基于PEDOT:PSS和HRP的電化學(xué)酶傳感器的制備與電催化應(yīng)用

邵 波，閆麗君，李曉燕，朱俊怡，楊翁琳，習(xí)亞茹，黨文迪，孫 偉

（海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，?？谑泄δ懿牧吓c光電化學(xué)重點實驗室，海南 ?？?571158）

導(dǎo)電聚合物是一類具有多孔結(jié)構(gòu)的高導(dǎo)電性的聚合物[1，2]，可以在多種氧化態(tài)之間相互轉(zhuǎn)化，常用于固定生物分子構(gòu)建電化學(xué)傳感器。聚（3，4-乙烯二氧噻吩）（PEDOT）是一種不溶于水的熱塑聚合物，具有良好的導(dǎo)電性、穩(wěn)定性、高度透明性等獨特性質(zhì)[3，4]。由于PEDOT不溶于大多數(shù)有機溶劑，故在PEDOT分子聚合過程中摻入聚乙烯苯磺酸（PSS）可得到在有機溶劑中穩(wěn)定存在且保持良好導(dǎo)電性的有機高分子聚合物材料聚（3，4-乙烯二氧噻吩）/聚乙烯苯磺酸（PEDOT:PSS）[5]。PEDOT:PSS具有很好的成膜性、高透明性、化學(xué)穩(wěn)定性以及易制備等特點，已被應(yīng)用于電化學(xué)傳感器、超級電容器、石墨烯薄膜等領(lǐng)域[6，7]。

辣根過氧化物酶（HRP）是由酶蛋白和鐵卟啉組成，內(nèi)含有活性中心亞鐵紅素，可以用于研究酶催化反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)、動力學(xué)性質(zhì)以及分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)。由于HRP的活性中心被包埋在蛋白質(zhì)外殼中導(dǎo)致它的電活性中心與電極間的傳遞速度較慢，因此可采用修飾劑和促進劑來加速電子轉(zhuǎn)移的進程[8，9]。

電化學(xué)生物傳感器是由電化學(xué)分析法和生物傳感技術(shù)相結(jié)合，具有靈敏度高、檢測成本低、操作簡便等優(yōu)良特性，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等方面受到了廣泛關(guān)注，開發(fā)高性能電化學(xué)生物傳感器成為當(dāng)今發(fā)展趨勢。本文開展了基于PEDOT：PSS-HRP的電化學(xué)酶傳感器的研究，并將其應(yīng)用于電催化分析及藥物樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CHI 1210A型電化學(xué)工作站，上海辰華儀器公司；Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo Scientific公司；Hitachi U-3900型紫外分光光度計，日本Hitachi儀器公司；三電極系統(tǒng)：自制修飾電極為工作電極、銀-氯化銀電極為參比電極、鉑絲電極為對電極。

聚（3，4-乙烯二氧噻吩）/聚乙烯苯磺酸（PEDOT:PSS），酷爾化學(xué)科技有限公司；辣根過氧化氫酶（HRP），上海雪滿生物科技有限公司；三氯乙酸（TCA），科密歐試劑化學(xué)有限公司；醫(yī)用換膚液（35%TCA），上海伊卡生物技術(shù)有限公司；石墨粉（30 μm），上海華誼集團華原化工有限公司；N-己基吡啶六氟磷酸鹽（HPPF6），蘭州雨陸精細(xì)化工有限公司；亞硝酸鈉（NaNO2），上海化學(xué)試劑廠；PBS溶液作為支持電解質(zhì)，在進行實驗前需通入N2除氧處理約30 min。

1.2 材料與修飾電極的制備

按照文獻制備CILE電極[10]，具體如下：將HPPF6和石墨粉按比例混合，研磨均勻后填充至玻璃管內(nèi)（φ=4 mm），在打磨紙上將電極界面打磨光滑即可使用。

將100 μL 30 mg/mL 的HRP 溶液與100 μL 9 mg/mL PEDOT:PSS 溶液混合振蕩3 min 后，采用滴涂法在CILE的表面滴涂6 μL的混合液，自然晾干后得到電化學(xué)酶傳感器（PEDOT:PSS-HRP/CILE）。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEDOT:PSS-HRP復(fù)合材料的光譜表征

圖1（A）是PEDOT:PSS-HRP與HRP的FT-IR圖。天然酶HRP結(jié)構(gòu)中酰胺在1700～1600 cm-1和1640～1500 cm-1有振動吸收峰[11]，PEDOT:PSS-HRP復(fù)合材料紅外光譜圖中酰胺在1652.78 cm-1和1572.42 cm-1有明顯吸收峰，與天然HRP吸收峰位置重合，說明HRP在PEDOT:PSS中能保持正常的天然結(jié)構(gòu)。

圖1（B）是PEDOT:PSS-HRP 與HRP 的UV-vis 譜圖，由圖1（B）可知PEDOT:PSS-HRP 混合溶液的吸收峰與HRP 的Soret 特征吸收峰均出現(xiàn)在401 nm，說明HRP 在PEDOT:PSS 溶液中可以穩(wěn)定地存在，沒有發(fā)生變性。

2.2 電化學(xué)表征

利用循環(huán)伏安法（CV）研究了PEDOT:PSS-HRP/CILE的電化學(xué)響應(yīng)，結(jié)果如圖2（A）所示，在PEDOT:PSS/CILE（曲線b）上未出現(xiàn)氧化還原峰，表現(xiàn)出穩(wěn)定的背景電流。在PEDOT:PSS-HRP/CILE（曲線a）上有明顯的氧化還原特征峰，且對稱性良好，氧化峰電位（Epa）為-0.111 V，還原峰電位（Epc）為-0.145 V，說明HRP在修飾電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移得以實現(xiàn)。

圖1 PEDOT:PSS-HRP與HRP的FT-IR(A)和UV-vis吸收光譜圖(B)Figure 1 (A)FT-IR spectra and(B)UV-visible absorption spectra of HRP and PEDOT:PSS-HRP solution

電化學(xué)交流阻抗譜圖（EIS）能夠有效地反映電極界面阻抗信息，電子轉(zhuǎn)移電阻（Ret）可以通過測量阻抗譜的半圓弧直徑求得。本研究考察了不同修飾電極在0.1 mol/L KCl和10.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]混合液中的交流阻抗譜，結(jié)果如圖2（B）所示，三種電極的電阻值分別為：34.178 Ω（PEDOT:PSS/CILE，曲線a）、109.749 Ω（CILE，曲線b）和53.486 Ω（PEDOT:PSS-HRP/CILE，曲線c），這是由于PEDOT:PSS具有高導(dǎo)電性可以有效提高電子的傳遞速率，減少了電子轉(zhuǎn)移界面電阻，而生物大分子HRP在電極表面的存在阻礙了電子轉(zhuǎn)移，增大了界面電阻。

圖2 （A）PEDOT:PSS-HRP/CILE（a）與PEDOT:PSS/CILE(b)在pH 2.0的PBS溶液中的循環(huán)伏安圖（掃速為0.1 V/s）；（B）PEDOT:PSS/CILE(a)，CILE(b)，PEDOT:PSS-HRP/CILE(c)在0.1 mol/L KCl和10.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]混合液中的交流阻抗譜Figure 2 (A)Cyclic voltammogram of PEDOT:PSS-HRP/CILE(a)and PEDOT:PSS/CILE(b)in PBS at the scan rate of 0.1V/s;(B)Electrochemical impedance spectra of PEDOT:PSS/CILE(a)，CILE(b)，PEDOT:PSS-HRP/CILE(c)in 0.1 mol/L KCl and 10 mmol/L K3[Fe(CN)6]mixture

2.3 掃速對電化學(xué)行為影響的研究

在0.1～0.9 V/s范圍內(nèi)研究了PEDOT:PSS-HRP/CILE上掃速對電化學(xué)行為的影響，結(jié)果如圖3（A）所示。峰電流隨著掃速的增加而增大，氧化峰的電位向正方向移動，還原峰電位則向負(fù)方向移動；Ipa和Ipc與掃速呈良好的線性關(guān)系（如圖3-B所示），線性回歸方程分別為Ipc=245.34υ+8.58（γ=0.991）和Ipa=-137.2υ-0.98（γ=0.988），表明該電極反應(yīng)是一個表面控制過程。Ep 和lnv 的關(guān)系如圖3（C）所示，線性方程表示為Epa（V）=0.020 lnυ-0.045（γ=0.974）和Epc（V）=-0.018 lnυ-0.235（γ=0.973）。通過Laviron 方程[12]求出電子轉(zhuǎn)移數(shù)（n）、電子轉(zhuǎn)移系數(shù)（α）和電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)（ks）的值分別為：n=1.05，α=0.51，ks=3.52 s-1。本體系的ks值大于文獻中所報道的電極體系，如ZnO-graphene-Nafion-HRP（1.94）[13]，Nafion/HRP/Co3O4-GR/CILE（2.90）[14]和Nafion-songel-carbon-HRP/GCE（1.29）[15]，表明具有較快的轉(zhuǎn)移速率。

圖3 （A）EDOT:PSS-HRP/CILE在不同掃速下的循環(huán)伏安曲線（a-i：0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 V/s）；（B）Ipa和Ipc與掃速的關(guān)系圖；（c）Ep和lnυ的關(guān)系圖Figure 3 (A)Cyclic voltamograms at different scan rate(a-i:0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 V/s);(B)the linear relationship between peak current and scan rate;(C)the linear relationship between Ep and lnυ

2.4 電催化性能

運用循環(huán)伏安法考察了修飾電極在pH=2的PBS中對不同濃度下TCA的催化性能。如圖4（A）所示，隨著體系中TCA濃度的增大，還原峰逐漸增大，氧化峰逐漸減小且最后消失。

還原峰電流值與TCA 濃度在0.0～300.0 mmol/L 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（如圖4B 所示），線性回歸方程為I（mA）=0.003C+0.006（γ=0.998），檢測限為0.67 mmol/L（3σ）。當(dāng)TCA濃度大于300.0 mmol/L時，還原峰的電流趨于穩(wěn)定，表明反應(yīng)過程符合Michaelis-Menten動力學(xué)方程。通過表觀米氏常數(shù)（KappM）可以了解HRP在修飾電極上的催化效果，利用Lineweaver-Burk 方程[16]和雙倒數(shù)作圖法求得KappM為3.51 mmol/L，該數(shù)據(jù)小于文獻報道的體系，如HRP–PVA–C12–C12–C12/GCE（5.66 mmol/L）[17]，HRP-agarosehydrogel-[bmim][PF6]/GCE（52.0 mmol/L）[18]，說明HRP表現(xiàn)出較好的催化性能。該催化反應(yīng)方程式如下所示。

HRP Fe(Ⅲ)+e →HRP Fe(Ⅱ)

2 HRP Fe(Ⅱ)+Cl3CCOOH+H+→2 HRP Fe(Ⅲ)+Cl2CHCOOH+Cl-

HRP Fe(Ⅱ)+e →HRP Fe(Ⅰ)

2 HRP Fe(Ⅰ)+Cl2CCOOH+H+→2 HRP Fe(Ⅱ)+ClCH2COOH+Cl-

2 HRP Fe(Ⅰ)+ClCH2COOH+H+→2 HRP Fe(Ⅱ)+CH3COOH+Cl-

同時通過循環(huán)伏安法對NaNO2進行了研究，如圖4（C）所示。隨著NaNO2濃度的增加，在-0.55 V處還原峰明顯增大，氧化峰逐漸減小最終消失。由圖4（D）可知NaNO2在0.5～9.0 mmol/L范圍內(nèi)濃度與還原峰電流呈線性關(guān)系，線性方程為：I（mA）=0.047C+0.14（γ=0.991），檢測限為0.01 mmol/L，KappM為18.47 mmol/L，表明PEDOT:PSS-HRP/CILE對NaNO2也有良好的電化學(xué)響應(yīng)。

2.5 實際樣品的檢測

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法[19]將PEDOT:PSS-HRP/CILE 用于醫(yī)用換膚液（含35%TCA）中TCA 的含量檢測，結(jié)果如表1，回收率在94.0%～105.6%之間，表明該檢測方法可用于實際樣品中TCA的分析，具有較好的測定結(jié)果。

3 結(jié)論

采用HPPF6修飾的碳糊電極作為基底電極，以PEDOT:PSS和HRP作為修飾劑制備了電化學(xué)生物傳感器（PEDOT:PSS-HRP/CILE）。傅立葉變換紅外光譜和紫外光譜測定結(jié)果表明HRP 在PEDOT:PSS 中保持生物結(jié)構(gòu)。PEDOT:PSS-HRP/CILE對TCA和NaNO2的檢測具有較寬的檢測范圍，對實際樣品中TCA的檢測取得較好的結(jié)果。

圖4 （A）修飾電極在不同濃度下的TCA溶液中的循環(huán)伏安圖；（B）還原峰電流隨TCA濃度的變化曲線；（C）修飾電極在不同濃度下的NaNO2中的循環(huán)伏安圖；（D）還原峰電流隨NaNO2濃度的變化曲線Figure 4 (A)Cyclic voltammograms of modified electrodes in different concentrations of TCA solution(a-k is 0.1，0.2，0.3，0.4，0.8，1.2，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mol/L，respectively);(B)peak current change with different concentrations of TCA;(C)Cyclic voltammograms of modified electrodes in different concentrations of NaNO2(a-i:0.5，1.0，1.6，2.6，3.6，4.5，6.0，8.0，9.0 mmol/L);(D)peak current change with different NaNO2 concentration

表1 生物樣品中TCA的檢測結(jié)果（n = 3）Table 1 Test results of TCA in biological samples（n = 3）