空白組相比，所有其他組的大鼠子宮腫脹度、子宮重量及子宮系數(shù)均顯著增加(P<0.05)；與模型對照組比較，化瘀消癥軟膠囊高劑量組和米非司酮組的子宮腫脹度、子宮重量及子宮系數(shù)均顯著降低(P<0.05)，但化瘀消癥軟膠囊高劑量組和米非司酮組各項參數(shù)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠子宮腫脹度、子宮重量及子宮系數(shù)的比較(-±s)

二、各組大鼠子宮平滑肌組織形態(tài)學(xué)變化的比較

HE染色顯示，空白組大鼠子宮平滑肌細胞排列整齊，外縱行肌與內(nèi)縱行肌分界線清晰；模型對照組大鼠子宮平滑肌出現(xiàn)明顯增生，平滑肌細胞排列紊亂，肌層明顯增厚；化瘀消癥軟膠囊處理后明顯抑制了肌層的增厚，且化瘀消癥軟膠囊高劑量組和米非司酮組作用效果顯著(圖1)。

A：空白組；B：模型對照組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組；F：米非司酮組圖1 各組大鼠子宮平滑肌組織形態(tài)學(xué)變化的比較(HE染色 ×100)

三、各組大鼠血清性激素水平的比較

與空白組相比，其他各組大鼠血清中E2、P水平顯著上升，LH、FSH水平顯著下降(P<0.05)；與模型對照組相比，化瘀消癥軟膠囊中劑量組P水平顯著下降(P<0.05)，化瘀消癥軟膠囊高劑量組和米非司酮組E2、P水平顯著下降，而LH、FSH水平顯著上升(P<0.05)，(表2)。

四、各組大鼠子宮組織中bFGF、HIF-1α、VEGF蛋白表達的比較

如圖2所示，與空白組相比，其他組大鼠子宮組織中bFGF、HIF-1α和VEGF蛋白相對表達量顯著增加(P<0.05)；與模型對照組相比，化瘀消癥軟膠囊中劑量組大鼠子宮組織中HIF-1α和VEGF蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，化瘀消癥軟膠囊高劑量組和米非司酮組大鼠子宮組織中bFGF、HIF-1α和VEGF蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清性激素水平的比較(-±s)

A：空白組；B：模型對照組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組；F：米非司酮組； 與空白組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05圖2 各組大鼠子宮組織中bFGF、HIF-1α、VEGF蛋白表達

討 論

中醫(yī)認為子宮肌瘤是機體正氣不足，風(fēng)邪、情志內(nèi)傷、房室所傷、飲食不節(jié)等引起臟腑紊亂，氣機阻滯、停聚下腹胞宮而成，其主要病因病機是瘀血內(nèi)阻[10]，因此，子宮肌瘤的中醫(yī)療法以活血化瘀為主?；鱿Y軟膠囊由多種藥物成分組成，桂枝、芍藥、牡丹皮等藥物有增強機體免疫力作用[11]，烏賊骨和山碴有抗凝血功能，全方多種中藥如黃茂、白術(shù)有抗腫瘤、抗炎性反應(yīng)等作用?；鱿Y軟膠囊具有活血祛瘀、溫通經(jīng)脈之效，可針對子宮肌瘤病機治療。

子宮肌瘤是性激素依賴性腫瘤，大量研究顯示，采用雌孕激素協(xié)同法誘導(dǎo)SD大鼠，成瘤率高、穩(wěn)定且與人類子宮肌瘤的大體形態(tài)、病理組織學(xué)特點相似，更易于觀察相關(guān)藥物的防治作用[12]。本研究采用雌二醇和黃體酮協(xié)同誘導(dǎo)雌性SD大鼠，其子宮腫脹度、子宮重量及子宮系數(shù)明顯大于正常大鼠，HE染色顯示子宮平滑肌細胞排列紊亂，平滑肌增生明顯，肌層增厚顯著，病理改變與人子宮肌瘤相似，與文獻報道相符[13]，提示成功建立子宮肌瘤動物模型。

在成功制備大鼠實驗性子宮肌瘤模型的基礎(chǔ)上，我們觀察化瘀消癥軟膠囊對病變大鼠各項子宮大體指標(biāo)影響。結(jié)果顯示，化瘀消癥軟膠囊可顯著降低大鼠子宮腫脹度、子宮重量及子宮系數(shù)，改善大鼠子宮病理現(xiàn)象，提示化瘀消癥軟膠囊可能抑制子宮平滑肌增厚，從而起到治療子宮肌瘤的作用。

子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體性激素分泌異常密切相關(guān)。過量的E2可刺激子宮平滑肌細胞生長，發(fā)展為子宮肌瘤[14]。P的高表達可促進和維持子宮肌瘤細胞上的雌激素受體含量，加快肌瘤病灶增大[15-16]。LH水平的上升能夠刺激卵泡的生長發(fā)育，進而促進子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。FSH與E2具有協(xié)同作用，可促進成熟的卵泡分泌雌激素，還能促使子宮肌瘤持續(xù)生長[18]。本研究顯示，其他所有組血清E2、P水平顯著高于空白組，說明子宮肌瘤具有明顯的雌 、孕激素依賴性；與模型對照組比較，化瘀消癥軟膠囊高劑量組E2、P水平顯著下降，而LH、FSH水平顯著上升，說明化瘀消癥軟膠囊的治療作用與改善機體內(nèi)分泌環(huán)境有關(guān)，可拮抗大鼠體內(nèi)性激素紊亂，從而改善子宮肌瘤。

實體腫瘤微環(huán)境中最基本的特征是缺氧，缺氧狀態(tài)下，組織會誘導(dǎo)血管生成，進行缺氧代謝，幫助細胞在缺氧環(huán)境中保持增殖力，HIF-1α在上述過程中有重要的調(diào)控作用[19]。bFGF和VEGF是腫瘤血管生成的重要因子，bFGF是促進子宮肌瘤生長的重要因子，廣泛分布于血管平滑肌、血管內(nèi)皮等高度血管化的組織，可以促進子宮平滑肌細胞的增生和新血管的合成[20-21]。VEGF是血管新生主要的調(diào)節(jié)因子，缺氧狀態(tài)下，HIF-1α?xí)せ頥EGF的表達，從而開啟血管新生，導(dǎo)致腫瘤組織中生成大量的新生血管，促進腫瘤的生長[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，化瘀消癥軟膠囊可下調(diào)bFGF、HIF-1α、VEGF的表達，抑制血管的生成，可能這便是化瘀消癥軟膠囊縮瘤的作用機制之一。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，化瘀消癥軟膠囊干預(yù)后僅高劑量組有顯著改善效果，低、中劑量與模型對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，提示化瘀消癥軟膠囊治療子宮肌瘤可能存在一個有效劑量，后續(xù)研究將深入探討。

綜上所述，化瘀消癥軟膠囊對子宮肌瘤有明顯的抑制作用，可能通過恢復(fù)大鼠性激素水平、抑制血管生成，從而改善子宮病理變化。抑制血管生成信號通路的傳導(dǎo)可能是化瘀消癥軟膠囊抗肌瘤機理之一，但子宮肌瘤的發(fā)生過程十分復(fù)雜，故化瘀消癥軟膠囊對抗子宮肌瘤的作用機制還有待進一步探究。