液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法快速測定人血漿中加巴噴丁濃度

徐鳳華 孫曉鳴

南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇蘇州 215153

癲癇是一種慢性疾病，主要是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電導(dǎo)致短暫大腦功能障礙[1]?？拱d癇藥加巴噴丁（gabapentin，GBP）是γ-氨基丁酸（GABA）的類似物，結(jié)構(gòu)具有多晶型。加巴噴丁可以增加癲癇患者腦中GABA的水平，可抑制癲癇發(fā)作。與其他抗癲癇藥相比，加巴噴丁副作用較小，幾乎沒有藥物相互作用，能夠降低帶狀皰疹引起的疼痛[2-3]。加巴噴丁的藥動學(xué)特征存在個體差異，中毒癥狀與疾病癥狀不易區(qū)分[4]，因此監(jiān)測加巴噴丁血藥濃度對保證患者臨床用藥安全具有重要意義。血漿中加巴噴丁濃度的測定方法主要包括LC-UV法[5-6]、LC-FD[7-10]和LC-MS/MS[11-16]。本研究在文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上，建立簡便、快捷的LC-MS/MS法測定人血漿中加巴噴丁的濃度。血漿前處理為甲醇沉淀血漿蛋白，定量下限為20.00ng/mL，低于文獻(xiàn)報道[5-15]，為人血漿中加巴噴丁濃度檢測提供手段。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

液相質(zhì)譜聯(lián)用儀：三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（型號：API4000，美國AB Sciex公司）；高效液相色譜儀（型號1260，美國Agilent公司）；操作軟件工作站為Analyst（版本號為1.6）。天平：（型號XS 105DU，瑞士梅特勒-托利多METTLER TOLEDO公司）。

1.2 對照品與試劑

加巴噴丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100655-201302，含量：99.8%）；左乙拉西坦對照品（北京博時安泰科技發(fā)展有限公司，批號：20150401，含量：99.94%）；乙酸銨（AR級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。甲醇、乙腈和甲酸（HPLC級，TEDIA公司）；水（安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司）。

2 方法

2.1 色譜條件及質(zhì)譜參數(shù)

色譜條件：預(yù)柱選用Phenomenex公司Security GuardTMC18柱，規(guī) 格 為4.0mm×3.0mm；采 用WATERS公司Symmetry?系列C18色譜柱，規(guī)格為3.9×150.0mm，粒徑5μm；流動相：水相為5mmoL/L醋酸銨水溶液（含0.3%甲酸）；有機相選用乙腈，有機相∶水相=10∶90（v/v），流速為1000μL/min；每個樣品運行時間為6.0min，使用切換閥系統(tǒng)，A（排廢）和B（質(zhì)譜系統(tǒng)）兩個通道，樣品在0.0～2.0min進(jìn)入通道A，在2.0～6.0min進(jìn)入通道B；進(jìn)樣量設(shè)定為10μL；柱溫設(shè)定為30℃。

質(zhì)譜參數(shù)：選用APCI大氣壓力化學(xué)電離源，監(jiān)測模式：正離子電離模式，采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測；巴噴丁母離子m/z為172.1，子離子m/z為154.1；內(nèi)標(biāo)左乙拉西坦母離子m/z為171.1，子離子m/z為126.1，去簇電壓（declustering potential，DP）參數(shù)分別為30V和45V，碰撞能（collision energy，CE）參數(shù)均為22V，掃描時間為200ms。離子源參數(shù)：溫度（TEM）為400℃，霧化氣（N2）為50psi；放電電流為2μA。

2.2 工作液配制

加巴噴丁標(biāo)準(zhǔn)曲線系列貯備液及工作液：使用10mL容量瓶，稱量加巴噴丁對照品10.02mg（含量折算后為10.00mg加巴噴?。?，用有機溶劑甲醇溶解、稀釋并定容，混勻后，溶液為1.000mg/mL的加巴噴丁標(biāo)準(zhǔn)曲線系列貯備液，用有機溶劑甲醇逐步稀釋，配制加巴噴丁標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液，加巴噴丁濃度依次為0.4000、1.000、2.000、6.000、20.00、40.00、80.00和160.0μg/mL。

加巴噴丁質(zhì)控系列貯備液和工作液：使用10mL容量瓶，稱量加巴噴丁對照品10.02mg（含量折算后為10.00mg加巴噴?。糜袡C溶劑甲醇溶解、稀釋并定容，混勻后，溶液為1.000mg/mL的加巴噴丁質(zhì)控貯備液，用甲醇逐步稀釋，配制質(zhì)控系列工作液，濃度依次為0.8000、12.00、120μg/mL。同時用甲醇稀釋加巴噴丁定量下限工作液，濃度為0.4000μg/mL。

內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）貯備液和工作液：使用10mL容量瓶，稱取10.01mg左乙拉西坦對照品（含量折算后為10.00mg左乙拉西坦），用有機溶劑甲醇溶解、稀釋并定容，混勻后，溶液為1.000mg/mL的內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）貯備液。以內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）貯備液為源溶液，用有機溶劑甲醇作為稀釋溶液，配制12.00μg/mL的內(nèi)標(biāo)左乙拉西坦工作液。

2.3 血樣樣品前處理

于1.5mL規(guī)格離心管中，定量吸取200μL血漿樣品，加入加巴噴丁標(biāo)準(zhǔn)曲線系列或質(zhì)控系列工作液10μL和50μL內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）工作液，加入600μL有機溶劑甲醇，用于沉淀血漿種蛋白，渦旋混勻約1min，置于低溫高速離心機種，23755×g離心10min（設(shè)置溫度為4℃）。離心后，定量吸取200μL上清液置進(jìn)樣瓶中，加入水相800μL，渦旋混勻后，置于高效液相色譜儀自動進(jìn)樣器模塊（控溫，設(shè)置溫度為10℃）中，液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)樣測定加巴噴丁濃度。

3 結(jié)果

3.1 特異性實驗

分別取加巴噴丁對照品溶液樣品、內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）對照品溶液樣品、空白血漿按“2.3 血樣樣品前處理”方法處理后的樣品；空白血漿200μL和加巴噴丁對照品溶液（6.000μg/mL）10μL混勻后按“2.3 血樣樣品前處理”項方法操作后的樣品；分別進(jìn)樣測定。結(jié)果如下：加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）的色譜保留時間分別約為2.50min和3.21min左右，血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）色譜峰，不影響加巴噴丁濃度的測定，見圖1。

圖1 血漿中加巴噴丁的LC-MS/MS圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低定量限

定量吸取空白血漿200μL，依次分別加入加巴噴丁標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液10μL，制備加巴噴丁血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線系列樣品，各血漿樣品中加巴噴丁濃度分別為20.00、50.00、100.0、300.0、1000、2000、4000、8000ng/mL，按“2.3”項方法操作，進(jìn)樣測定，橫坐標(biāo)為加巴噴丁濃度c，縱坐標(biāo)為血漿中待測物加巴噴丁峰面積As與內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）峰面積Ai比值f，進(jìn)行線性回歸（權(quán)重系數(shù)為1/C2）。結(jié)果顯示：血漿中加巴噴丁在濃度20.00～8000ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系較好，最低定量限LLOQ為20.00ng/mL。

3.3 精密度和準(zhǔn)確度

定量吸取200μL空白血漿，分別加入加巴噴丁3種不同濃度的質(zhì)控系列工作液10μL，工作液濃度依次為0.4000、0.8000、12.00、120.0μg/mL，制備血漿質(zhì)控系列樣品，加巴噴丁濃度分別為20.00、40.00、600.0、6000ng/mL，每個濃度制備6個樣品，按“2.3”項方法操作，測定3批，每個分析批需要隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算濃度，同時統(tǒng)計批內(nèi)、批間精密度和相對偏差（進(jìn)行單因素方差分析），結(jié)果如下：低、中、高3種濃度血漿質(zhì)控樣品實測值與理論值偏差（RE）均在±15%范圍內(nèi)，批間和批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，relative standard deviation）均小于15%。最低定量限（LLOQ）批內(nèi)和批間RSD均小于20%，實測值與理論值偏差（RE）均在±20%范圍內(nèi)。

3.4 提取回收率

配制血漿樣品，含加巴噴丁濃度依次為40.00、600.0、6000ng/mL，配制方法同“3.3 精密度和準(zhǔn)確度”項，同一種濃度6個樣品，按“2.3”項方法處理，進(jìn)樣檢測得到加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)左乙拉西坦峰面積。同時，配制空白血漿樣品，使用有機溶劑甲醇沉淀蛋白后，直接加入低、中、高3種濃度加巴噴丁質(zhì)控系列工作液10μL及50μL內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）工作液，混勻，吸取200μL與水相800μL混勻后，測定得到加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)左乙拉西坦峰面積。計算以上兩種處理方式得到的加巴噴丁峰面積比值和內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）峰面積峰面積比值。分別計算血漿中不同濃度加巴噴丁的提取回收率和內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）的提取回收率。結(jié)果顯示：血漿中加巴噴丁低、中、高三個濃度的提取回收率分別為（102.3±4.4）%（n=6）、（97.5±2.6）%（n=6）和（99.7±2.0）%（n=6）；內(nèi)標(biāo)左乙拉西坦的提取回收率為（98.7±3.0）%（n=18）。

3.5 基質(zhì)效應(yīng)

血漿樣品基質(zhì)：選擇來源不同的6個空白血漿樣品，各定量吸取200μL至離心管（規(guī)格1.5mL）中，加入有機溶劑甲醇600μL，渦旋1min，4℃下，23755×g離心10min，取上清液作為血漿基質(zhì)，體積為700μL。

對照樣品基質(zhì)：定量吸取200μL純化水至離心管（規(guī)格1.5mL）中，操作方法與制備血漿樣品基質(zhì)相同，得到對照樣品基質(zhì)。

分別定量吸取700μL血漿樣品基質(zhì)或?qū)φ諛悠坊|(zhì)，加入10μL加巴噴丁質(zhì)控系列工作液和50μL內(nèi)標(biāo)左乙拉西坦工作液，混勻。定量吸取上述溶液200μL與800μL水相混勻。上述同一濃度樣品平行制備和處理6份（低、中、高3個濃度），并按“2.1 色譜條件及質(zhì)譜參數(shù)”項測定，獲加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）峰面積。計算同一濃度樣品，兩種基質(zhì)（血漿樣品基質(zhì)或?qū)φ諛悠坊|(zhì)）中的峰面積比值。根據(jù)比值，計算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示：血漿中加巴噴丁低、中、高三個濃度的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果分別為（103.5±4.1）%（n=6）、（97.4±3.6）%（n=6）和（96.7±2.7）%（n=6）；內(nèi)標(biāo)左乙拉西坦的基質(zhì)效應(yīng)為（96.9±4.8）%（n=18）。

3.6 穩(wěn)定性實驗

本研究考察了不同保存條件下，加巴噴丁血漿和貯備液樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果如下：加巴噴丁血漿樣品置于室溫（25℃左右）放置6h、置于-30℃冰箱放置40d和-30℃反復(fù)凍融（取出融化，再放回-30℃冰箱）3種情況下，血漿樣品中加巴噴丁濃度未發(fā)生顯著變化，即加巴噴丁血漿樣品仍穩(wěn)定。待測樣品置于高效液相色譜儀自動進(jìn)樣器模塊中48h（控溫，設(shè)置溫度為10℃），加巴噴丁血漿樣品經(jīng)蛋白沉淀離心后，上清液置于室溫（25℃左右）放置36h，加巴噴丁血漿次級樣品仍穩(wěn)定。加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）貯備液置于室溫（25℃左右）下放置12h和置于冷藏（2～8℃）中保存40d情況下，加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)（左乙拉西坦）貯備液均穩(wěn)定。

4 討論

本研究優(yōu)化了色譜和質(zhì)譜參數(shù)，熊志立等[14]使用0.2%甲酸水溶液作為水相，流動相為甲醇∶0.2%甲酸水溶液（80∶20，v/v），本研究方法建立階段，借鑒使用此流動相色譜條件，實驗結(jié)果加巴噴丁色譜峰拖尾，這與文獻(xiàn)[11]中提供的圖譜相符。醋酸銨有利于改善加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)左乙拉西坦峰形，相關(guān)文獻(xiàn)[10，12]亦在流動相中加入了銨鹽。液質(zhì)聯(lián)用儀常用的電離源為電噴霧離子源（ESI），本研究使用大氣壓力化學(xué)離子源（APCI）。方法建立階段，本研究比較了使用APCI和ESI兩種離子源的各自加巴噴丁離子強度，結(jié)果顯示：用APCI離子源，加巴噴丁離子強度較大，本研究測定方法定量下限為20.00ng/mL，低于文獻(xiàn)報道[5-15]。

本研究采用甲醇沉淀血漿中蛋白，沉淀離心后，定量吸取200μL上清液與800μL水相混勻，提高進(jìn)樣分析樣品中水相的比例接近流動相中水的比例，防止二次化學(xué)平衡現(xiàn)象發(fā)生，可以使加巴噴丁色譜峰形減少拖尾。許萌等[16]在離心步驟后取上清液，經(jīng)濾膜濾過后直接進(jìn)樣，本研究取上清液200μL，并加入到水相800μL中，混勻后進(jìn)樣，樣品中血漿生物基質(zhì)減少，可以降低基質(zhì)效應(yīng)和減少液質(zhì)聯(lián)用儀、色譜柱被污染的可能。

該液質(zhì)聯(lián)用方法測定血漿中加巴噴丁濃度，每個樣品運行時間短，特異性高，甲醇直接沉淀蛋白，操作快捷，發(fā)揮了LC-MS/MS法的快速定量優(yōu)勢，可以滿足大批量血漿樣品檢測的需要。