中國櫻桃(Prunus pseudocerasus Lindl.)IRAP分子標記技術體系的建立

劉厚宇，李順雨，吳敏芳，喬 光，吳亞維，宋 莎

(1.貴州大學農業(yè)生物工程研究院/生命科學院，山地植物資源保護與種質創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴陽 550025;2.貴州大學林學院, 貴陽 550025； 3.貴州省清鎮(zhèn)市農業(yè)農村局, 貴陽 550004；4.貴州省威寧自治縣果業(yè)發(fā)展中心, 貴州威寧 553100；5.貴州省農業(yè)科學院果樹科學研究所，貴陽 550006)

中國櫻桃(PrunuspseudocerasusLindl.)是櫻桃中產地為中國的櫻桃種家族，相對于歐洲甜櫻桃，其風味獨特，在中國適應性廣。很多學者利用AFLPs[1]、ISSR[2]、SSR[3]等分子標記技術對中國櫻桃開展了諸如遺傳多樣性評價、遺傳穩(wěn)定性檢測、種質鑒定等研究。但這些方法各有缺點，如ISSR標記對體細胞遺傳變異檢測效率較低；AFLP技術對基因組純度和反應條件要求較高，且用于遺傳作圖時，少數(shù)的標記和圖譜緊密度有出入；SSR標記標記密度低，檢測方法較為單一[4,5]。

LTR家族反轉錄轉座子在高等植物中以高拷貝數(shù)普遍存在[6]，copia和gypsy家族轉座子是LRT轉座子的主要組成部分，如在梨上，Gypsy和Copia分別占基因組的25.5%以及14.9%[7]。因此利用反轉錄轉座子逆轉錄酶基因相關的分子標記，在遺傳多樣性和系譜研究、遺傳連鎖圖譜構建及性狀基因定位方面具有很大的發(fā)展?jié)摿8]。IRAP(interretrotransposon amplified polymorphism)是基于反轉錄轉座子序列間多態(tài)性的一種分子標記[9]開發(fā)，原理是在逆轉錄酶保守區(qū)域或者LTRs保守區(qū)域設計引物，操作方便，靈敏度高。在前期工作中，我們克隆了中國櫻桃的LTR反轉錄轉座子Ty 1-copia和Ty 3-gypsyRT序列。本研究根據這些序列設計IRAP引物，篩選具多態(tài)性高的引物，并建立IRAP-PCR技術體系，旨在為櫻桃遺傳變異研究、遺傳多樣性評價、種質鑒定等方面提供新型分子標記。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

IRAP-PCR分子標記反應體系建立使用材料來自貴州省農科院果樹所落葉果樹種質資源圃，以貴州省內黔西、赫章、納雍、關嶺、盤縣、修文等地的14種中國櫻桃(P.pseudocerasusLindl.)資源幼葉為試材，用于檢測IRAP-PCR產物多態(tài)性的非變形聚丙烯酰氨凝膠電泳適宜濃度以及計算引物多態(tài)性等信息。取樣時間及方法：3月中旬，取幼葉于自封袋，冰盒保存迅速帶回實驗室，清水洗凈、液氮處理后置于-80 ℃冰箱保存。用于 PCR 擴增的TaqDNA 聚合酶和 dNTPs 購自大連寶生物工程公司。DNA提取試劑盒購自北京天根生物科技公司(貨號：DP 302)。使用核酸微量測定儀及瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA濃度及質量。

1.2 IRAP引物設計及篩選

根據本研究前期工作中獲得的中國櫻桃Ty 1-copia和Ty 3-gypsyRT(逆轉錄酶)基因保守端序列設計引物(表1)。引物由上海生工生物科技有限公司合成，表1中退火溫度(Tm)值由序列自動計算。

表1 IRAP引物設計

根據引物計算的退火溫度，以上下浮動4～5 ℃范圍，在梯度PCR儀上相隔1 ℃設8個溫度梯度篩選最適的退火溫度。PCR反應程序為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，復性45 s(Tm視引物而定)，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃下保存。PCR反應產物，在含有EB的2%瓊脂糖凝膠中，以5 V·cm-1的電壓電泳50 min，然后于凝膠分析儀中觀察并拍照保存。將引物與退火溫度篩選同時進行，選擇條帶數(shù)量多，清晰度好的引物。

1.3 PCR反應體系的優(yōu)化

對PCR反應體系里的MgCl2、Taq酶、引物、模板DNA以及dNTP設置5個濃度因子，每因子設4個濃度梯度進行正交設計，優(yōu)化反應體系(見表2)，共16個組合。其中，模板DNA濃度是10 ng，引物稀釋了10倍，Taq酶稀釋了5倍，MgCl2離子濃度是 25 mmol·L-1，dNTPs 的濃度 2.5 mmol·L-1，10× PCR Buffer 2.5μL,PCR體系總體積為 25μL。

表2 IRAP-PCR正交實驗設計

1.4 PCR產物檢測技術的優(yōu)化

設計2.0%的瓊脂糖凝膠以及濃度為5%、6%、8%、10%的非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳，檢測IRAP-PCR產物的多態(tài)性。非變性PAGE膠各組分配制見表3，依次加入組分，TEMED和10% APS攪拌均勻定容至60 mL。

表3 非變性膠濃度的設置

瓊脂糖電泳電壓為100 V，電泳時間80 min。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳為150 V，電泳時間根據不同濃度設定，范圍在1.2～2.5 h之間。凝膠取出后放入含有5%冰醋酸和10%乙醇的固定液容器中，置搖床上 100 r·min-1固定 15 min。0.1%的硝酸銀置搖床上 100 r·min-1銀染 15 min，迅速用dd H2O快速清洗2次。加入顯色液(-20 ℃預冷10 min)(包含1.5% NaOH+1.1%甲醛)輕搖至條帶清晰，用dd H2O沖洗膠表面的顯色液，拍照分析。

2 結果與分析

2.1 引物及退火溫度的篩選

退火溫度是影響多態(tài)性的重要因素，圖1顯示了部分引物受退火溫度變化的影響，隨著溫度降低，條帶亮度增高，小片段也越發(fā)清晰，但是1 500～2 000 bp的片段無法顯示，1 000～1 500 bp左右的片段特異性不高，呈現(xiàn)彌散狀。隨著溫度升高，大片段更加清晰，但是小片段無法呈現(xiàn)。根據條帶的清晰度和數(shù)量，確定適合的引物退火溫度。另外發(fā)現(xiàn)，在30條引物可以擴增出具有多態(tài)性的條帶，綜合考慮條帶清晰度、數(shù)目、穩(wěn)定性等因素，9條引物及其最適退火溫度被篩選出來，分別是LTR 1-47(56 ℃)、LTR 1-10(57 ℃)、LTR 1-3(58 ℃)、LTR 1-1(59 ℃)、LTR 1-26(59 ℃)、LTR 1-2(60 ℃)、LTR 1-48(56 ℃)、LTR 1-60(57 ℃)、LTR 3-11(58 ℃)，其中8條來自于Ty 1-copia，占所有Ty 1-copia序列的17.4%；1條來自于Ty 3-gypsy，占Ty 3-gypsy序列的7.7%。

注：M為Marker D 2000;1為引物LTR1-26；2為LTR1-27；3為LTR1-29;A～H為59 ℃，58 ℃，57 ℃，56 ℃，55 ℃，54 ℃，53 ℃，52 ℃。

2.2 IRAP-PCR 反應體系的建立

優(yōu)化反應體系電泳結果顯示(圖2)，根據條帶亮度從優(yōu)到差的順序為第8、11、5、14、13、15、10、4、12、6泳道，而第1、2、3、7、9、16泳道等7個沒有擴增出條帶。有條帶的泳道中，第4、5、11泳道的條帶比較多且清晰，第8、12、13泳道盡管條帶多，但是過于模糊，第6、10、14、15泳道條帶較少。綜合來看，第4、5、11泳道較好。對于組合4，考慮到dNTP價格比較貴，而Taq酶0.5 U太少容易引起加樣過程中的誤差，還是采用組合11；組合5由于條帶主要集中在1 000 bp以上，在非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳中不太容易分辨而舍棄，因此最佳的PCR體系應該是2.0 mmol·L-1MgCl2、Taq酶1.0 U、引物0.2 mmol·L-1、模板DNA為20 ng、dNTP為0.3 mmol·L-1。

注：M為Marker D 2000，泳道1～16同表2處理1～16。

2.3 IRAP-PCR產物檢測技術體系

用篩選的引物LRT 1-3，在優(yōu)化的體系中對14種中國櫻桃進行PCR，對比2.0%的瓊脂糖凝膠以及不同濃度的非變性PAGE膠檢測結果(圖3)，瓊脂糖凝膠能檢測出8個位點，而5%、6%、8%、10% PAGE膠檢測出14、21、24、23個位點。說明聚丙烯酰氨凝膠電泳的分辨率高于瓊脂糖凝膠，瓊脂糖凝膠無法分辨一些大于1 000 bp的大片段和一些弱帶。5%的PAGE非變性膠由于濃度低，條帶清晰度及分辨率都最低，而且膠塊易碎，不容易操作。8%和10%能分辨的條帶數(shù)相近，考慮到成本，選擇8%的非變性膠進行IRAP-PCR的檢測。

注：A 表示2%瓊脂糖凝膠電泳，B、C、D表示5%、6%、8%、10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

表4 櫻桃IRAP引物條帶統(tǒng)計結果

2.4 IRAP引物評價

利用優(yōu)化體系，將篩選出的9條引物在14種中國櫻桃上擴增，獲得了222個位點，平均每條引物擴增出24.67個位點，其中多態(tài)性位點為200個，平均每條引物的多態(tài)性位點是22.22個，平均多態(tài)性比率是90.09%，條帶范圍在150～2 500 bp之間。引物LTR1-47總位點數(shù)、多態(tài)性位點數(shù)以及多態(tài)比例在所有引物中均最高。

3 討 論

近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，出現(xiàn)很多分子標記技術，不同標記技術之間各有優(yōu)劣。本研究根據中國櫻桃基因組LTR反轉錄轉座子Ty 1-copia和Ty 3-gypsy序列設計單向IRAP引物，篩選出多態(tài)性高、條帶多的引物并建立了櫻桃IRAP分子標記的體系，對貴州地方櫻桃進行遺傳多樣性評價。與其他在櫻桃上應用的分子標記相比，IRAP多態(tài)性(90.9%)高于ISSR(87.28%)[2]、RAPD(87%)[10]以及SRAP(84.6%)[11]；IRAP擴增每條引物擴增位點數(shù)(24.67)更是遠高于ISSR(10.9)[2]、SSR(7.67)[12]以及RAPD(5.0)[10]。逆轉錄轉座子有很多優(yōu)點，比如高通量、基因組覆蓋范圍廣、多態(tài)性豐富等，在櫻桃上使用較少的IRAP引物，就能獲得數(shù)量較多的多態(tài)性標記，省時省力。

IRAP標記建立在PCR技術基礎之上，因此dNTPs、引物、Mg2+、TaqDNA 聚合酶濃度和退火溫度等因素影響較大，對這些因素進行篩選和優(yōu)化很必要。比較與櫻桃親緣關系相近的果梅IRAP體系[13]，發(fā)現(xiàn)兩者間有所差異，原因在于不同的物種，其基因組DNA特性及試劑規(guī)格不同，最適PCR體系也不同。另外，IRAP 標記的擴增帶太多，瓊脂糖凝膠電泳靈敏度較低，檢測得到數(shù)量較少[14]，因此需要利用不同濃度PAGE凝膠對檢測技術進行優(yōu)化。與大多數(shù)研究結果一樣，瓊脂糖凝膠對條帶顯示數(shù)量和清晰度不如非變性PAGE凝膠。非變性PAGE凝膠濃度對檢測效果的影響也非常大，張秀華等[15]認為，非變性PAGE膠的濃度范圍為3.5%～20.0%；但是在低濃度膠電泳中，條帶較彌散，不利于基因型的判斷，本研究篩選出8%為最適合的濃度，與沈玉英等[13]在梅上，陶金等[16]在火龍果上的最佳濃度一致, 但是高于煙草(3%)[17]。說明應用IRAP分子標記對于不同種類植物進行研究時，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的類型和濃度存在差異。除了PAGE膠濃度之外，凝膠速度、均勻程度以及上樣量大小等因素也會影響到條帶的清晰和數(shù)量。凝膠制作時，每一步都要混勻，最好在低溫條件下進行，夏天凝結時間非常短。本研究取1.2μL PCR產物和0.2μL 6×loading buffer混合，效果比較好。

本研究建立的IRAP分子標記體系，在櫻桃遺傳多樣性、親緣關系鑒定以及遺傳變異檢測方面有廣闊的應用前景。尤其在檢測遺傳變異方面，IRAP具有高度的靈敏性，反轉錄轉座子的活動可能是芽變產生的原因之一[18]，利用IRAP標記檢測芽變，在很多物種上都有報道[19，20]。研究也證明反轉錄轉座子類分子標記對于體細胞變異鑒別更靈敏，如Bernet等[21]用RAPD、ISSR、IRAP 3種分子標記對檸檬品種進行鑒別，發(fā)現(xiàn)IRAP多態(tài)性比例分別是(36.4%)，高于RAPD(27.3%)和ISSR(0)。另外，IRAP還有物種間通用性，可以應用在薔薇科很多核果和仁果類果樹中。