知母種子質(zhì)量檢驗方法研究

時凱旋，趙凱旋，訾明茹，李 賀，馬春英

(河北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河北 保定 071000)

知母是我國傳統(tǒng)的常用藥材，為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根莖，具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效。用于外感風熱，肺熱燥咳，腸燥便秘等癥。知母主產(chǎn)于山西、河北、內(nèi)蒙古等地，其中河北易縣一帶是知母的道地產(chǎn)區(qū)，稱“西陵知母”。隨著知母藥材出口量和國內(nèi)市場需求量的不斷增加，野生知母的資源瀕危，人工栽培知母逐漸進入市場。目前，河北省是人工栽培知母的主要產(chǎn)區(qū)，據(jù)2017年統(tǒng)計數(shù)據(jù)，河北省知母的種植面積超過4 000 hm2。

中藥材質(zhì)量受多方面因素的影響，其中種子是中藥材生產(chǎn)的源頭，種子質(zhì)量的真?zhèn)蝺?yōu)劣直接影響藥材的產(chǎn)量與質(zhì)量。因此，開展中藥材種子質(zhì)量檢驗研究，是我國中藥材規(guī)范化生產(chǎn)急需解決的重要問題[1]。目前，關(guān)于藥用植物種子質(zhì)量標準研究常見報道[2,3]，其中，中藥材種子檢驗和質(zhì)量標準多是參照我國農(nóng)作物種子的檢驗和質(zhì)量標準，但是種子特性不同，適合的種子指標檢驗方法不同。以含水量測定為例，王書云等對金銀花種子含水量測定中發(fā)現(xiàn)，采用低溫[(105±2)℃]烘干3 h后無顯著變化[4]；楊敏等對肉蓯蓉種子含水量測定中發(fā)現(xiàn)，采用高溫[(130±2)℃]烘干12 h后無顯著變化[5]。由此可見，建立不同種子的質(zhì)量檢驗方法非常必要。

本實驗以藥用植物知母種子為材料，選擇千粒重、含水量、發(fā)芽率、生活力4個代表種子質(zhì)量的重要指標，展開對4個指標測定方法的探索和研究，旨在確定知母種子千粒重、含水量、發(fā)芽率和生活力的檢驗方法，以期為知母種子質(zhì)量檢驗規(guī)程的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

知母種子于2018年在安國藥博園隨機選2份果穗，帶回河北農(nóng)業(yè)大學實驗室脫粒，開展實驗。

1.2 儀器和試劑

BIC.250人工氣候箱，DHG-9240 A電熱恒溫鼓風干燥箱，電子天平，水浴鍋，培養(yǎng)皿，溫度計，燒杯，鑷子，刀片，發(fā)芽盤；蛭石，營養(yǎng)土，TTC粉末(批號：No.101100032)

1.3 方 法

1.3.1千粒重測定

按照農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程(GB/T 3543-1995)[6]中重量測定法執(zhí)行。本實驗分別采用百粒法、五百粒法及千粒法測定知母種子千粒重。具體方法如下：從供試樣品中隨機數(shù)取100，500，1 000粒凈種子，用電子天平稱重，并分別重復(fù)8次、3次和2次，記錄其重量。

1.3.2含水量測定

按照農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程(GB/T 3543-1995)[6]中水分測定法執(zhí)行。本實驗采用高溫烘干法：分別在(133±2)℃高溫條件下，設(shè)置1、2、3、4、5、6 h對種子含水量進行測定。每份處理重復(fù)4次，每次稱重(2.500±0.005)g。將種子于(133±2)℃下烘干，每隔1 h測定種子質(zhì)量并記錄。

種子含水量=[(烘干前供檢種子質(zhì)量-烘干后供檢種子質(zhì)量)/烘干前供檢種子質(zhì)量]×100%。

1.3.3知母種子生活力測定方法探究

按照種子常規(guī)檢驗方法TTC染色法[7]進行。本實驗采用3因素4水平正交試驗設(shè)計探索知母種子生活力測定條件，TTC染色時間設(shè)2、3、4、5 h，濃度設(shè)0.10%、0.20%、0.40%、0.50%，溫度設(shè)25、30、35、40 ℃。隨機數(shù)取1號種子，每個處理100粒，為了更準確的探究知母種子生活力測定條件，本實驗選取飽滿的知母種子。在30～35 ℃溫水中浸泡24 h后，用刀片將吸脹的種子沿種子胚中心線縱切成兩半，將其中的一半置于培養(yǎng)皿中，用TTC溶液染色并置于恒溫培養(yǎng)箱中；將另一半在沸水中煮5 min殺死胚，同樣方法進行染色處理，作為對照觀察。染色結(jié)束后，瀝去溶液，用清水沖洗，將種仁擺在培養(yǎng)皿中，逐一觀察知母種子染色情況，記錄并計算活種子的百分率。

種子生活力(%)=(染色種子個數(shù)/待測種子總數(shù))×100%。

種子著色的標準為胚完全著色，并呈現(xiàn)紅色為有生活力。胚著色淺，呈粉色的為生活力弱的種子,在本實驗中，將著色淺的和不著色的都歸為無生活力種子[7]。

1.3.4發(fā)芽率測定

按照農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程(GB/T 3543-1995)[6]進行發(fā)芽試驗。采用營養(yǎng)土和蛭石2∶1的比例為發(fā)芽床，設(shè)15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃ 4個處理，每個處理重復(fù)4次，每個重復(fù)50粒種子，放入人工氣候箱中培養(yǎng)，隨時補給水分，保持營養(yǎng)土濕潤。以胚軸伸出營養(yǎng)土2 mm為發(fā)芽標準，每天09：00時觀察知母種子發(fā)芽情況并記錄，計算知母種子發(fā)芽勢，觀察至第15天，統(tǒng)計知母種子發(fā)芽總數(shù)并計算發(fā)芽率。

發(fā)芽勢(%)=(發(fā)芽高峰期發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

1.3.5統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，得出知母種子質(zhì)量檢驗方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 知母種子千粒重分析

由表1可知，2份種子百粒法、五百粒法和千粒法的變異系數(shù)均未超過3.0%，千粒法測定變異系數(shù)最小，平均值為0.661%。經(jīng)統(tǒng)計分析，3種方法間差異性不顯著(p>0.05)，均可作為知母種子千粒重的測定方法。考慮到時間成本等因素，知母種子千粒重測定可以用百粒法。

表1 知母種子重量測定結(jié)果

2.2 知母種子含水量分析

知母種子在高溫(133±2)℃下烘干4～5 h后，含水量基本保持穩(wěn)定，且在5～6 h內(nèi)無顯著變化，綜合2份種子情況，高溫烘干法測定知母種子宜選擇在高溫(133±2)℃下烘干5 h(表2)。

表2 不同烘干時間知母種子含水量比較(n=4)

2.3 知母種子生活力分析

本實驗采用3因素4水平的正交試驗設(shè)計，利用TTC染色法對1號知母種子進行生活力測定。影響知母種子胚著色率因素的主次關(guān)系是：TTC濃度對知母種子胚著色率影響最大，時間影響次之，溫度影響最??；TTC濃度方差分析顯示：隨著TTC濃度升高，知母種子胚著色率呈先升后降的趨勢，TTC濃度為0.2%時，知母種子胚著色率最高，之后開始下降。極差分析結(jié)果顯示：知母種子生活力測定的適宜條件為TTC濃度0.2%，染色時間5 h，染色溫度35 ℃(表3)。

表3 四唑不同處理對知母種子生活力檢測(n=100)

2.4 知母種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢分析

在對知母種子進行發(fā)芽率實驗過程中，以胚軸伸出營養(yǎng)土2 mm時為初次計數(shù)時間。結(jié)果表明：15 ℃、20 ℃條件下知母種子在第10天開始發(fā)芽，發(fā)芽速度慢，發(fā)芽過程中未出現(xiàn)發(fā)芽高峰，所以沒有計算知母種子發(fā)芽勢；25 ℃、30 ℃條件下知母種子在第4天開始發(fā)芽，第7天發(fā)芽數(shù)最多，所以25 ℃、30 ℃條件下發(fā)芽勢依據(jù)第7天的種子發(fā)芽數(shù)計算；15 ℃、20 ℃、25 ℃和30 ℃條件下均在第15天種子萌發(fā)達到最高且以后再無種子萌發(fā)，所以第15天為末次計數(shù)時間。結(jié)果表明，15 ℃下2份種子幾乎都不發(fā)芽；20 ℃下2份種子發(fā)芽率均較低；15 ℃、20 ℃下知母種子發(fā)芽率與25 ℃、30 ℃下知母種子發(fā)芽率差異性顯著；25 ℃下種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢與30 ℃下差異性不顯著，考慮到30 ℃下種子發(fā)芽需水量大等實際情況，選擇25 ℃為知母種子的最適發(fā)芽溫度(表4)。

表4 不同發(fā)芽溫度下知母種子發(fā)芽情況比較(n=3)

3 討 論

種子檢驗是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上控制種子質(zhì)量的必須手段，通過檢驗可以確定種子在生產(chǎn)中的利用價值，種子是農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增效的根本因素，種子質(zhì)量好壞決定了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展水平，種子質(zhì)量監(jiān)控體系的建立和推行，是提高和保障種子質(zhì)量的重要舉措[8]。近年來，藥用植物需求量增加，野生藥用植物數(shù)量不能滿足需求，栽培藥用植物已經(jīng)納入藥材體系，在栽培藥用植物過程中，種子是源頭，種子質(zhì)量優(yōu)劣直接影響中藥材的質(zhì)量與產(chǎn)量，開展中藥材種子質(zhì)量檢驗研究十分必要。

衡量種子質(zhì)量的指標有很多，金銀花種子質(zhì)量標準制定中選用了真實性鑒定、凈度、含水量、千粒重、胚率、生活力和發(fā)芽率等指標[4]，連翹種子質(zhì)量標準制定中選用了凈度、千粒重、含水量、生活力和發(fā)芽率等指標[9]，黃芩種子質(zhì)量標準制定中選用了千粒重、形態(tài)大小、含水量、飽滿度、生活力和發(fā)芽率等指標[11]，這些種子質(zhì)量標準均參照《中國農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》，但綜合這些文獻，千粒重、含水量、發(fā)芽率和生活力是共有的指標，說明在制定藥用植物種子質(zhì)量標準中這4個指標比較重要，所以，本實驗以知母種子為實驗材料，對千粒重、含水量、生活力和發(fā)芽率4個指標的檢驗方法進行了探索，旨在確定知母種子質(zhì)量指標的檢驗方法，為開展藥用植物種子質(zhì)量研究提供依據(jù)。

《中國農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》規(guī)定種子含水量測定有高溫烘干法(133±2)℃和低溫烘干法(105±2)℃ 2種方法。李書敏等[9]對連翹種子含水量測定后確定采用高溫法烘干，劉鈺萍等[10]對紅花種子含水量測定后確定采用低溫法烘干8 h。邢丹等對知母種子含水量的2種烘干方法進行探究，結(jié)果表明：高溫下需烘干5 h，低溫下需烘干15 h，且二者差異不明顯[7]。考慮到低溫烘干法耗時長，本實驗知母種子含水量測定采用高溫烘干法(133±2)℃，烘干5 h后含水量無顯著變化，與邢丹等[7]的實驗結(jié)果一致。

葛人杰等對黃芩種子質(zhì)量的分級標準研究中發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地黃芩種子在千粒重、生活力和飽滿度等特性方面均有差異，且不同產(chǎn)地種植環(huán)境與氣候均不同，因此適宜不同產(chǎn)地黃芩種子的發(fā)芽溫度也不同[11]。藥用植物種子的發(fā)芽溫度是由種子的特性決定的，或者與藥用植物的起源地有關(guān)。因此，本實驗分別探究知母種子在15、20、25、30 ℃下的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，以期獲得知母種子在北方的適宜發(fā)芽溫度。實驗表明，25 ℃為最適發(fā)芽溫度。

植物種子生活力快速檢測時普遍采用TTC染色法，牧草種子生活力標準中采用濃度為0.5%TTC溶液[12]。邢丹等[7]和尤麗霞等[13]在對知母種子活力測定時同樣選用的是高濃度(0.5%)的TTC溶液。本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著TTC濃度的提高，知母種子活力表現(xiàn)出先升后降的趨勢，濃度為0.2%TTC種子生活力最大，這與李書敏等[9]的實驗結(jié)果一致。這可能與知母種子胚中脫氫酶有關(guān)，種子胚內(nèi)底物在脫氫酶的催化作用下將氫傳遞給TTC，TTC進一步轉(zhuǎn)化為紅色物質(zhì)，而且TTC溶液本身具有毒性，對酶活性與產(chǎn)物均有抑制，因此TTC溶液濃度過高或過低均會影響脫氫酶的轉(zhuǎn)化作用[14]。

通過本實驗，對藥用植物知母種子的質(zhì)量檢測指標千粒重、含水量、生活力和發(fā)芽率的測定建立了相應(yīng)的標準。千粒重測定用百粒法；含水量測定，采用高溫法(133±2)℃下烘干5 h；生活力測定TTC濃度0.2%，染色溫度35 ℃，染色時間5 h；發(fā)芽溫度為25 ℃。為知母種子或其他藥用植物種子質(zhì)量標準的制定提供了依據(jù)，為藥用植物的規(guī)范化種植提供了源頭上的標準。