攜帶AFP的rAAV感染樹突狀細胞對肝癌細胞殺傷作用的實驗研究

王 斌，付 堯 ，齊 紅 ，于 鴻 ，魏天雪，劉玉俠*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所)

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高，病死率高的特點。我國發(fā)病率約約占惡性腫瘤的第5位，死亡率居第3位[1]。肝癌的治療首選手術(shù),但由于臨床所見肝癌多已進入中晚期，而且肝癌病人約80%伴有肝硬化，能夠?qū)嵤└涡郧谐g(shù)的肝癌只是少數(shù)[2]。近年來，隨著分子生物學和免疫學技術(shù)的不斷發(fā)展進步以及對腫瘤發(fā)病機制的不斷認識，利用免疫及基因工程手段對腫瘤進行治療已在肝癌的治療中取得一定效果[3]。本實驗選用重組人相關(guān)病毒-rAAV作為載體，將肝癌相關(guān)抗原AFP轉(zhuǎn)染其中，并用其感染樹突狀細胞(DC),探討攜帶AFP的rAAV對DC抗肝癌作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器PCR儀：ABI VeritiTM；離心機：Eppendorf 5424R;恒溫振蕩器：上海知楚；低溫高速離心機：SORVALL公司；超速離心機：Beckman 公司;HERA CEEL 240iCO2培養(yǎng)箱:Thermo Scientific公司；全自動酶標儀:芬蘭雷勃公司；流式細胞儀:BD公司;熒光顯微鏡：Olympus。

1.2 試劑DNA 引物primer：武漢金開瑞公司合成；Restriction enzyme:NEB;Universal DNA purification Kit:北京天能生物;DMEM:Hyclone 公司；胎牛血清，IMDM培養(yǎng)基：Gibco公司；淋巴細胞分離液：天津灝洋生物制品科技責任有限公司；GM-CSF，TNF-α，IL-4： Peprotech公司;IL-2：北京四環(huán)生物制藥有限公司；MTT：Sigma公司。

1.3 人肝癌細胞株SMMC-7721;293細胞吉林省腫瘤防治研究所保存。

1.4 方法

1.4.1合成AFP基因引物并擴增 根據(jù)NCBI找到AFP基本信息(ID 174)，合成NM-001354717.1CDS序列，并進行擴增。

1.4.2構(gòu)建AFP基因過表達AAV2載體 將合成的AFP基因和pAAV-IRES-hrGFP腺相關(guān)病毒載體進行酶切，獲取的目的基因與載體進行連接并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞進行擴增，對陽性質(zhì)粒測序驗證。

1.4.3包裝腺相關(guān)病毒 將質(zhì)粒 pAAV-IRES-hrGFP、pAAV-RC2和Helper混勻，將脂質(zhì)體Lip2000和目的基因混合，之后將質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物添加到293細胞中，進行腺相關(guān)病毒的濃縮和純化。

1.4.4濃縮及純化腺相關(guān)病毒 通過反復(fù)凍融法提取rAAV,用氯仿等濃縮和純化rAAV溶液。并將純化的AAV病毒液分裝，儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5Q-PCR檢測病毒滴度 取病毒樣品經(jīng)核酸酶和蛋白酶K處理后，進行Q-PCR檢測：取7個pAAV-IRES-hrGFP載體標準品濃度梯度(10-1…10-7)，3個重復(fù)；3個病毒樣品濃度梯度(10-1,10-2, 10-3)，兩個重復(fù)；3個陰性對照。結(jié)果根據(jù)標準品質(zhì)粒濃度和分子量大小，計算標準品的Copies和病毒粒子拷貝數(shù)。

1.4.6制備樹突狀細胞并進行鑒定 見參考文獻[4]。

1.4.7轉(zhuǎn)染AFP的rAAV(rAAV-AFP)感染DC 向培養(yǎng)并鑒定的DC中加入轉(zhuǎn)染AFP的rAAV，培養(yǎng)1天后進行殺傷實驗。

1.4.8感染rAAV-AFP及未感染rAAV-AFP的DC對肝癌細胞SMMC-7721的殺傷實驗 培養(yǎng)肝癌細胞株SMMC-7721至對數(shù)生長期，計數(shù)為5×104個/ml,加入到96孔細胞培養(yǎng)板，100 μl/孔，待貼壁后，按以下設(shè)計分組進行體外殺傷實驗。效應(yīng)細胞(DC、DC+rAAV-AFP)與靶細胞(SMMC-7721)的比例為50:1，每組設(shè)6復(fù)孔。

第一組：DC；第二組：DC+SMMC-7721；第三組：DC+rAAV-AFP；第四組：DC+rAAV+SMMC-7721；第五組：SMMC-7721。

以上實驗在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入20 μl MTT(5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束，用酶標儀在492 nm測OD值。

1.4.9殺傷活性計算方法 殺傷活性=[(1- 實驗組OD值-效應(yīng)細胞OD值)/靶細胞OD值]×100%。

2 結(jié)果

2.1 AFP基因擴增結(jié)果根據(jù)NCBI找到的AFP基本信息(ID174),合成了NM-001354717.1CDS序列，成功擴增AFP基因(1 356 bp)。

2.2AFP轉(zhuǎn)染至AAV-IRES-hrGFP腺相關(guān)病毒，構(gòu)建AFP基因過表達AAV2載體。見圖1。

圖1 AFP轉(zhuǎn)染至pAAV-IRES-hrGFP腺相關(guān)病毒構(gòu)建的AAV2表達載體

2.3 Q-PCR測定病毒滴度及AFP表達水平結(jié)果

2.3.1病毒滴度測定結(jié)果 根據(jù)Q-PCR測定結(jié)果，繪制原始曲線、溶解曲線以及標準曲線，計算出AAV2對照病毒滴度為1.35E+10，AFP過表達病毒滴度為6.75E+10。

2.3.2Q-PCR測定AFP表達水平 見圖2。從定量PCR測定的結(jié)果表明，AFP的表達水平顯著上調(diào)。

圖2 Q-PCR測定AFP表達結(jié)果

2.4 DC以及rAAV-AFP感染的DC對肝癌細胞SMMC-7721殺傷活性實驗及分析見表1。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染AFP的rAAV可以提高DC對SMMC-7721的殺傷活性。

表1 DC、DC+rAAV-AFP對SMMC-7721的殺傷活性

3 討論

腺相關(guān)病毒(AAV)，屬于微小病毒科(parvovirus)，為無包膜的單鏈線狀DNA病毒，需要輔助病毒(通常為腺病毒)參與復(fù)制。重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主細胞范圍廣(分裂和非分裂細胞)、免疫源性低，在體內(nèi)表達外源基因時間長等特點[5,6]，被廣泛用于體內(nèi)實驗研究。腺相關(guān)病毒載體整合率遠低于慢病毒載體，但其可以以染色體外形式長期(數(shù)月至數(shù)年)存在于非分裂細胞中，從而實現(xiàn)外源基因長期表達。

常用腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)AAV Helper-Free System，能產(chǎn)生AAV2血清型病毒而無需輔助病毒。該系統(tǒng)包含3個質(zhì)粒：1個重組表達質(zhì)粒和2個輔助質(zhì)粒。它可以將目的基因克隆至重組pAAV載體上；將AAV感染必須的腺病毒基因(E2A、E4及VA等)構(gòu)建至輔助質(zhì)粒pHepler上，將AAV復(fù)制基因rep和capsid結(jié)構(gòu)基因cap構(gòu)建至質(zhì)粒pAAV-RC上。所以，本實驗選擇該病毒作為載體。

免疫療法在腫瘤治療中的作用近年來得到了廣泛認可。作為惡性腫瘤的輔助療法，為腫瘤治療提供了新模式[7]。樹突狀細胞是目前為止發(fā)現(xiàn)的功能最強的、也是唯一能激活初始型T細胞的專職抗原遞呈細胞(APC)，DC能攝取、加工和遞呈抗原。同其他的抗原遞呈細胞相比，樹突狀細胞最大的特點是能夠顯著刺激初始型T細胞增殖，促進細胞毒T細胞(CTL)和T輔助細胞(Th)的生成，啟動T細胞介導的免疫反應(yīng)。以DC為基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)導特異的腫瘤抗原基因制備DC疫苗，有可能成為一種高效、低毒的腫瘤治療方法[8]。

AFP是一種在胎兒時期高表達，在出生后表達降低或消失的基因[9,10]。在肝癌組織中及肝癌患者的外周血中，甲胎蛋白往往有異常的表達增高[11,12]，在急性期時AFP濃度甚至高達1 g/L[13]?？梢宰鳛楦伟┑脑\斷指標，近年來也作為肝癌的特異性抗原用于肝癌的免疫及基因治療研究。

本實驗選擇人外周血分離的單核細胞，通過用IL-4，GM-CSF，TNFα等細胞因子誘導DC的生成，通過合成了甲胎蛋白(AFP)引物并對其進行體外擴增，測序，然后將其轉(zhuǎn)染至腺相關(guān)病毒AAV2，用轉(zhuǎn)染AFP的rAAV感染DC并將被感染的DC在體外與表達AFP的肝癌細胞株SMMC-7721共同培養(yǎng)，同時用未感染rAAV-AFP的DC做對照，檢測其在體外SMMC-7721的殺傷作用，評價攜帶AFP的rAAV對DC體外抗腫瘤的效果。從實驗結(jié)果可以看出，攜帶AFP的rAAV對DC體外對人肝癌細胞SMMC-7721(CTL)的殺傷活性明顯高于未感染rAAV-AFP的DC(P<0.05)，證明轉(zhuǎn)染AFP的rAAV可以明顯增強DC的抗腫瘤功能，為以腺相關(guān)病毒為載體的肝癌免疫基因治療提供了實驗基礎(chǔ)。