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    miR-135a靶向調(diào)控STAT6對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

    2020-10-26 05:44:06趙宇明張立民
    關(guān)鍵詞:癌細(xì)胞前列腺癌陰性

    趙宇明,張 悅,代 亮,張立民

    (1.秦皇島市第一醫(yī)院 泌尿外科,河北 秦皇島066000;2.秦皇島市婦幼保健院 婦科,河北 秦皇島066000)

    前列腺癌屬于一種在臨床上較為常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,流行病學(xué)調(diào)查顯示,此病多發(fā)于中老年男性人群,目前隨著臨床上對(duì)前列腺癌的深入研究發(fā)現(xiàn),此病的發(fā)生與年齡、種族和地理位置、遺傳與家族史、雄激素、代謝綜合征、生活習(xí)慣、飲食、基因等多因素相關(guān)[1,2]。手術(shù)、放療、化療等手段為前列腺癌的主要治療方式,雖然在一定程度上改善患者癥狀,但部分患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高,其原因可能與癌細(xì)胞異常增殖、遷移、侵襲相關(guān)[3,4]。本文分析miR-135a靶向調(diào)控STAT6對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    DU145前列腺癌細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所提供。主要試劑:miR-135a NC、Hsa-miR-135a均由上海吉瑪公司提供;Lipofectamine 2000試劑由Invitrogen公司提供;Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由美國(guó)GeneCopoeia提供;MTT試劑盒由艾美捷科技有限公司提供;小鼠抗大鼠MMP-2抗體、兔抗大鼠MMP-9抗體均由武漢益普生物科技有限公司提供;小鼠抗大鼠TIMP-2抗體由艾美捷科技有限公司提供;兔抗人Bcl-2抗體由上海雅吉生物科技有限公司提供;兔抗大鼠Bax抗體由武漢益普生物科技有限公司提供。

    1.2 方法

    1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將DU145前列腺癌細(xì)胞株采用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基在溫度為37℃、5% CO2、95%飽和濕度條件的孵育箱中做培養(yǎng)處理,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況采用0.25%胰蛋白酶每周做傳代處理,處理2次,當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定進(jìn)入至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于后續(xù)試驗(yàn)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿底80%左右時(shí),加2.5 g/L胰蛋白酶給予消化,1∶3傳代,采集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第一代細(xì)胞,分為空白組、miR-135a陰性對(duì)照組、miR-135a轉(zhuǎn)染組3組。

    1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 三組細(xì)胞每孔設(shè)置為3個(gè)復(fù)孔,分別加入100 μl 1×105個(gè)/mL細(xì)胞濃度的細(xì)胞懸液,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,空白組加入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液、生理鹽水做空白處理,miR-135a陰性對(duì)照組加入miR-135a NC、Lipofectamine 2000試劑行無(wú)義序列轉(zhuǎn)染,miR-135a轉(zhuǎn)染組加Hsa-miR-135a、Lipofectamine 2000試劑行轉(zhuǎn)染。

    1.2.3細(xì)胞miR-135a、STAT6 mRNA表達(dá)量檢測(cè) 采用熒光定量RT-PCR技術(shù)鑒定miR-135a轉(zhuǎn)染效率,并檢測(cè)STAT6 mRNA表達(dá)量。取細(xì)胞,采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,檢測(cè)RNA純度、含量,使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA,采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列,采用2-△△Ct方法計(jì)算。反應(yīng)體系:0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYB Green,加蒸餾水至20 μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性1 min、94℃ 30 s、60℃ 30 s,72℃ 30 s,72℃ 5 min,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。miR-135a引物序列:上游:5’-CCGACGCGTTCTTTTCTGTTGCCCCATC-3’,下游:5’-CCCA-AGCTTGGACCGCAGCACCTATCT-3’;STAT6引物序列:上游:5’-AGGAGAGCAGGGGAAAGGAAG-3’,下游:5’-TGGCAGGTGGTGGAACTC-TT-3’。內(nèi)參基因U6引物序列:上游:5’-CTCGC-TTCGGCAGCACA-3’,下游:5’-AACGCTTCAC-GAATTTGCGT-3’。

    1.2.4細(xì)胞增殖檢測(cè) 使用MTT比色法檢測(cè)三組細(xì)胞增殖情況,在細(xì)胞培養(yǎng)后將細(xì)胞濃度調(diào)整至3×104個(gè)/ml,接種于96孔板中,將200 μl細(xì)胞懸液加入至每孔中,在37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,加入10 μl MTT試劑繼續(xù)孵育4 h,采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm的細(xì)胞組OD值,計(jì)算三組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(細(xì)胞組OD值/參照組OD值)×100%。

    1.2.5細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用DxFLEX流式細(xì)胞儀、Annexiv-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況,采用PBS重復(fù)洗滌細(xì)胞2次,取另一支試管,加入70%預(yù)冷的乙醇5 ml,用吸管吸取細(xì)胞懸液迅速吹入固定劑中(乙醇)振蕩混勻,4℃冰箱固定至少18 h。將離心固定后的細(xì)胞,用PBS洗2次,細(xì)胞濃度調(diào)整為為1×106個(gè)/ml,取1 ml,離心處理后將上清液棄除,加入1 ml PI染液,4℃冰箱避光染色30 min后上機(jī)檢測(cè),記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處熒光。

    1.2.6細(xì)胞遷移檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,實(shí)驗(yàn)步驟:將細(xì)胞接種至18孔板待其增長(zhǎng)到80%時(shí),使用100 μl的槍頭,垂直劃出3條直線,使用PBS緩沖液清洗2-3次,分別加入0.5 %的血清培養(yǎng)基,觀察24 h之后,使用倒置顯微鏡觀察三組細(xì)胞的遷移數(shù)量。

    1.2.7細(xì)胞侵襲檢測(cè) 采用Transwell小室檢測(cè)三組細(xì)胞侵襲能力,培養(yǎng)板中放置Transwell小室,細(xì)胞懸液接種于上室,100 ng/ml IL-8接種于下室,24 h后100 μg/ml TMP溶液入至下室,孵育24 h,將上室微孔中的細(xì)胞使用棉簽擦除,PBS反復(fù)洗滌3次(每次洗滌3 min)后,將其固定于4%多聚甲醛溶液中,固定處理15 min,使用蘇木精染色處理10 min,再次使用PBS洗滌,在倒置顯微鏡下觀察上室微孔下層的細(xì)胞數(shù),觀察三組細(xì)胞侵襲能力。

    1.2.8MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白檢測(cè) 采用Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量,將細(xì)胞行10000×g離心處理10 min,對(duì)上清液進(jìn)行提取后,BCA進(jìn)行蛋白定量檢測(cè),在2×SDS凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白,在100℃環(huán)境中加熱5 min。凝膠電泳完轉(zhuǎn)膜,取膜,4 ℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時(shí)間為1 h,一抗使用0.05%-0.1% TBST稀釋(MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax一抗為1∶1000),4℃孵育過(guò)夜保存,之后使用0.05%-0.1% TBST洗膜,3次,每次為5 min,二抗被0.05%-0.1% TBST稀釋(1∶10000),搖動(dòng)孵育時(shí)間為 1 h,再次采用TBST連續(xù)洗膜3次,處理時(shí)間為5 min,DAB顯色,定量分析蛋白表達(dá)情況,以GAPDH為內(nèi)參。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 轉(zhuǎn)染效率鑒定結(jié)果

    如表1所示,與空白組相比,miR-135a陰性對(duì)照組miR-135a表達(dá)量降低,miR-135a轉(zhuǎn)染組miR-135a表達(dá)量升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明miR-135a轉(zhuǎn)染成功。

    2.2 三組細(xì)胞STAT6 mRNA表達(dá)量對(duì)比

    如表2所示,空白組、miR-135a陰性對(duì)照組、miR-135a轉(zhuǎn)染組STAT6 mRNA表達(dá)量比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與miR-135a陰性對(duì)照組相比,miR-135a轉(zhuǎn)染組STAT6 mRNA表達(dá)量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    表1 轉(zhuǎn)染效率鑒定結(jié)果

    表2 三組細(xì)胞STAT6 mRNA表達(dá)量對(duì)比

    2.3 三組細(xì)胞增殖、凋亡情況比較

    如表3所示,空白組、miR-135a陰性對(duì)照組、miR-135a轉(zhuǎn)染組增殖、凋亡率比較,空白組、miR-135a轉(zhuǎn)染組均比miR-135a陰性對(duì)照組miR-135a轉(zhuǎn)染組增殖率降低,凋亡率升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    表3 三組細(xì)胞增殖、凋亡情況比較

    2.4 三組細(xì)胞侵襲、遷移情況比較

    如表4、圖1-2所示,空白組、miR-135a陰性對(duì)照組、miR-135a轉(zhuǎn)染組侵襲、遷移個(gè)數(shù)比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與miR-135a陰性對(duì)照組相比,miR-135a轉(zhuǎn)染組侵襲、遷移個(gè)數(shù)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    表4 三組細(xì)胞侵襲、遷移情況比較

    圖1 三組細(xì)胞侵襲能力比較

    圖2 三組細(xì)胞遷移能力比較

    2.5 三組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量比較

    如表5、圖3所示,空白組、miR-135a陰性對(duì)照組、miR-135a轉(zhuǎn)染組MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與miR-135a陰性對(duì)照組相比,miR-135a轉(zhuǎn)染組MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)量降低,TIMP-2、Bax蛋白表達(dá)量升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    表5 三組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

    3 討論

    微小RNA(miRNA)屬于一類較為重要的具有調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、應(yīng)激的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA分子,在轉(zhuǎn)錄水平上可調(diào)控多種基因的表達(dá),使其降解和抑制翻譯過(guò)程[5]。目前臨床上隨著對(duì)前列腺癌的不斷深入研究發(fā)現(xiàn),miRNA異常表達(dá)與此病的發(fā)生密切相關(guān),可經(jīng)調(diào)控基因表達(dá)發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤形成、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程。miR-135a為miR-135家族成員之一,其具有抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用,在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[6]。有研究發(fā)現(xiàn),miR-135a在喉癌[7]、膠質(zhì)瘤[8]、胃癌[9]、非小細(xì)胞肺癌[10]中異常表達(dá),其可經(jīng)一系列的作用途徑促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,抑制癌細(xì)胞凋亡。Xu B等[11]在其研究中發(fā)現(xiàn)激素依賴前列腺癌組織中miR-135a的表達(dá)均高于激素非依賴前列腺癌組織,推測(cè)miR-135a表達(dá)異常亦可能與前列腺癌進(jìn)展有關(guān)。本研究中構(gòu)建miR-135a慢病毒載體,轉(zhuǎn)染至前列腺癌細(xì)胞中,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-135a后的前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力均被顯著抑制,且凋亡率顯著升高,提示,miR-135a與前列腺癌進(jìn)展相關(guān),提高其表達(dá)抑制癌細(xì)胞增殖、遷移,阻止疾病惡化,提高患者生存周期。

    圖3 三組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量WB圖

    STATs屬于一類與細(xì)胞生長(zhǎng)分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞免疫反應(yīng)、惡性腫瘤發(fā)生的一種DNA結(jié)合蛋白,當(dāng)其與分布于細(xì)胞表面的細(xì)胞因子受體發(fā)生特異性結(jié)合后會(huì)出現(xiàn)酪氨酸殘基磷酸化,形成二聚體,使其被激活,從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中,對(duì)其相應(yīng)的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄過(guò)程產(chǎn)生誘導(dǎo)作用[12,13]。STAT6為STAT家族成員之一,其相對(duì)分子量大約為94×103,可經(jīng)作用于JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)多種細(xì)胞因子活化,參與機(jī)體多種生理病理變化過(guò)程,最終促進(jìn)疾病的發(fā)生[14,15]。研究發(fā)現(xiàn),miR-135a作用的靶基因?yàn)镾TAT6。本文研究結(jié)果顯示,經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-135a培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞STAT6表達(dá)量顯著降低,此結(jié)果提示miR-135a可能經(jīng)抑制STAT6表達(dá),發(fā)揮其抑制癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,促進(jìn)凋亡的作用。

    細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程與多基因相互作用相關(guān),Bcl-2家族與此密切相關(guān),Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax,兩者相互作用,促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,抑制癌細(xì)胞凋亡[16,17]。本文結(jié)果顯示,miR-135a轉(zhuǎn)染的前列腺癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)明顯改善,提示著miR-135a轉(zhuǎn)染抑制前列腺癌細(xì)胞遷移、侵襲增殖的機(jī)制可能與作用于STAT6,調(diào)控MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax表達(dá)相關(guān)。

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