3D打印技術(shù)在小鼠主動脈縮窄模型影像學(xué)評價中的應(yīng)用研究

徐臣年，劉 洋，丁 鵬，王曉武，馬燕燕，馬繼鵬，李蘭蘭，楊 劍

肥厚型心肌病及主動脈弓縮窄是常見的結(jié)構(gòu)性心臟病，常導(dǎo)致心功能下降、心力衰竭，嚴(yán)重者心源性猝死風(fēng)險極高，兩種疾病均有心肌肥厚的病理表現(xiàn)［1－2］。主 動 脈 縮 窄（transverse aortic coarctation，TAC）致心肌肥厚是建立肥厚型心肌病的動物模型方法之一，用于研究心肌肥厚致病機理、篩選具有治療作用的藥物。以往主動脈縮窄模型檢測通過小鼠心臟超聲檢測心功能、血清生化指標(biāo)等進行判斷，3D打印技術(shù)的出現(xiàn)并與醫(yī)學(xué)心血管研究相結(jié)合，建立了一種新的更直觀的影像學(xué)評估方法［3－4］。隨著心血管介入技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是近年來逐步興起并成熟的結(jié)構(gòu)性心臟病的介入治療——經(jīng)導(dǎo)管瓣膜置換術(shù)、主動脈覆膜支架植入術(shù)、瓣周漏介入封堵術(shù)等，需要介入術(shù)者充分了解患者術(shù)前病變部位的解剖結(jié)構(gòu)，3D打印技術(shù)可以個體化的復(fù)制病變部位解剖結(jié)構(gòu)，精確模擬制作可視化三維模型，對于患者術(shù)前評估、模型評估具有重要意義［5－8］。本文通過利用3D打印技術(shù)對TAC模型主動脈重建，探討3D打印技術(shù)在小鼠主動脈縮窄模型評價中應(yīng)用的可行性及有效性。

1 材料與方法

1.1 材料 10周齡C57BL／6雄性小鼠20只購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)Vevo2100購自加拿大Visual Sonics公司，小動物Inveon Micro CT購自德國西門子公司，光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，F(xiàn)orm2打印機購自美國Formlabs公司，3D打印樹脂材料Clear V4（透明）購自美國Formlabs公司，PBS緩沖溶液，碘普羅胺注射液（優(yōu)維顯370）購自德國Bayer公司，Mimics 21.0軟件、3－Matic軟件均購自比利時Mate?rialise公司。蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑均購自美國Sigma公司，抗GAPDH、抗β－肌球蛋白重鏈（β－MHC）抗體、抗心房鈉尿肽、抗腦型心房鈉尿肽抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔、山羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋公司，Minivent 845小動物呼吸機購自美國Harvard Apparatus公司。

1.2 分組及模型建立 TAC組經(jīng)異氟烷麻醉后，將小鼠固定于操作臺，行氣管內(nèi)插管后，連接小動物呼吸機輔助呼吸機麻醉。于胸骨上切跡處剪開皮膚，作1 cm左右縱行切口，剪開胸骨，胸廓擴張器撐開切口，分離胸腺等組織，清晰顯露主動脈弓部，于主動脈弓部第一、第二分支之間部位穿7－0 silk線，用絲線將主動脈與預(yù)置的25 G針頭共同結(jié)扎后撤出針頭，逐層關(guān)胸。Sham組采用縱劈胸骨術(shù)式，逐層分離組織至主動脈弓后，不作處理，逐層關(guān)胸。

兩組小鼠飼養(yǎng)28 d后，進行取材及檢測。

1.3 主動脈超聲檢測 C57小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，胸腹部脫毛后固定于Vevo 2100超聲影像系統(tǒng)的操作臺上，四肢接觸操作臺心電圖電極，小鼠口鼻部罩管連接麻醉儀，于小鼠胸前區(qū)涂抹適量超聲耦合劑，將MS400超聲探頭將鼠板向操作者右側(cè)傾斜約30°，選擇Ao Arch檢測模式，調(diào)整探頭獲取清晰的右心室圖像，將圖像向鼠頭側(cè)緩慢移動獲得主動脈弓圖像，可同時觀察到無名動脈、左側(cè)頸總動脈、左側(cè)鎖骨下動脈、主動脈弓縮窄部位，保存圖像。

1.4 顯微CT掃描及3D打印 C57BL／6小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后作胸部正中切口分離皮膚及皮下筋膜，于肋骨劍突穿透橫膈膜進入胸腔，暴露心臟，1 ml注射器抽取碘普羅胺造影劑，沿心尖部穿刺進入左心室，保持注射器位置，緩慢推動注射器將造影劑注入左心室，造影劑推注約1 ml后停止灌注，使用小動物Inve?on Micro CT進行胸前區(qū)掃描，采集CT血管造影圖像（CT angiography，CTA）數(shù)據(jù)。

將CTA原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為DICOM格式后導(dǎo)入Materialise Mimics 21.0軟件，選擇收縮末期影像，利用Threshold調(diào)節(jié)閾值，選擇主動脈區(qū)域，構(gòu)建蒙版（mask），結(jié)合Region Grow、Split Mask、Edit Masks等功能提取出主動脈蒙版，構(gòu)建主動脈三維模型，并以STL格式導(dǎo)入3－Matic軟件，獲得可用于3D打印的立體光刻（stereo lithography，STL）格式文件。采用Form2打印機（美國Stratasys公司）和透明樹脂材料Clear V4完成主動脈3D模型打印。

1.5 心肌組織HE染色和Masson染色 2組小鼠飼養(yǎng)28 d后，將各組小鼠心臟取出，用預(yù)冷的PBS將心臟內(nèi)殘余血液沖洗干凈，將各組小鼠心臟分別放入盛有40 g／L多聚甲醛的EP管中固定48 h，行常規(guī)的石蠟包埋、切片，并分別進行HE和Masson染色。光鏡下（×400）觀察心肌組織變化。每張HE切片隨機讀取不少于10個視野，每個視野選取10個心肌細(xì)胞橫截面（截面呈近似圓形），應(yīng)用Case?Viewer軟件分別測量截面面積（2μm）并記錄。

1.6 小鼠心臟重量（heart weight，HW）、體重（body weight，BW）、脛骨長度（tibial length，TL）測量 將各組小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，放置于已調(diào)零的電子天平上稱取并記錄BW，將小鼠仰臥位固定于小動物解剖臺，頸部皮膚正中做1 cm左右切口，逐層剝離皮下組織，分離一側(cè)頸總／內(nèi)動脈，用眼科剪離斷一頸總／內(nèi)動脈放血，完畢后，以組織剪剪開胸骨，剝離心臟周圍組織及主動脈，游離出心臟，在主動脈根部離斷，將心臟放入預(yù)冷的PBS溶液中，清洗血細(xì)胞后將心臟放到濾紙上吸干表面溶液后稱重。將小鼠右后肢皮膚縱行切開，逐層分離皮下組織、肌肉組織，將脛骨游離出，進一步剔除脛骨表面附著的肌肉組織，用游標(biāo)卡尺測量脛骨長度。記錄每只小鼠BW、HW及TL，計算HW／BW，HW／TL。

1.7 Western blot檢測 提取各組小鼠心肌組織蛋白β－主要組織相容性復(fù)合體（major histocompati?bility complex，β－MHC）、心房利鈉肽（atrial natri?uretic peptide，ANP）和腦鈉肽（brain natriuretic pep?tide，BNP），提取方法、分離、封閉等具體操作參考文獻(xiàn)9［9］，孵育抗β－MHC（1∶1 000稀釋）、抗ANP（1∶1 000稀釋）、抗BNP（1∶1 000稀釋）和抗磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（1∶1 000稀釋）抗體，4℃條件下12 h；用TBST溶液洗滌3次；室溫孵育對應(yīng)的二抗（1∶5 000稀釋）1.5 h；用TBST洗滌3次。使用Bio－Rad成像系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)條帶，內(nèi)參選擇GAPDH，使用Image Lab軟件定量分析。

1.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，Graph Pad Prism 5軟件進行作圖。計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用配對樣本t檢驗方法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

TAC組10只小鼠全部存活4周，超聲測量結(jié)果見表1。TAC組小鼠左室射血分?jǐn)?shù)（31.15±12.56）%、左室短軸縮短率（12.95±6.52）%、收縮期左室內(nèi)容積（20.46±2.99）μl、舒張期左室內(nèi)容積（66.64±8.30）μl明顯低于Sham組（P＜0.01）。

超聲二維圖像顯示其主動脈縮窄（圖1），3D打印重建模型從不同角度清晰顯示主動脈縮窄部位（圖2）。

與Sham組相比，TAC組心肌橫截面積明顯增大（P＜0.05）（圖3）。Sham組HW／BW比值、HW／TL長度比值明顯低于TAC組（P＜0.05）（圖4）。

圖1 TAC組小鼠主動脈縮窄超聲影像

圖2 主動脈縮窄C57小鼠CT重建影像及3D打印模型

圖3 兩組小鼠心臟HE染色結(jié)果（×400）

表1 兩組小鼠超聲測量結(jié)果（n＝10，±s）

表1 兩組小鼠超聲測量結(jié)果（n＝10，±s）

注：LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)；FS：左室縮短率；LVEDV：左室舒張末期容積；LVESV：左室收縮末期容積。

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圖4 兩組小鼠HW分別與BW和TL的比較

圖5 兩組小鼠心肌組織Western blot檢測

3 討 論

一直以來對肥厚型心肌病的基礎(chǔ)機制的探索不斷推陳出新，而最近在其臨床治療方法方面也有了革新性的突破——超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮心肌內(nèi)室間隔射頻消融術(shù)（percutaneous intramyocardialseptal radiofre?quency ablation，PIMSRA）——Liwen術(shù)式的一種［10］。成人主動脈弓縮窄也由體外循環(huán)下開胸手術(shù)發(fā)展為可選擇更加微創(chuàng)的治療方式——經(jīng)皮覆膜支架植入術(shù)（percutaneous covered stent implantation，PCSI）［11］。Liwen術(shù)式、PCSI等介入手術(shù)是借助影像技術(shù)在非直視狀態(tài)下進行的，有賴于影像學(xué)技術(shù)的進步以及術(shù)者對解剖結(jié)構(gòu)的充分認(rèn)知，而在基礎(chǔ)科研實驗中也需要對心肌肥厚、TAC進行影像學(xué)的評價。本文旨在探索應(yīng)用3D打印技術(shù)對TAC小鼠縮窄部位的模型重建，驗證3D打印模型用于評價TAC模型的可行性以及有效性。

利用計算機斷層掃描、超聲、磁共振影像學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合Mimics、3Mensio等工程軟件進行體外數(shù)據(jù)重建，將數(shù)據(jù)輸入3D打印機中可以打印出不同材質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型，在體外進行觀察以及操作。3D打印技術(shù)經(jīng)歷了20余年的發(fā)展，目前已在口腔科學(xué)、骨科、整形外科神經(jīng)外科等多個學(xué)科領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，包括植入物和設(shè)計、手術(shù)規(guī)劃、醫(yī)學(xué)科研、教育及培訓(xùn)［12－17］。

本研究通過TAC方法建立動物模型，HE、Mas?son組織學(xué)染色結(jié)果提示TAC組小鼠心肌細(xì)胞橫截面積增大、心肌纖維化，同時，Sham組HW／BW、HW／TL明顯低于TAC組，而TAC組小鼠心肌組織中肥厚相關(guān)蛋白β－MHC、ANP、BNP相對表達(dá)量明顯增高，證實了TAC組小鼠出現(xiàn)心肌肥厚。影像學(xué)檢查4周超聲結(jié)果在二維影像上提示結(jié)扎部位存在狹窄，同時心功能下降、左室容積減小。同樣地，CTA影像數(shù)據(jù)重建可以直觀觀察到狹窄部位，在體外從三維形態(tài)上觀察TAC組小鼠TAC部位解剖結(jié)構(gòu)，證實了3D打印模型的體外模擬作用。

3D打印技術(shù)在醫(yī)學(xué)心血管中的應(yīng)用相對較晚，應(yīng)用范圍也存在限制。然而，根據(jù)《中國心血管病報告2017》指出，心血管病死亡占居民疾病死亡原因構(gòu)成比的40%以上，居首位，高于腫瘤及其他疾病?？傮w上，中國心血管病患病率及死亡率仍處于上升階段。推算心血管病患人數(shù)2.9億，其中腦卒中1 300萬，冠心病1 100萬，肺原性心臟病500萬，心力衰竭450萬，風(fēng)濕性心臟病250萬，先天性心臟病200萬，高血壓2.7億。巨大的患者群體及市場應(yīng)用前景也促進了3D打印技術(shù)在心血管領(lǐng)域的不斷拓展，目前3D打印技術(shù)在心血管疾病中的應(yīng)用從幫助臨床診斷到指導(dǎo)手術(shù)治療、增進醫(yī)患溝通、模擬手術(shù)、體外及動物實驗高級心血管研究等［18－21］。本研究通過在小鼠TAC模型上進行3D打印模型的建立，旨在闡明3D打印技術(shù)在動物實驗中的影像學(xué)評價作用，為大動物模型甚至人體主動脈弓縮窄疾病的影像學(xué)評價及體外模擬提供實驗基礎(chǔ)。

綜上所述，在小鼠TAC模型影像學(xué)評價中，3D打印技術(shù)的應(yīng)用具有可行性。未來，3D打印技術(shù)在其他結(jié)構(gòu)性心臟病中還有進一步應(yīng)用和拓展的空間，同時，隨著材料學(xué)、生物工程、組織工程等學(xué)科領(lǐng)域的不斷發(fā)展與融合，促使3D生物打印技術(shù)的不斷進步，相信3D打印將很快應(yīng)用于臨床心血管生物產(chǎn)品的制作。