前列腺癌中血管內(nèi)皮生長因子及其受體和RBM5表達(dá)的相關(guān)性及臨床意義

張秋爽,楊 瀟,李然偉,馮樹強(qiáng),田文杰,楊 賀,姜 爽

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 泌尿外科,吉林 長春130041)

血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)被認(rèn)為是迄今為止已知活性最強(qiáng)，特異性最高的血管生長誘導(dǎo)因子，它主要通過其含激酶插入?yún)^(qū)受體(Kinase insert domain containing receptor,KDR)發(fā)揮作用[1,2]，以旁分泌方式促進(jìn)細(xì)胞增殖進(jìn)而形成新生血管。但近期研究表明KDR在人體多種惡性實(shí)體腫瘤細(xì)胞過量表達(dá)，提示在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可能存在VEGF的自分泌途徑[3]。另有研究認(rèn)為，VEGF表達(dá)與P53和RBM5基因突變有關(guān)，當(dāng)微環(huán)境發(fā)生變化，組織細(xì)胞缺血缺氧時(shí)其抑癌作用的生物學(xué)效應(yīng)才會(huì)受到影響[4,5]。本研究除初步探索前列腺癌(PCa)患者組織細(xì)胞中是否存在VEGF自分泌現(xiàn)象，還檢測RBM5與VEGF及其受體KDR之間的相關(guān)性，以進(jìn)一步探尋雙位點(diǎn)，甚至多位點(diǎn)用藥治療腫瘤的有效途徑，同時(shí)也為預(yù)測和評估PCa術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)因子提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2012年1月至2017年12月在我院采用腔內(nèi)技術(shù)經(jīng)尿道手術(shù)的196例PCa患者的組織標(biāo)本。患者的中位年齡是73.6歲(58-91歲)。術(shù)前均經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)前列腺穿刺活檢診斷為PCa。術(shù)后病理Gleoson評分：2-4分組118例，5-7分組54例，8-10分組24例。病理分期：非胞膜浸潤(T2以內(nèi))114例，浸潤到包膜者(T3及T3以上)82例。其中腺癌191例，鱗癌5例。術(shù)后通過肛診、PSA、腔內(nèi)超聲和CT臨床隨訪3-60個(gè)月。

1.2 觀察方法及判定標(biāo)準(zhǔn)對選取的所有PCa組織標(biāo)本均采用SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，通過細(xì)胞著色狀況觀察腫瘤組織細(xì)胞中VEGF、KDR和RBM5的表達(dá)情況。微波法修復(fù)抗原后隨即與下列3種抗體[VEGF單抗(clone 14-124，ABCAM,5 μg/ml)，KDR單抗(clone89115，R & Dsystem,25 μg/ml)和RBM5單抗(DO-7，DAKO，1:5)]4℃孵育過夜，然后滴加生物素化二抗，于37℃作用20 min時(shí)，再滴加SABC試劑備檢，以DAB作底物觀察顯色。每次實(shí)驗(yàn)均用已知VEGF、KDR和RBM5表達(dá)陽性的PCa的細(xì)胞作陽性對照，非免疫血清代替一抗作陰性對照，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：VEGF和KDR胞漿或胞膜呈棕黃色顆粒，胞核無著色為陽性，RBM5胞核呈棕褐色，胞漿和胞膜不顯色為陽性，VEGF和RBM5與KDR和RBM5分別在胞漿和胞核中著色為共表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 PCa組織標(biāo)本中VEGF、KDR和RBM5表達(dá)與病理特征的關(guān)系在196例PCa標(biāo)本的組織細(xì)胞中VEGF、KDR和RBM5的陽性表達(dá)率分別為69.4%，56.1%和48.0%。胞膜浸潤性PCa中VEGF、KDR和RBM5陽性表達(dá)率低于非胞膜浸潤者(P<0.05)，細(xì)胞中等分化和分化不良陽性表達(dá)率與細(xì)胞分化好的比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1)。

表1 Pca患者VEGF、KDR和RBM5表達(dá)與病理特征的關(guān)系(%)

2.2 PCa 組織標(biāo)本中VEGF和KDR表達(dá)情況除腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞外，腫瘤細(xì)胞中也存在VEGF和KDR陽性共表達(dá)。以VEGF表達(dá)與否將PCa患者分為兩組，觀察KDR表達(dá)情況，結(jié)果顯示在136例VEGF表達(dá)陽性和60例無表達(dá)的細(xì)胞中，其陽性表達(dá)率分別為66.2%和33.3%，兩者間的表達(dá)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。

表2 PCa組織標(biāo)本中VEGF和KDR表達(dá)間的關(guān)系(%)

2.3 PCa組織標(biāo)本中RBM5和VEGF與KDR表達(dá)的相關(guān)性根據(jù)VEGF表達(dá)與否將PCa患者的組織細(xì)胞標(biāo)本分為兩組，分別檢測RBM5表達(dá)狀況，結(jié)果提示在136例陽性表達(dá)和60例無表達(dá)的細(xì)胞中，RBM5的陽性表達(dá)率分別為55.9%和30%。這表明VEGF和RBM5間的表達(dá)聯(lián)系密切，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以同樣的方法同時(shí)檢測KDR和RBM5表達(dá)情況，結(jié)果表明在110例KDR表達(dá)陽性和86例無表達(dá)的患者中，RBM5陽性表達(dá)率分別為61.8%和30.2%，KDR陽性表達(dá)與RBM5水平的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表3)。

表3 PCa組織標(biāo)本中RBM5與VEGF和KDR表達(dá)的相關(guān)性

2.4 PCa組織標(biāo)本中VEGF、KDR和RBM5表達(dá)和臨床患者的關(guān)系本組隨訪統(tǒng)計(jì)資料結(jié)果顯示，與VEGF、KDR和RBM低水平表達(dá)者相比，高水平表達(dá)者具有明顯轉(zhuǎn)移傾向，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)極高(表1)。而RBM5和VEGF或KDR共表達(dá)者其預(yù)后更差。在本組所有196例術(shù)后PCa中，136例VEGF或110例KDR與RBM5共表達(dá)者的5年生存率分別為71.3%(97/136)和75.5%(83/110)，60例VEGF或86例KDR與RBM5未共同表達(dá)者的5年生存率則分別達(dá)到91.7%(55/60)和91.9%(79/86)，前后兩者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。影響5年生存率的關(guān)鍵是PCa患者術(shù)后的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。而復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者術(shù)后死亡的主要原因(見表4)。

表4 陽性表達(dá)者5年生存率比較

3 討論

PCa屬血管依賴型腫瘤，其生長轉(zhuǎn)移離不開血管形成，因此，近幾年來抗血管生成的靶向分子治療已成為研究的熱點(diǎn)之一[6]。隨著研究的深入，人們普遍認(rèn)為在腫瘤血管生成的過程中，VEGF及其受體KDR間相互傳導(dǎo)的信號(hào)作用極其重要。VEGF不單刺激新生血管生成，還能使其通透性增強(qiáng)，VEGF的這種生物學(xué)功能主要是通過KDR完成的。以往幾乎一直認(rèn)為KDR主要在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，VEGF與KDR結(jié)合后以旁分泌方式誘導(dǎo)并促進(jìn)血管形成，加速瘤細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移。然而Steiner等[7]在63例惡性膠質(zhì)瘤患者中發(fā)現(xiàn)有45例出現(xiàn)VEGF/KDR過表達(dá)，Weigand等[8]在乳腺癌組織細(xì)胞表面存在的KDR可被外源性VEGF激活的報(bào)道以后，研究人員才開始真正關(guān)注VEGF和KDR相互間的信號(hào)傳導(dǎo)作用，并試圖明確瘤細(xì)胞內(nèi)是否存在VEGF自分泌現(xiàn)象。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步提示，VEGF一方面與其血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體KDR結(jié)合，以旁分泌方式刺激新生血管形成，另一方面則與其腫瘤細(xì)胞表面受體KDR結(jié)合以自分泌方式誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，VEGF與KDR的陽性共表達(dá)率高達(dá)45.9%(90/196)，以往以VEGF為靶點(diǎn)的腫瘤抗血管治療之所以未達(dá)到預(yù)期效果，極有可能是因?yàn)闆]有考慮到VEGF的自分泌現(xiàn)象。不過也有報(bào)道認(rèn)為，對于極其復(fù)雜的腫瘤血管形成來說，也可能受到抑癌基因或原癌基因的影響[9,10]。由于RBM5基因是一個(gè)候選的腫瘤抑制基因，它編碼一個(gè)核RNA結(jié)合蛋白，它是剪接體a復(fù)合體的組成部分。編碼蛋白通過對包括抑癌蛋白p53在內(nèi)的多個(gè)靶基因進(jìn)行mRNA前剪接，在誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡中發(fā)揮作用。該基因位于腫瘤抑制區(qū)3p21.3內(nèi)，可能在抑制腫瘤轉(zhuǎn)化和肺癌等多種惡性腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮作用。VEGF可能參與腫瘤血管形成，VEGF與KDR結(jié)合后，可通過旁分泌作用影響腫瘤血管生成，還可能通過自分泌方式調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞本身的分化、增殖、遷移或凋亡等。因此，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測VEGF、KDR和RBM5在PCa中的表達(dá)狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三種基因之間存在不同程度的相關(guān)性，其相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(RBM5 vs VEGF，P<0.05；RBM5 vs KDR，P<0.01)。

上述3種標(biāo)志物在胞膜浸潤型和分化不良癌的陽性表達(dá)率與非胞膜浸潤型和分化良好癌的陽性表達(dá)率相比較中，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示同時(shí)檢測VEGF、KDR和RBM5三種基因?qū)α私獍≒Ca在內(nèi)的其他不同種類的惡性實(shí)體腫瘤的惡性度，預(yù)測預(yù)后和指導(dǎo)后續(xù)隨訪治療等方面具有積極意義。通過本研究可以推測，腫瘤抑制基因RBM5的表達(dá)水平越高，越能在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中起到負(fù)性調(diào)控作用，降低腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，提高患者生存率；相反，VEGF和KDR則起到正性調(diào)控作用，能增加腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，降低患者生存率。盡管到目前為止RBM5如同野生型P53一樣是否有突變傾向尚不清楚，但本研究顯示，VEGF和KDR在PCa中的陽性表達(dá)率和表達(dá)水平均高于RBM5，其數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，故在選擇分子靶向治療PCa時(shí)應(yīng)特別重視不同靶點(diǎn)的多靶位聯(lián)合治療，尤其是要在抑制癌基因表達(dá)的同時(shí)，上調(diào)抑癌基因表達(dá)水平[11,12]。