小黃魚內(nèi)臟油的提取及其棕櫚酸甘油酯低溫結(jié)晶富集工藝的研究

許 韜,周曉紅,陳玉潔,劉同杰,易華西,李思銘,肖光輝,公丕民,張?zhí)m威,*,冷友斌,*

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266042;2.青島中心醫(yī)院,山東青島 266042;3.中國飛鶴有限公司,北京 100015)

人乳脂肪的甘油三酯的sn-2位上含有大量的棕櫚酸(簡稱sn-2棕櫚酸,>50%),這種特殊位置的棕櫚酸對(duì)嬰兒有著促進(jìn)脂質(zhì)吸收和避免Ca2+流失的功能[1]。盡管目前市售配方奶粉對(duì)此有所改善,但sn-2棕櫚酸的含量仍與人乳有很大差距[2],主要原因是沒有合適的富含sn-2棕櫚酸的可食用油脂配料。海魚魚油中棕櫚酸同樣大量分布在sn-2位[3],可以作為一種潛在新型富含sn-2棕櫚酸的油脂資源,改善目前配方奶粉的不足。

小黃魚(Larimichthyspolyactis)是我國沿海四大經(jīng)濟(jì)海產(chǎn)品之一,年產(chǎn)量高[4]。研究表明,海魚魚油含有大量多不飽和脂肪酸,具有豐富的營養(yǎng)和保健功能,對(duì)嬰幼兒的大腦、神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜的發(fā)育具有積極作用[5];對(duì)成年人有預(yù)防心血管疾病、降低血脂、減少動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生等作用[6]。而小黃魚內(nèi)臟等部位大部分作為飼料或被直接丟棄,造成了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)與環(huán)境污染[7]。從小黃魚的加工下腳料中提取魚油的文獻(xiàn)較少,僅見劉艷國等人對(duì)小黃魚內(nèi)臟油的酶法提取工藝進(jìn)行了研究[7]。魚油作為經(jīng)濟(jì)原料,傳統(tǒng)的提取方法有蒸煮法、超臨界流體萃取法、稀堿水解法、酶解法和微波輔助法等,不同的提取方法對(duì)內(nèi)臟油的提取效果和脂肪酸組成有影響[8-9]。在魚油加工方面,研究者更多地關(guān)注于魚油中DHA和EPA的富集,尚未見對(duì)棕櫚酸富集的報(bào)道,所以對(duì)魚油中棕櫚酸的富集進(jìn)行研究,有利于提高魚油的利用價(jià)值。

本文采取稀堿水解法、酶解法和微波輔助法提取小黃魚內(nèi)臟油,利用氣相色譜對(duì)內(nèi)臟油脂肪酸組成進(jìn)行檢測(cè)分析,比較不同方法的魚油提取率和分析棕櫚酸含量和分布的差異,并利用低溫結(jié)晶傳質(zhì)模型對(duì)棕櫚酸的富集工藝進(jìn)行研究,為小黃魚內(nèi)臟油的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小黃魚內(nèi)臟 購自青島市市南區(qū)團(tuán)島農(nóng)貿(mào)市場,剔除膽囊后洗凈攪碎,冷凍干燥后粉碎,于-80 ℃冰箱內(nèi)貯藏待用;37種脂肪酸甲酯混標(biāo)(色譜純)、胰脂肪酶(分析純) 上海Sigma公司;正己烷 色譜純,德國Meker公司;甲醇、冰醋酸、乙醚、三氯甲烷、石油醚、鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氯化鉀、氯化鈣、膽酸鈉 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;堿性蛋白酶(2×105U/mL) 諾維信生物技術(shù)有限公司。

FA2204B電子精密天平 上海天美天平儀器有限公司;SHA-C水浴恒溫振蕩器 常州市中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;QPro-M微波發(fā)生器 加拿大Questron公司;EYEL4 N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、TG20KR-D離心機(jī) 東旺儀器有限公司;GC 6890氣相色譜儀 Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小黃魚內(nèi)臟含油量測(cè)定 準(zhǔn)確稱量小黃魚內(nèi)臟5 g,參照《GB 5009.6-2016》索氏提取法提取小黃魚內(nèi)臟油,稱重。

1.2.2 小黃魚內(nèi)臟油的提取方法

1.2.2.1 稀堿水解法 準(zhǔn)確稱量小黃魚內(nèi)臟5 g,加入去離子水25 mL,用20%的KOH溶液調(diào)節(jié)pH=7.5,在60 ℃下反應(yīng)40 min,隨后加入KCl鹽析15 min。趁熱離心(8000 r/min,10 min),分離上層油脂溶于石油醚中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至恒重,得到小黃魚粗魚油,稱重,計(jì)算小黃魚內(nèi)臟油的提取率[10]:

小黃魚內(nèi)臟油提取率(%)=堿法內(nèi)臟油質(zhì)量(g)×100/國標(biāo)法的提油量(g)

1.2.2.2 微波輔助法 準(zhǔn)確稱量小黃魚內(nèi)臟5 g,加入50 mL正己烷,在200 W的微波功率下萃取10 min。隨后蒸干溶劑,得到油脂,計(jì)算小黃魚內(nèi)臟油的提取率[11]。

1.2.2.3 酶解法 準(zhǔn)確稱量小黃魚內(nèi)臟5 g,加入去離子水25 mL,用20%的KOH溶液調(diào)節(jié)pH=8.0,再加入0.180 mL堿性蛋白酶,在50 ℃下酶解2.5 h后滅活,8000 r/min離心10 min,分離上層油脂溶于石油醚中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至恒重,得到小黃魚粗魚油,稱重,計(jì)算小黃魚內(nèi)臟油的提取率[12]。

1.2.3 魚油理化指標(biāo) 參照《GB 5009.239-2016》檢測(cè)魚油的酸價(jià)AV;參照《GB/T 5532-2008》檢測(cè)碘值IV;參照《GB 5009.227-2016》檢測(cè)過氧化值POV。

1.2.4 色譜分析 按照Chen等[13]方法制備sn-2位甘油酯并對(duì)油脂進(jìn)行甲酯化。

1.2.4.1 甲酯化 油脂樣品10 mg與0.6 mL的0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液在100 ℃下反應(yīng)5 min。然后加入14% BF3,在100 ℃下反應(yīng)30 min。用200 μL正己烷萃取出脂肪酸甲酯,保存在棕色色譜小瓶內(nèi),然后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4.2 sn-2位單甘酯的制備 將20 mg油脂樣品與0.6 mL 1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8)、0.06 mL CaCl2溶液(22%)和0.15 mL膽酸鈉(0.1%)混勻,然后加入6 mg胰脂肪酶,在45 ℃下反應(yīng)10 min。滅活后加入0.2 mL乙醚萃取sn-2甘一酯。收集乙醚,點(diǎn)在薄層層析板上,用正己烷/乙醚/乙酸(50∶50∶1,v/v/v)作為展開劑分離單甘酯。將sn-2單甘酯按照1.2.4.1步驟進(jìn)行甲酯化,待上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4.3 氣相色譜條件 色譜柱為安捷倫HP-5 INNOWAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm× 0.2 μm)。進(jìn)樣器溫度250 ℃,FID檢測(cè)器溫度250 ℃;載氣為氮?dú)?進(jìn)樣量為1 μL,不分流,恒定流速0.8 mL/min;初始溫度170 ℃,維持5 min,之后以1.5 ℃/min的速率升溫至220 ℃,保持10 min。通過標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間鑒定脂肪酸種類,脂肪酸的含量百分比(簡稱脂肪酸含量)釆用面積歸一化法確定。

1.2.5 低溫結(jié)晶

1.2.5.1 油液比確定 準(zhǔn)確稱量小黃魚內(nèi)臟油2 g,采用正己烷作為溶劑,在溫度-60 ℃、時(shí)間4 h下,按不同油液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)低溫處理,析出脂肪晶體(簡稱晶體),稱量晶體質(zhì)量[14],并檢測(cè)此時(shí)脂肪酸成分,分析棕櫚酸的含量。

1.2.5.2 低溫結(jié)晶傳質(zhì)模型 準(zhǔn)確稱量小黃魚內(nèi)臟油2 g,采用正己烷作為溶劑,在不同溫度下(-20、-40、-60、-80 ℃),低溫一定時(shí)間(1、2、3、4、24 h),稱量晶體質(zhì)量,并檢測(cè)此時(shí)的棕櫚酸含量。

按照Morales-Medina等人的研究,溶劑中油脂在低溫時(shí)結(jié)晶的傳質(zhì)模型是一個(gè)關(guān)于時(shí)間和溫度的函數(shù)[15],如公式(1):

式(1)

式中:m-晶體質(zhì)量(g);t-時(shí)間(h);T-溫度(K);meq-恒定溫度結(jié)晶平衡時(shí)晶體質(zhì)量(g);kG·A-模型傳質(zhì)系數(shù)(h-1),是一個(gè)只與溫度T相關(guān)的常數(shù)。

當(dāng)溫度T恒定時(shí),kG·A和meq均為常數(shù),該模型函數(shù)變成只與時(shí)間t相關(guān)。再通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得不同時(shí)間下的晶體質(zhì)量,就得到晶體質(zhì)量m對(duì)時(shí)間t方程m(t)。

棕櫚酸含量的模擬方程Wp(t)按公式(2)和(3)得到。公式(2)中棕櫚酸的預(yù)測(cè)質(zhì)量mp由晶體質(zhì)量m和棕櫚酸含量Wp的乘積得到[16],然后帶入公式(1)得到棕櫚酸質(zhì)量-時(shí)間模型方程mp(t)。公式(3)中棕櫚酸含量對(duì)時(shí)間的模擬方程Wp(t)為棕櫚酸質(zhì)量的模型方程mp(t)和晶體質(zhì)量模型方程m(t)之比。

式(2)

式(3)

最后通過MATLAB軟件繪制不同溫度下棕櫚酸含量對(duì)時(shí)間的方程Wp(t)的圖像,求解棕櫚酸含量的理論最大值,同時(shí)得到棕櫚酸富集的理論最佳結(jié)晶溫度和時(shí)間,最后通過平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證理論最佳溫度、時(shí)間條件的正確性。

1.2.5.3 得率計(jì)算公式 晶體得率(%)=晶體質(zhì)量×100/結(jié)晶前內(nèi)臟油質(zhì)量

棕櫚酸得率(%)=晶體棕櫚酸質(zhì)量×100/內(nèi)臟油棕櫚酸預(yù)測(cè)質(zhì)量

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)進(jìn)行3次平行試驗(yàn),應(yīng)用SPSS軟件分析顯著性差異;應(yīng)用graphpad prism 7.0軟件統(tǒng)計(jì)畫圖,應(yīng)用MATLAB R2018a軟件繪制模型的方程圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取小黃魚內(nèi)臟油的提取效果與品質(zhì)

索氏提取法提取小黃魚內(nèi)臟的含油量為0.2595±0.018 g/g內(nèi)臟粉。其他方法(堿法、酶法和微波法)提取小黃魚內(nèi)臟油的結(jié)果如表1所示,堿法魚油的提取率84.26%±5.15%要顯著高于酶法魚油和微波法魚油(P<0.05)。另外,三種方法得到的小黃魚內(nèi)臟油均符合SC/T 3502-2016粗魚油一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。堿法魚油的三種指標(biāo)AV(1.41±0.16)、IV(149.37±4.72)和POV(3.27±0.21)都低于酶法和微波法(P<0.05),并且氣味和顏色更淡,更容易被接受。

表1 三種方法提取的小黃魚內(nèi)臟油的提取率和理化指標(biāo)

2.2 不同提取方法的內(nèi)臟油脂肪酸組成分析比較

三種方法提取的小黃魚內(nèi)臟油脂肪酸組成如表2所示。對(duì)于檢出的30種脂肪酸的含量中,堿法魚油和酶法魚油有6種存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而兩者與微波魚油相比,超過20種脂肪酸含量存在顯著差異(P<0.05),表明提取方法對(duì)小黃魚內(nèi)臟油的脂肪酸組成有影響。

表2 小黃魚內(nèi)臟油的脂肪酸組成(%)

PUFA含量是衡量魚油價(jià)值的重要指標(biāo),對(duì)降脂抗炎、健智益腦、預(yù)防癌癥有積極作用[17-18]。堿法魚油中PUFA含量20.43%±0.55%、ARA含量1.16%±0.02%和DHA含量10.47%±0.28%,均要高于另外兩種方法。可能長時(shí)間加熱或者高能量的微波場,導(dǎo)致PUFA的損失[11]。另外,PUFA含量的ω-3/ω-6比值在推薦值0～15之間時(shí),越高對(duì)健康越有利[19],所以堿法魚油的此比值更合理。雖然堿法魚油中SFA含量37.70%±0.40%和棕櫚酸含量26.47%±0.25%為三者最低,但與另外兩種方法在含量上無顯著差異(P<0.05)。因此堿法魚油具有更佳的品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值。

2.3 sn-2位脂肪酸組成

脂肪酸的位置對(duì)其吸收有著重要影響。棕櫚硬脂經(jīng)常應(yīng)用到配方奶粉中,正是因?yàn)閟n-2位高含量的棕櫚酸[20]。三種方法提取的內(nèi)臟油sn-2位脂肪酸檢測(cè)結(jié)果見表3。

由表3可知,堿法魚油中棕櫚酸在sn-2位的含量占比最高,達(dá)到39.94%±1.11%,是一種sn-2棕櫚酸潛在資源;相對(duì)棕櫚酸含量50.55%±1.06%,顯著高于酶法和微波法(P<0.05)。相對(duì)棕櫚酸含量是表示相對(duì)所有棕櫚酸而言,分布在sn-2位的棕櫚酸含量。而分布在甘油三酯sn-1,3位的棕櫚酸消化時(shí)首先成為游離脂肪酸,在嬰兒的小腸內(nèi)易形成高熔點(diǎn)的鈣皂,影響Ca2+和脂肪酸的吸收[7]。所以相對(duì)棕櫚酸含量越高,功能性棕櫚酸越多,對(duì)嬰兒健康越有利。堿法魚油中相對(duì)棕櫚酸含量與人乳水平(>65%)最為接近,高于市售配方奶粉的20%～35%[21]。因此堿法魚油中高含量的sn-2棕櫚酸和相對(duì)棕櫚酸可以應(yīng)用到配方奶粉中,改善其不足問題。

表3 小黃魚內(nèi)臟油的sn-2脂肪酸組成(%)

因此,綜合提取效果、品質(zhì)、PUFA、sn-2棕櫚酸和相對(duì)棕櫚酸等因素,堿法魚油比酶法魚油和微波魚油具有更大的營養(yǎng)價(jià)值和開發(fā)利用潛力,將作為低溫結(jié)晶富集棕櫚酸所用的原料油脂。

2.4 低溫結(jié)晶富集棕櫚酸

小黃魚內(nèi)臟油中棕櫚酸的含量不到30%,為了提高其含量和利用價(jià)值,需對(duì)棕櫚酸進(jìn)行富集。低溫結(jié)晶法工藝簡單,可以最大程度地保留分離組分的結(jié)構(gòu)[22],即最大程度地保留sn-2棕櫚酸的結(jié)構(gòu)和功能性。因此采用低溫結(jié)晶法富集內(nèi)臟油中的棕櫚酸,對(duì)富集的最佳工藝條件進(jìn)行研究。

2.4.1 油液比對(duì)富集的影響 在結(jié)晶溫度為-60 ℃、時(shí)間4 h的條件下,研究油液比對(duì)晶體得率和棕櫚酸得率的影響,結(jié)果如圖1所示。晶體的形成與溶液的飽和度相關(guān)[23]。雖然1∶4時(shí)晶體得率最高,但棕櫚酸得率并不高,當(dāng)油液比為1∶6時(shí),棕櫚酸的得率最高,對(duì)棕櫚酸的富集效果最好。因此選擇1∶6為最適油液比。

圖1 油液比對(duì)晶體得率的影響(A)和對(duì)棕櫚酸得率的影響(B)

2.4.2 晶體的傳質(zhì)模型

2.4.2.1 不同溫度下的晶體質(zhì)量-時(shí)間曲線 在油液比1∶6,四種低溫下處理內(nèi)臟油,得到晶體質(zhì)量-時(shí)間曲線如圖2所示。圖2中,內(nèi)臟油在不同溫度下結(jié)晶4 h后的晶體質(zhì)量幾乎都達(dá)到平衡,平衡時(shí)晶體質(zhì)量隨著溫度降低而上升。四條曲線的決定系數(shù)均大于0.97,對(duì)于質(zhì)量-時(shí)間的關(guān)系擬合度非常高,可以準(zhǔn)確的反映同一溫度下結(jié)晶時(shí)間對(duì)晶體質(zhì)量變化的影響,預(yù)測(cè)晶體的質(zhì)量和得率。

圖2 不同溫度下晶體質(zhì)量-時(shí)間曲線

2.4.2.2 不同溫度下晶體中棕櫚酸含量 不同溫度下結(jié)晶1、2、3、4和24 h后晶體中棕櫚酸的檢測(cè)結(jié)果如表4。由表4看出,同一溫度下,隨著時(shí)間增加,棕櫚酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。結(jié)晶時(shí)間不足時(shí),SFA和不飽和脂肪酸分離不完全,這時(shí)晶體中棕櫚酸含量隨著時(shí)間增加而上升。當(dāng)棕櫚酸的析出達(dá)到平衡點(diǎn)時(shí),繼續(xù)結(jié)晶會(huì)使大量的不飽和脂肪酸析出,從而導(dǎo)致晶體中棕櫚酸含量發(fā)生下降[24]。

表4 不同溫度晶體中棕櫚酸含量(%)

同一時(shí)間內(nèi)(24 h除外)晶體中棕櫚酸含量隨著溫度的降低而下降,差異顯著(P<0.05)。可能是溫度過低時(shí),大量不飽和脂肪酸也更迅速地析出,導(dǎo)致了同一時(shí)間內(nèi)晶體中不飽和脂肪酸的含量更高,相應(yīng)的棕櫚酸含量更低[25]。

2.4.2.3 不同溫度下棕櫚酸質(zhì)量-時(shí)間模型方程 利用不同溫度下棕櫚酸含量和晶體質(zhì)量預(yù)測(cè)棕櫚酸的質(zhì)量,再擬合得到晶體中棕櫚酸質(zhì)量的傳質(zhì)模型方程,如表5所示。方程的決定系數(shù)R2>0.94,對(duì)棕櫚酸質(zhì)量-時(shí)間關(guān)系擬合度較好,可以較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)晶體中棕櫚酸的質(zhì)量和得率。再結(jié)合2.4.2.1晶體傳質(zhì)模型方程可以得到恒定溫度下棕櫚酸含量(m)-時(shí)間(t)模擬方程。

表5 不同溫度下棕櫚酸質(zhì)量-時(shí)間模型方程

由表4棕櫚酸含量變化趨勢(shì)看出,棕櫚酸含量的最大值通常在結(jié)晶1～4 h內(nèi)出現(xiàn),因此在1～4 h之間每隔0.1 h取點(diǎn),利用MATLAB工具,描繪表5中各方程的圖像,求解棕櫚酸含量模擬的最大峰值,也就得到棕櫚酸富集的最適溫度和時(shí)間,最后通過試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果如表6所示。

表6 棕櫚酸含量的模擬值和實(shí)際值(%)

-60和-80 ℃下棕櫚酸含量模擬值低于40%,均沒有達(dá)到富集目的。在表6中,-20 ℃時(shí)棕櫚酸含量的最大模擬值為47.47%,-40 ℃時(shí)最大值為44.28%。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,-20 ℃下結(jié)晶2.3 h時(shí)晶體中棕櫚酸含量達(dá)到47.25%±1.67%,-40 ℃下結(jié)晶2.6 h后棕櫚酸含量富集至42.62%±2.67%,兩者間無顯著性差異(P<0.05),并都與模擬值近似。

但-20 ℃時(shí)晶體中棕櫚酸得率僅53.27%±2.86%,相對(duì)棕櫚酸含量為47.72%±2.88%,比原料魚油低;而-40 ℃時(shí)棕櫚酸得率80.50%±4.39%,大部分棕櫚酸被富集。此時(shí)sn-2棕櫚酸含量68.19%±1.47%,顯著高于原料魚油和-20 ℃的晶體(P<0.05);相對(duì)棕櫚酸含量為53.02%±3.06%,也比原料魚油高,最接近人乳,適合作為配方奶粉中功能性棕櫚酸的油脂來源。

綜合考慮,小黃魚內(nèi)臟油中棕櫚酸富集的最佳工藝條件為:油液比1∶6、溫度-40 ℃、時(shí)間2.6 h,此時(shí)棕櫚酸得率80.50%±4.39%;棕櫚酸含量富集至42.62%±2.67%,比魚油原料提高了61.01%;sn-2棕櫚酸含量富集至68.19%±1.47%,比魚油原料提高了70.73%,棕櫚酸得到了很好的富集。

3 結(jié)論

不同提取方法對(duì)小黃魚內(nèi)臟油的理化性質(zhì)和脂肪酸組成、分布有著顯著影響。其中稀堿水解法的提取率最高,提取的內(nèi)臟油理化性質(zhì)最佳,而且PUFA、ARA、DHA含量和sn-2棕櫚酸、相對(duì)棕櫚酸含量均要高于酶解法和微波輔助法,更適合應(yīng)用于嬰幼兒配方乳粉市場。通過低溫結(jié)晶傳質(zhì)模型確定小黃魚內(nèi)臟油棕櫚酸富集的最佳工藝條件為:油液比1∶6、溫度-40 ℃、時(shí)間2.6 h,此時(shí)棕櫚酸得率80.50%±4.39%,油樣中棕櫚酸含量42.62%±2.67%,比魚油原料有了明顯的提高。模型對(duì)棕櫚酸富集工藝條件的模擬效果很好,可以應(yīng)用到其他脂肪酸的富集工藝中。雖然小黃魚內(nèi)臟油是改善嬰兒配方奶粉中棕櫚酸問題的潛在資源,但是富集的棕櫚酸甘油酯仍存在腥味問題,如何解決還需進(jìn)一步研究。