參桃軟肝方對肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞作用機(jī)制的研究

江海媚， 唐瑩， 張恩欣，， 黃海福， 周瑞生， 周岱翰

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)腫瘤研究所，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518034

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內(nèi)第六大常見癌癥，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。HCC因發(fā)病率高、惡性程度高、強(qiáng)侵襲與轉(zhuǎn)移、預(yù)后差而廣受關(guān)注[2]。HCC的發(fā)生與乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、酒精或進(jìn)食含黃曲霉素的食物等暴露接觸高度相關(guān)。另外，肥胖、糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病與非酒精性脂肪性肝病也被逐漸成為HCC的危險因素[3，4]。2018 年全球肝癌發(fā)病人數(shù)達(dá)到841 000 人，死亡人數(shù)高達(dá)781 000 人，其中HCC占原發(fā)性肝癌病例的75%～85%[5]。HCC 五年內(nèi)的復(fù)發(fā)率高達(dá)50 ～80%，而五年生存率低于5%[6，7]。HCC 的治療方法多樣，包括手術(shù)、放化療、介入治療、免疫及靶向藥物治療等。但由于HCC 早期發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者確診時已至晚期，治療方案有限，療效仍不如人意。為了緩解HCC 給患者家庭及社會帶來的巨大醫(yī)療負(fù)擔(dān)，尋找更有效迅捷的HCC治療方法迫在眉睫。

參桃軟肝方（STR）是國醫(yī)大師周岱翰教授用于治療肝癌的經(jīng)驗方，其主方由西洋參、當(dāng)歸、桃仁、仙鶴草、人工牛黃等藥物組成，藥物配伍在益氣養(yǎng)陰的同時兼顧活血消癥，具有健脾養(yǎng)肝，解毒祛瘀，軟堅消癥之功。既往研究證實，STR能改善肝癌患者karnofsky 評分，保護(hù)肝功能，抑制中晚期肝癌患者腫瘤進(jìn)展并提高患者生存質(zhì)量和延長生存時間[8，9]。參桃軟肝片、參桃軟肝丸、參桃軟肝膠囊等以STR 為基礎(chǔ)的口服制劑已經(jīng)開始運(yùn)用于臨床和相關(guān)研究。STR 在HCC 的治療中功效顯著，但是其明確的作用靶點(diǎn)和具體分子機(jī)制尚未闡明。

RNA 測序（RNA-Seq）是核糖核酸測序的簡稱，也被稱為全轉(zhuǎn)錄物組散彈槍法測序（Whole Transcriptome Shotgun Sequencing，WTSS）。RNASeq 是基于第二代測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法，是使用第二代測序的能力，在給定時刻從一個基因組中，揭示RNA的存在和數(shù)量的一個快照技術(shù)[10]。RNA-Seq 能夠識別用來診斷、治療和推斷預(yù)后的各種疾病的生物標(biāo)志物[11]。RNA-seq可以鑒定與藥物有關(guān)的差異基因（Differentially expressed gene，DEGs），在藥物治療效果分析方面具有明顯的優(yōu)勢。網(wǎng)絡(luò)和功能富集分析也能更好地揭示闡明藥物作用的分子機(jī)制。

本研究旨在通過生物信息學(xué)分析來揭示STR的作用靶點(diǎn)和抗癌分子機(jī)制，為臨床治療提供更進(jìn)一步的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 制備STR 凍干粉 所用中藥均購買于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。加入與藥物克數(shù)成一定比例的去離子水用煎藥機(jī)（沙益廣制藥有限公司）按規(guī)程操作煎煮，以液面沒過藥物1 cm 為宜。大火燒開后再以文火加熱30 min，倒出藥液，并重復(fù)兩次。將兩次的藥液用文火濃縮至300 ～500 ml，并分裝到50 ml離心管利用臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。將離心后的藥液上清吸取到培養(yǎng)皿中且在-80℃冰箱過夜，然后使用Christ凍干機(jī)Alpha 1-2 LD plus（北京博勵行儀器youxiangon公司）來凍干，最后取出凍干粉稱重。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝細(xì)胞癌HepG2 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫（http：//www.cellbank.org.cn/）。將細(xì)胞接種到含有10%胎牛血清（FBS，Gemini，美國），5% 100 U/ml 青霉素和100 mg/ml 鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基（GIBCO，美國紐約州格蘭德島）中，放入5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Science，美國馬薩諸塞州）培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖試驗 CCK8 試劑盒（Cell Counting Kit-8）用于測量細(xì)胞增殖。HepG2細(xì)胞以5×103細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中，并在37 ℃的完全培養(yǎng)基中孵育24 h，接著用濃度逐漸升高的STR凍干粉處理長達(dá)72 小時。然后將細(xì)胞與10 ul CCK8 在37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h。使用制造商推薦的酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光度。所有實驗一式三份進(jìn)行，并重復(fù)至少3 次，結(jié)果基本相似。抑制率計算如下：抑制率（%）= [平均OD 值（對照）-平均OD 值（藥物）]/平均OD值（對照）×100%。使用GraphPad Prism軟件通過非線性回歸擬合方法計算IC50值。

1.4 RNA 測序 本研究使用BGISEQ-500 平臺一共測了6個樣品，一共檢測到16 904個基因。實驗流程的關(guān)鍵是構(gòu)建mRNA 文庫：對total RNA 進(jìn)行處理得到純化的所需RNA 后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈DNA，對所得DNA 進(jìn)行拼接并通過特異的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物熱變性產(chǎn)生單鏈環(huán)狀DNA 文庫后上機(jī)測序。測序所得原始數(shù)據(jù)使用華大自主研發(fā)的過濾軟件SOAPnuke進(jìn)行統(tǒng)計，使用trimmomatic進(jìn)行過濾。

1.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和模塊分析 使用STRING 數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org）構(gòu)建靶蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)[12]。分析蛋白質(zhì)之間的功能相互作用可能會發(fā)現(xiàn)有關(guān)疾病產(chǎn)生或發(fā)展機(jī)制。在本研究中，DEG的PPI網(wǎng)絡(luò)是使用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的，并且綜合得分＞0.7的相互作用被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。Cytoscape是一個開放源代碼的生物信息學(xué)軟件平臺，用于可視化分子相互作用網(wǎng)絡(luò)[13]。 Cytoscape 的插件ClusterONE（1.0版）是一個將PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類的應(yīng)用程序[14]。使用Cluster ONE識別PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要模塊，從而確定了PPI 網(wǎng)絡(luò)中的重要模塊。隨后，使用DAVID對該模塊中的基因進(jìn)行KEGG和GO分析。

2 結(jié)果

2.1 STR 以時間和劑量依賴性抑制HepG2 細(xì)胞的生長 在用不同濃度的STR 處理HepG2 細(xì)胞24、48、72h 后，使用CCK8 試驗檢測細(xì)胞增殖情況。如圖1所示，STR以時間和劑量依賴性降低細(xì)胞活力，并且48 h的IC50約為1.5 mg/ml。

圖1 STR以時間和劑量依賴性方式抑制HepG2細(xì)胞的生長Figure 1 STR inhibits HepG2 cell growth in the time-and dose-dependent manner

2.2 RNA-Seq 結(jié)果 通過STR 劑量依賴試驗處理HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)STR 48 h的IC50值約為1.5 mg/ml。通過RNA 測序，以堿基對分辨率評估了未經(jīng)處理的HepG2 細(xì)胞和STR 處理過的HepG2 細(xì)胞的概況。除去低質(zhì)量的序列后，將每個樣品的原始讀數(shù)映射到參考基因組（表1）。

2.3 DEG 的識別 通過將STR 處理樣品和對照組樣品進(jìn)行比較來篩選和產(chǎn)生DEG。如柱狀圖（圖2-A）所示和聚類熱圖（圖2-B）所示，分析確定了2 428個DEG，其中包括下調(diào)基因1 235 個，上調(diào)基因1 193個，滿足條件log2（倍數(shù)變化）＞1，P值＜0.001。

表1 讀取比對過程的一般統(tǒng)計資料Table 1 General Statistics of Reads Alignment Process

圖2 DEGs的柱狀圖（A）和聚類熱圖（B）Figure 2 Column diagram and Clustering heat map of DEGs

2.4 KEGG和GO的DEG富集分析 為了確定DEG的生物學(xué)分類，使用DAVID 進(jìn)行了功能和途徑富集分析，上調(diào)和下調(diào)的基因的GO功能富集確定為P 值＜0.05。GO 分析結(jié)果表明，DEGs 的生物過程的改變在對有機(jī)物的反應(yīng)、膽固醇生物合成的過程、甾醇生物合成的過程、對非生物刺激的反應(yīng)、脂類生物合成過程顯示豐富。DEGs 的細(xì)胞成分變化主要集中細(xì)胞外區(qū)域部分、質(zhì)膜部分、不溶性組份、細(xì)胞組分、膜的組成組分。DEGs 分子功能改變主要富集在GTPase調(diào)節(jié)活性、核苷-三磷酸酶調(diào)節(jié)活性、金屬離子結(jié)合、陽離子結(jié)合、離子結(jié)合等途徑。KEGG 通路分析表明，DEGs 主要富集在萜類骨架生物合成、p53信號通路、類固醇生物合成、B細(xì)胞受體信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、MAPK信號通路，見表2。

表2 STR處理的HepG2細(xì)胞中DEGs的GO和KEGG途徑富集分析（Top5）Table 2 GO and KEGG pathway enrichment analysis of DEGs in HepG2 cells treated with STR

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)建設(shè)和模塊分析 為了分析DEG 的功能貢獻(xiàn)，使用Cytoscape 對PPI 網(wǎng)絡(luò)分析。計算每個P值的錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）。通常，F(xiàn)DR值＜0.01的術(shù)語被認(rèn)為是豐富的。確定了PPI網(wǎng)絡(luò)和DEG的最重要模塊（圖3-A和圖3-B）。使用DAVID 對模塊中涉及的基因進(jìn)行功能和途徑富集分析。結(jié)果顯示，最重要模塊中的基因主要富集在T細(xì)胞受體信號通路、MAPK信號通路、鈣信號通路、p53信號通路（表3）。

2.6 核心基因分析 總共有17個基因被鑒定為核心基因等級≥10 的核心基因。表現(xiàn)出顯著相互作用的17 個最重要的基因是GNRH1、PTAFR、GPR68、 PLCB1、 PTGER1、 BDKRB1、 GNB3、GNG3、LPAR5、BDKRB2、SAA1、RLN3、ADORA1、S1PR4、TAS2R5、NPB、GALR2。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)和DEGs的最重要模塊Figure 3 PPI network and the most significant module of DEGs

表3 模塊中GO和KEGG通路富集分析Table 3 GO and KEGG pathway enrichment analysis of DEGs in HepG2 cells treated with STR

3 討論

轉(zhuǎn)錄作為蛋白質(zhì)合成的第一步，在遺傳信息的傳遞過程中起著至關(guān)重要的決定性作用。在本研究中，通過RNA-Seq 確定了HepG2 細(xì)胞的RNA圖譜來探索STR 處理的HepG2 細(xì)胞的DEGs 功能。篩選出2 428個DEGs，包括下調(diào)基因1 235個，上調(diào)基因1 193 個，發(fā)現(xiàn)這些DEGs 與STR 介導(dǎo)的肝癌增殖抑制有關(guān)。使用DAVID 對2 428 個DEGs 進(jìn)行了功能和途徑富集分析。GO 分析結(jié)果顯示DEGs 主要富集在對有機(jī)物反應(yīng)的過程和細(xì)胞外區(qū)域的組織結(jié)構(gòu)部分。KEGG 通路分析表明，DEGs主要富集在腫瘤抑制因子p53信號通路。轉(zhuǎn)錄因子p53在細(xì)胞周期中起著核心作用，是最重要的腫瘤抑制因子。p53 能促進(jìn)細(xì)胞周期停滯，衰老和凋亡，其失活是每一個腫瘤失活的標(biāo)志[15-17]。本研究表明STR介導(dǎo)的HepG2細(xì)胞增殖抑制與p53信號通路有關(guān)，并用一套序列分析軟件包仔細(xì)鑒定STR處理誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞DEGs，共鑒定出17個核心基 因： GNRH1、 PTAFR、 GPR68、 PLCB1、PTGER1、 BDKRB1、 GNB3、 GNG3、 LPAR5、BDKRB2、 SAA1、 RLN3、 ADORA1、 S1PR4、TAS2R5、NPB、GALR2。使用DAVID 檢測了這些核心基因。GO分析結(jié)果表明，核心基因的生物過程的改變富集在G 蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號通路、細(xì)胞表面受體連接信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高、胞質(zhì)鈣離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)等過程。核心基因的細(xì)胞成分變化在質(zhì)膜部份顯示豐富。核心基因的分子功能的改變集中在G 蛋白偶聯(lián)、肽受體的活動、血管緊張素受體結(jié)合、1型血管緊張素受體結(jié)合等途徑。KEGG 通路分析表明，核心基因富集作用于神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、味覺傳導(dǎo)、趨化因子信號通路。GNRH是一種多肽荷爾蒙，能促使垂體釋放卵泡刺激素和黃體化激素。 GNRH1 通過與受體結(jié)合，抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。PTGER1 是前列腺素E2 的四個受體之一，可編碼前列腺素E 受體1。PTGER1 在醛固酮腺瘤中高表達(dá)，可誘導(dǎo)APA 產(chǎn)生過量醛固酮和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[19]。GPR68是質(zhì)子敏感的G蛋白偶聯(lián)受體，可能在腫瘤發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用。GPR68 可抑制人卵巢癌HEY 細(xì)胞的增殖和遷移[20]。PLCB1是G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)的PLC-β亞型的成員，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。PLCB1的表達(dá)升高可以促進(jìn)HCC 的發(fā)展[21]。LPAR5 是G蛋白偶聯(lián)的跨膜溶血磷脂酸受體之一，介導(dǎo)對溶血磷脂酸的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答，并具有參與細(xì)胞增殖、分化相關(guān)的多種生物學(xué)功能。LPAR5 可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞進(jìn)展[22]。SAA1 是淀粉樣蛋白A 的主要前體，在脂質(zhì)代謝中起著重要作用，并能調(diào)節(jié)炎癥和腫瘤的發(fā)病機(jī)制。SAA1 在子宮頸癌中高度表達(dá)[23]。RLN3是一種屬于胰島素-弛緩素超家族的神經(jīng)肽。RLN3在HCC中表達(dá)顯著增加，可能與肝癌的預(yù)后相關(guān)[24]。ADORA1是G蛋白偶聯(lián)受體超家族的一員，由抑制腺苷環(huán)化酶的G 蛋白介導(dǎo)其活性。腺苷可通過ADORA1 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制結(jié)腸癌生長[25]。GALR2是一種G蛋白偶聯(lián)受體，能激活Gq、Gi 和G12 這三個家族的G 蛋白。GALR2 介導(dǎo)SH-SY5Y 神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡[26]。甘丙肽通過GalR2抑制大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。GalR2 抑制p53 突變的頭頸部癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。血小板激活因子（platelet activating factor，PAF）及其受體PTAFR這一促炎受體配體對是腫瘤細(xì)胞粘附內(nèi)皮細(xì)胞、血管生成、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)因子。PTAFR 在卵巢癌細(xì)胞中過表達(dá)，PAF可通過PAF/PAFR介導(dǎo)的炎癥信號通路促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展[29]。BDKRB1 是一種G蛋白偶聯(lián)受體，它的激活可導(dǎo)致激活可導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移。BDKRB1 在前列腺癌和肺癌中過表達(dá)[30，31]。GNB3 基因在細(xì)胞生長和有絲分裂中起重要作用。GNB3基因第10外顯子在825位的常見多態(tài)性（C825T），可能會增加患癌癥的風(fēng)險[32]。BDKRB2是一種G蛋白偶聯(lián)受體，能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)并增加血管生成[33]。但是，現(xiàn)今還需要更多的研究來說明GNG3、RLN3、S1PR4、TAS2R5、NPB 這些基因與HCC 的關(guān)系。同時，本研究的對象為HepG2 細(xì)胞，還需要動物試驗加以輔助驗證。

4 結(jié)論

本研究試圖確定可能參與STR 治療HCC 分子機(jī)制的DEGs，總共確定了2 428個DEGs和17個核心基因，可以將其視為STR 治療HCC 的靶點(diǎn)。然而，這些基因在STR 治療肝癌的分子機(jī)制和生物學(xué)功能仍需要進(jìn)一步的研究來闡明。