不同類型心臟停搏液對(duì)小鼠未成熟心肌細(xì)胞增殖能力的影響

劉懷普，梁彥鍇，吳柯葉，鄭豐楠，譚小莉，孟保英

心內(nèi)直視手術(shù)過程中，由于缺血／再灌注損傷、溶血、中性粒細(xì)胞活化等因素的影響，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，未成熟心肌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)、代謝和功能方面有明顯差別，其更容易受到活性氧的損害［1］。研究表明，生后≤7 d的小鼠和≤3個(gè)月的人類心肌細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力［2－3］，而活性氧造成的DNA損傷，是導(dǎo)致心肌細(xì)胞增殖能力下降的關(guān)鍵因素之一［4］。目前用于未成熟心肌細(xì)胞保護(hù)的心臟停搏液種類繁多，何為最佳方案仍有爭(zhēng)議，因此，本研究從細(xì)胞增殖的角度，比較不同類型心臟停搏液對(duì)小鼠未成熟心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57／BL新生小鼠（生后3 d內(nèi)），其母鼠購自深圳大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑和儀器 EdU－488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（BeyoClickTM）、Anti－Rabbit HRP（AB6721）、Anti－Ki－67（AB15580）、0.25% Trypsin－EDTA（GIBCO 25200－026）、FBS（GIBCO 10091－148）、馬血清（蕊特生物W9010－05）、DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)基（GIBCO 11320－033）、Collagenase Type II（GIBCO 17101－015）、MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（C0009）、倒置熒光顯微鏡（Olympus IX71）、二氧化碳培養(yǎng)箱（hf151uv Heal Force）、全波長酶標(biāo)儀（Multiskan GO1 510）等。

1.3 新生小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 生后3 d內(nèi)新生C57／BL小鼠10只，以75%乙醇消毒后，固定于無菌臺(tái)，沿胸骨中線剪開胸腔，迅速切取心臟，至于4℃緩沖液中［20 mmol／L HEPES－NaOH（pH 7.6），130 mmol／L NaCl，1 mmol／L NaH2PO4，4 mmol／L葡萄糖，3 mmol／L KCl］，洗凈心腔內(nèi)血液后，去除心房和大血管組織，將心室組織剪成1～3 mm3大小的碎塊，并移入盛有青霉素溶液的無菌瓶中。向無菌瓶加入2 ml 0.08%胰酶－0.1%Ⅱ型膠原酶的1∶1混合液，磁力攪拌消化（轉(zhuǎn)速20～30 r／min，37℃）。首次消化6 min，棄上清，之后每次消化5 min，將消化液轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中，其內(nèi)包含1 ml 20%胎牛血清DMEM－F12培養(yǎng)基，以終止胰酶作用，并于4℃冷藏保存，按照以上步驟，共消化7～8次。然后將上述消化液混合后于離心（1 100 r／min，10 min），棄上清，以含20%胎牛血清和5%馬血清的DMEMF12培養(yǎng)基重懸，200目孔徑不銹鋼網(wǎng)慮除未消化的大塊組織。將過濾后的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，置于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，1.5 h后去除尚未貼壁的細(xì)胞懸液后，轉(zhuǎn)入另一塊培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將新生小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，通過隨機(jī)數(shù)字法分為5組：空白對(duì)照組（A組）、復(fù)方電解質(zhì)液組（B組）、改良圣托馬斯液（St.Tho?ma’s，STH）組（C組）、組氨酸－色氨酸－酮戊二酸鹽液（Histidine－Tryptophan－Ketoglutarate solution，HTK）組（D組）以及仿del Nido液組（E組）。其中仿del Nido液以培養(yǎng)基代替血液與晶體按1∶4比例混合。將B、C、D、E四組的培養(yǎng)基分別換成4℃的復(fù)方電解質(zhì)液、改良STH液、HTK液和仿del Nido液，然后將五組細(xì)胞在室溫培養(yǎng)箱外無菌環(huán)境下放置2 h，更換至正常培養(yǎng)基，繼續(xù)5%CO2、37℃條件下置于培養(yǎng)24～72 h。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 5－乙炔基－2’脫氧尿苷（5－Ethynyl－2’－de?oxyuridine，EdU）熒光染色 將停搏液處理后的各組心肌細(xì)胞更換至正常培養(yǎng)基后，加入預(yù)先配制好的EdU溶液，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行細(xì)胞固定與Edu染色標(biāo)記，計(jì)數(shù)EdU陽性心肌細(xì)胞百分比。

1.5.2 Ki－67熒光染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) Ki－67是一種與細(xì)胞增殖狀態(tài)相關(guān)的核心蛋白，對(duì)停搏液干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)48 h的5組細(xì)胞進(jìn)行Ki－67免疫熒光檢測(cè)，計(jì)數(shù)方法為：熒光顯微鏡40×目鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，其中陽性細(xì)胞指有Ki－67陽性產(chǎn)物并有細(xì)胞核染色的細(xì)胞。

1.5.3 MTT比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞增殖 停搏液干預(yù)后的五組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活和生長，使用全波長酶標(biāo)儀（Multiskan GO1 510）在波長570 nm處檢測(cè)心肌細(xì)胞的吸光度值。

1.5.4 Yes相關(guān)蛋白1（Yes－associated protein 1，YAP1）表達(dá) YAP1是Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下YES相關(guān)蛋白，在細(xì)胞增殖和分化過程中起關(guān)鍵作用。采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)停搏液干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)48 h的細(xì)胞中YAP1蛋白的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料采用率的形式表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）方法，方差齊性檢驗(yàn)采用Bart?lett＇s檢驗(yàn)，組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 新生小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)觀察 將分離培養(yǎng)48 h后的心肌細(xì)胞放置光鏡下觀察其形態(tài)，可見未貼壁心肌細(xì)胞為圓形、發(fā)亮，已貼壁的心肌細(xì)胞伸展為梭形、棒狀、星狀及分叉狀等（見圖1）。

圖1 光鏡下新生小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)（100X）

2.2 EdU熒光染色觀察細(xì)胞增殖情況 綠色代表增殖細(xì)胞核，藍(lán)色代表全部細(xì)胞核。與A組相比，B、C、D、E組細(xì)胞明顯增多（圖2）。B、C、D、E組的細(xì)胞增殖率明顯高于A組（P＜0.001），其中D組最高，C組次之，E組小于B組，即HTK液組＞改良STH液組＞復(fù)方電解質(zhì)液組＞仿del Nido液組＞對(duì)照組。見圖3。

圖2 EdU標(biāo)記增殖的心肌細(xì)胞（200X）

圖3 EdU免疫染色陽性心肌細(xì)胞百分比

2.3 Ki－67免疫陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) 紅色代表Ki－67免疫陽性細(xì)胞核，藍(lán)色代表全部細(xì)胞核，與A組相比，B、C、D、E組細(xì)胞明顯增多（見圖4）。B、C、D、E組的細(xì)胞增殖率明顯高于A組（P＜0.001），其中D組最高，C組次之，E組小于B組，即HTK液組（15.8%）＞改良STH液組（12.6%）＞復(fù)方電解質(zhì)液組（12.3%）＞仿del Nido液組（9.0%）＞對(duì)照組（8.0%）。見圖5。

2.4 MTT比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞增殖 酶標(biāo)儀在波長570 nm處檢測(cè)OD值結(jié)果（表1）：D（HTK液）組＞C（改良STH液）組＞E（仿Del Nido液）組＞B（復(fù)方電解質(zhì)液）組＞A（對(duì)照）組。

圖4 Ki－67標(biāo)記增殖心肌細(xì)胞（200X）

表1 5組心肌細(xì)胞OD值結(jié)果（n＝18，±s）

表1 5組心肌細(xì)胞OD值結(jié)果（n＝18，±s）

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2.5 YAP1蛋白表達(dá) 采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)5組心肌細(xì)胞YAP1蛋白的表達(dá)水平，用β－actin作為內(nèi)參對(duì)照，D組YAP1蛋白表達(dá)高于其他各組，A、B、C和E組間無明顯差異（圖6）。

3 討 論

心臟停搏液在先天性心臟病矯治術(shù)中的應(yīng)用已有40多年的歷史，其與低溫技術(shù)相結(jié)合，依然是預(yù)防心肌缺血／再灌注損傷的主要方法。目前，心臟停搏液的種類繁多，但孰優(yōu)孰劣仍有爭(zhēng)議，且研究內(nèi)容主要集中于心肌標(biāo)志物、炎癥指標(biāo)、血管活性藥物需求及ICU停留時(shí)間等。而研究表明：未成熟心肌不同于成熟心肌，其具有較強(qiáng)的增殖能力［2－3］。故本研究以心肌細(xì)胞增殖為觀察指標(biāo)，比較3種常用心臟停搏液對(duì)未成熟心肌的保護(hù)作用。在本研究中，為比較改良STH液、HTK液和仿del Nido液對(duì)新生小鼠心肌細(xì)胞增殖能力的影響，采用3種不同的實(shí)驗(yàn)方法觀察了3種反應(yīng)細(xì)胞增殖能力的指標(biāo)，最終結(jié)果均表明HTK液保護(hù)心肌細(xì)胞增殖能力最好，改良STH液次之。

圖5 Ki－67免疫陽性心肌細(xì)胞百分比

圖6 心肌細(xì)胞YAP1蛋白的表達(dá)情況

測(cè)量細(xì)胞增殖能力最準(zhǔn)確的方法是直接測(cè)量DNA合成，EdU（5－乙炔基－2’脫氧尿苷）是胸苷的類似物，能在DNA合成過程中加入其中［5］。本研究提示HTK液組DNA合成最為活躍，對(duì)照組DNA合成活動(dòng)最低，證明HTK液組處于增殖狀態(tài)的心肌細(xì)胞比例最高。Ki－67蛋白是一種位于細(xì)胞核內(nèi)的大分子蛋白，是細(xì)胞增殖必不可少的非組蛋白，其功能與染色質(zhì)和細(xì)胞有絲分裂有關(guān)，是辨認(rèn)細(xì)胞群中增殖細(xì)胞的優(yōu)異標(biāo)志［6－7］。本研究中Ki－67免疫熒光檢查結(jié)果與EdU免疫染色結(jié)果類似，提示HTK組染色體復(fù)制和有絲分裂最活躍，亦證明HTK液組處于增殖狀態(tài)的心肌細(xì)胞比例最高。采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖，具有靈敏、穩(wěn)定、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，本研究中隨著時(shí)間的延長，各組OD值均呈線性上升，其中HTK液組上升幅度最大，對(duì)照組曲線相對(duì)平直，與前兩種方法檢測(cè)結(jié)果不同的是，該法測(cè)得的仿del Nido液細(xì)胞增殖率明顯高于復(fù)方電解質(zhì)液組。

YAP1為一種YES相關(guān)蛋白，是Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要效應(yīng)物，通過與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖［7］。HTK液組YAP1的表達(dá)高于其他各組，提示HTK液對(duì)心肌增殖能力的保護(hù)作用的機(jī)制可能與Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。HTK液成分仿細(xì)胞內(nèi)液，能夠使心肌在低鉀、低鈉、無鈣環(huán)境下舒張期停搏，以組氨酸／組氨酸鹽緩沖對(duì)作為酸堿平衡系統(tǒng)，并添加色氨酸和α－酮戊二酸作為能量底物，其被認(rèn)為是心臟移植手術(shù)中器官保存的“金標(biāo)準(zhǔn)”［8－9］。其對(duì)未成熟心肌增殖能力保護(hù)作用的其他機(jī)制可能是：①組氨酸／組氨酸鹽緩沖對(duì)具有強(qiáng)大的酸堿緩沖能力；②甘露醇和色氨酸能夠穩(wěn)定細(xì)胞膜和維持細(xì)胞膜滲透壓調(diào)節(jié)；③添加α－酮戊二酸作為底物，能改善高能ATP合成。改良STH液是一種典型的細(xì)胞外液型高鉀停搏液［10］，其在本研究中對(duì)心肌細(xì)胞增殖能力的保護(hù)作用僅次于HTK液，表明其是一種優(yōu)良的未成熟心肌晶體停搏液。單純采用4℃復(fù)方電解質(zhì)液處理，結(jié)果亦顯示出明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與低溫對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)。del Nido液是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)未成熟心肌停搏液［11］，然而本研究中仿del Nido液組EdU免疫陽性細(xì)胞百分比（20.0% vs.22.5%）和Ki－67陽性細(xì)胞百分比（9.0%vs.8.0%）均低于復(fù)方電解質(zhì)液組（P＜0.001），可能是本研究中的仿del Nido液與臨床使用的正規(guī)del Nido液差距較大所致，這也是本研究的局限性之一。

綜上所述，HTK液和改良STH液對(duì)離體新生小鼠心肌細(xì)胞增殖具有明顯的保護(hù)作用，其中前者的保護(hù)作用更優(yōu)。