基于線粒體ND2 基因的龍頭魚群體遺傳多樣性分析

蔣艷琳，孟 瑋，朱文斌，楊天燕

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

龍頭魚Harpodon nehereus，俗稱蝦潺、狗母魚、豆腐魚等，屬燈籠魚目Myctophiformes，龍頭魚科Harpodontidae，龍頭魚屬Harpodon，為近岸暖水性小型經(jīng)濟(jì)魚類，主要棲息于大陸架水域下層，廣泛分布于西太平洋及印度洋海域，主要包括日本、韓國及中國沿海海域[1]，我國尤以浙江舟山及樂清一帶分布較廣且產(chǎn)量較高，主要生產(chǎn)季節(jié)龍頭魚漁獲物所占比例高達(dá)70%以上[2]。20 世紀(jì)70 年代以來，隨著帶魚、大黃魚、烏賊等主要漁業(yè)資源的衰退，龍頭魚等次要的經(jīng)濟(jì)種類數(shù)量逐漸增加，并以其獨(dú)特的商業(yè)價(jià)值與營養(yǎng)價(jià)值逐漸被人們挖掘與喜愛[3]。目前國內(nèi)外關(guān)于龍頭魚的研究多集中在外部形態(tài)特征[4]、漁業(yè)生物學(xué)特性[5-7]、資源數(shù)量分布[8-10]、攝食習(xí)性[11]和食品加工[12-15]等方面，而遺傳背景相關(guān)研究報(bào)道較少，僅見線粒體基因組全序列[16]和分子標(biāo)記技術(shù)開發(fā)應(yīng)用[17-20]。NADH 脫氫酶第二亞基（NADH dehydrogenase subunit 2，ND2）是線粒體電子傳遞復(fù)合體的重要組分，也是線粒體上13 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因之一[21]，因具有進(jìn)化速率適中且包含豐富的遺傳信息等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛運(yùn)用于魚類遺傳關(guān)系和系統(tǒng)分類地位的研究[21-24]，顯示出其良好的分子標(biāo)記特性。了解和掌握漁業(yè)種群結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律，是開展資源開發(fā)管理的基礎(chǔ)和前提，而遺傳結(jié)構(gòu)則是種群結(jié)構(gòu)的內(nèi)在體現(xiàn)，綜合反映了種群大小組成、繁育系統(tǒng)、隔離程度及遷移格局的時(shí)空[25]。本研究以線粒體ND2 基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，對(duì)我國5 個(gè)地理種群的龍頭魚遺傳結(jié)構(gòu)和變異進(jìn)行了比較分析，了解群體之間的遺傳分化和種群歷史動(dòng)態(tài)，旨在揭示我國近海龍頭魚種質(zhì)資源現(xiàn)狀，為保護(hù)并合理開發(fā)利用龍頭魚資源提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

98 尾實(shí)驗(yàn)樣本分別于2018年7 月-2019 年4 月間采自于我國沿海5 個(gè)地點(diǎn)，分別為?？冢℉K，18 尾）、南通（NT，22 尾）、青島（QD，23 尾）、泉州（QZ，14 尾）和湛江（ZJ，21 尾）。采樣地點(diǎn)詳見圖1。剪取適量背部新鮮肌肉組織浸泡于無水乙醇中，置于4 °C 冰箱保存。

1.2 基因組DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

采用傳統(tǒng)的Tris 酚-氯仿法[26]進(jìn)行基因組DNA 的提取，充分洗滌后將自然晾干的DNA 溶解于100 μL 滅菌水中，置于-20 °C 冰箱中保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)Genbank 數(shù)據(jù)庫中龍頭魚線粒體基因組全序列（Genbank 登錄號(hào)：JX534239），為保證PCR 擴(kuò)增和拼接序列的準(zhǔn)確性，采用Primer premier 軟件[27]設(shè)計(jì)擴(kuò)增2 對(duì)ND2 基因的引物，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成，具體引物序列信息如表1 所示。

圖1 龍頭魚采樣圖Fig.1 The sampling locations of H.nehereus

表1 擴(kuò)增ND2 基因引物信息Tab.1 The information of ND2 primers in this study

PCR 反應(yīng)體系為25 μL，其中包括2.5 μL 10×Buffer，2 μL dNTP，0.25 μL Taq 酶，上下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，最后加入17.25 μL 滅菌的超純水補(bǔ)足至終體積25 μL。PCR 擴(kuò)增在Bio-Rad C1000M Thermal Cycler 儀器上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為：95 °C 預(yù)變性5 min，然后95 °C 變性30 s，50 °C （52 °C）退火30 s，72 °C 延伸75 s，共35 個(gè)循環(huán)，最后72 °C 延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其大小和純度。凝膠呈像系統(tǒng)拍照后，挑選條帶亮度較高的PCR 產(chǎn)物送至上海美吉生物有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用DNAstar[28]軟件包對(duì)序列進(jìn)行編輯、排序和校對(duì)，得到所有龍頭魚樣品的線粒體ND2 基因全序列。利用DnaSP 6.0[29]軟件和Arlequin 3.5[30]確定單倍型數(shù)目（number of haplotype）并計(jì)算單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，Pi）、平均核苷酸差異數(shù)（average number of nucleotide differences，K）。利用Mega 5.0[31]軟件計(jì)算堿基轉(zhuǎn)換數(shù) （number of transition，Ts） 和堿基顛換數(shù)（number of transversion，Tv），并統(tǒng)計(jì)堿基組成、變異位點(diǎn)數(shù)（variable site）、簡約信息位點(diǎn)數(shù)（parimony informative sites）和群體間遺傳距離。采用鄰接法（neighbor-joining，NJ），以Kimura 雙參數(shù)模型（kimura-2-parameter，K2P）為基礎(chǔ)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時(shí)利用單倍型最小跨度樹來分析單倍型間的遺傳關(guān)系[32]，為保證系統(tǒng)樹的可靠性，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行1 000 次自舉檢測(cè)（bootstrap analysis，BP）。

利用Arleqwin 3.5 軟件進(jìn)行Tajima's D 和Fu's Fs 中性檢驗(yàn)，并且通過分子方差分析（analysis of Molecular Variance，AMOVA）對(duì)遺傳變異的分布模式進(jìn)行分析，計(jì)算群體內(nèi)和群體間遺傳分化指數(shù)。利用所得數(shù)據(jù)進(jìn)行種群動(dòng)態(tài)研究，分析龍頭魚群體是否經(jīng)歷過種群擴(kuò)張，若經(jīng)歷過種群擴(kuò)張，運(yùn)用公式τ=2 ut來計(jì)算龍頭魚種群擴(kuò)張時(shí)間[33]。其中τ 代表擴(kuò)張時(shí)間參數(shù)（Tau），u 代表進(jìn)化速率，t 代表自擴(kuò)張以來所經(jīng)歷的代數(shù)，擴(kuò)張時(shí)間T=t×代時(shí)；u=μ k，其中μ 代表單位堿基的變異速率，k 代表所分析序列的長度。

2 結(jié)果與分析

圖2 龍頭魚ND2 基因密碼子第3 位點(diǎn)堿基組成（%）Fig.2 Nucleotide composition of the 3rd codon in ND2 gene of H.nehereus（%）

2.1 序列特征分析

對(duì)5 個(gè)群體共98 尾龍頭魚線粒體ND2 基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，共獲得有效長度為1 046 bp 的龍頭魚ND2 基因序列，未發(fā)現(xiàn)堿基的插入與缺失。全部位點(diǎn)中，變異位點(diǎn)（variable sites）19 個(gè)，單一可變位點(diǎn)（singleton variable sites）18 個(gè)，簡約信息位點(diǎn)（parsimony informative sites）1 個(gè)。18 個(gè)堿基發(fā)生了轉(zhuǎn)換，主要發(fā)生在A-G 之間；2 處堿基發(fā)生顛換，均為A-T；轉(zhuǎn)換數(shù)高于顛換數(shù)，與線粒體基因組DNA 進(jìn)化過程中轉(zhuǎn)換頻率高于顛換的規(guī)律一致[34]。4 種堿基平均含量分別為：T 29.2%、C 34.9%、A 24.4%、G 11.6%。其中G 堿基的含量偏低，表現(xiàn)出明顯的反G 偏倚。A+T 的含量為53.6%，略高于G+C 的含量，與大多數(shù)脊椎動(dòng)物線粒體DNA 堿基G+C 含量位于37%～50%之間的情況一致[35]。從密碼子堿基組成情況來看，不同群體間也存在較大差異，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的偏倚性。第1 密碼子中，C、A 堿基使用頻率較T、G 高；第2 密碼子中，堿基的使用明顯偏向T 和C；第3 密碼子中C 堿基含量最高，而G 堿基含量顯著偏低（圖2）。

98 尾個(gè)體共定義了19 種單倍型，各單倍型分布情況如表2 所示。其中Hap1 出現(xiàn)頻率最高，其次為Hap3，由?？?、青島和湛江3 個(gè)群體共享，其余每種單倍型均為一個(gè)群體所獨(dú)有。5 個(gè)地理群體中，單倍型類型最多的為湛江群體（8 種），最少的是泉州群體，僅有2 種單倍型（Hap1 和Hap13）。

表2 單倍型在不同群體中的分布Tab.2 The distribution of haplotypes in different populations

2.2 遺傳多樣性與分化研究

單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）是評(píng)價(jià)種群遺傳多樣性的兩個(gè)重要依據(jù)[36]。本研究中，5 個(gè)群體龍頭魚遺傳多樣性如表3 所示，總體單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）分別為0.367 6±0.063 8 和0.000 427±0.000 424。從總體上來看，不同群體間遺傳多樣性呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，由高到低依次為湛江＞青島＞南通＞?？冢救?，其中湛江群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性均最高，分別為0.566 7±0.128 8 和0.000 723±0.000 618，泉州群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性均最低，分別為0.142 9±0.118 8 和0.000 138±0.000 236。

表3 龍頭魚5 個(gè)地理群體ND2 基因序列遺傳多樣性指數(shù)Tab.3 Genetic diversity index on ND2 gene for 5 geographical populations of H.nehereus

遺傳分化指數(shù)FST值是反映各群體間遺傳分化程度高低的重要指標(biāo)，能夠衡量群體中是否存在隨機(jī)交配，進(jìn)一步揭示群體間的遺傳分化情況。Wright 認(rèn)為：當(dāng)0＜FST＜0.05，表明群體間不存在遺傳分化；當(dāng)0.05＜FST＜0.15，表明群體間存在低度的遺傳分化；當(dāng)0.15＜FST＜0.25，表明群體間存在中度遺傳分化；當(dāng)FST＞0.25 時(shí)，表明群體間存在高度遺傳分化[37]。利用DnaSP 軟件計(jì)算5 個(gè)地理群體龍頭魚遺傳分化值數(shù)FST值及對(duì)應(yīng)的P 值詳見表4。由表中結(jié)果可知，群體間遺傳分化系數(shù)FST值介于-0.014 46～0.009 29 之間，F(xiàn)ST值均小于0.05，且兩兩群體間P 值不顯著，表明龍頭魚群體之間不存在顯著遺傳分化，可能與群體之間存在一定的基因交流，群體間進(jìn)行隨機(jī)交配有關(guān)。

表4 龍頭魚群體間的FST 值（對(duì)角線下方）和P 值（對(duì)角線上方）Tab.4 Pairwise FST（below diagonal）and associated P（above diagonal）values among populations of H.nehereus

為了解龍頭魚遺傳變異的地理分布模式，采用Arlequin 軟件對(duì)龍頭魚群體進(jìn)行了AMOVA 分析（表5）。結(jié)果顯示種群內(nèi)變異占99.68%，而種群間變異僅為0.32%，表明遺傳變異主要來自于種群內(nèi)，群體之間遺傳分化不明顯。

表5 龍頭魚不同種群遺傳變異的分子變異分析Tab.5 AMOVA analysis of ND2 sequences in different populations of H.nehereus

2.3 遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系探討

物種的進(jìn)化能力及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性不但取決于種群內(nèi)遺傳變異，而且依賴于種群結(jié)構(gòu)[38]。利用Mega軟件計(jì)算不同群體間K2P 平均遺傳距離見表6。由表可知，5 個(gè)地理群體的龍頭魚遺傳距離介于0.000 228～0.000 607 之間，結(jié)果表明?？?、南通、青島、泉州及湛江群體間的遺傳距離均較小，遺傳分化均不明顯，不同地理群體的龍頭魚尚未達(dá)到種的分化。

表6 龍頭魚5 個(gè)地理群體間遺傳距離Tab.6 Genetic distances among five H.nehereus populations

從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載近緣物種狗母魚科Synodontidae、狗母魚屬Synodus 的雜斑狗母魚Synodus variegatus（GenBank 登錄號(hào)：AY524977）和蛇鯔屬Saurida 的鱷蛇鯔Saurida wanieso（GenBank 登錄號(hào)：KP027408）作為外群，基于Kimura 雙參數(shù)模型（kimura 2-parameter），利用NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過100 0 次Bootstrap 統(tǒng)計(jì)分析，比較分支之間的支持率，支持率數(shù)值越高，則表明該分支的支持率也越高[39]。結(jié)果顯示龍頭魚19 個(gè)單倍型在系統(tǒng)樹上聚成一支，未形成明顯的地理分化（圖3）。

2.4 種群歷史動(dòng)態(tài)分析

種群動(dòng)態(tài)反映種群數(shù)量在時(shí)間和空間上的變化，把握種群動(dòng)態(tài)的規(guī)律有利于種群種質(zhì)資源的合理利用與有效保護(hù)，制定切實(shí)可行的捕撈計(jì)劃。本研究采用Tajima's D 與Fu's Fs 檢驗(yàn)，預(yù)測(cè)歷史上種群是否發(fā)生擴(kuò)張并進(jìn)一步估算種群擴(kuò)張時(shí)間。Tajima's D 值與Fu's Fs 值若為負(fù)值且達(dá)到顯著性水平（即P＜0.05），則表明該種群可能經(jīng)歷過群體擴(kuò)張[40]。中性檢驗(yàn)結(jié)果表明，5 個(gè)群體的Tajima's D 值和Fu's Fs 均為負(fù)值，且除泉州群體外，其余4 個(gè)群體P 值均顯著（P＜0.05），推測(cè)歷史上海口、南通、青島和湛江群體龍頭魚曾經(jīng)歷過種群擴(kuò)張（表7）。參考ND2 基因2.5%～3.6%每百萬年的變異速率[23，41]，龍頭魚通常1 齡達(dá)到性成熟[1]，代時(shí)取1，則擴(kuò)張時(shí)間T=t，據(jù)此估算出龍頭魚發(fā)生種群擴(kuò)張的時(shí)間約在（1.87～1.30）萬年前的第四紀(jì)更新世晚期。

圖3 基于線粒體ND2 基因序列構(gòu)建的單倍型鄰接樹Fig.3 NJ tree of haplotypes based on mtDNA ND2 sequences

表7 5 個(gè)地理群體龍頭魚中性檢測(cè)結(jié)果Tab.7 Tajima's D and Fu' Fs values among 5 populations of H.nehereus

3 討論

遺傳多樣性是衡量物種適應(yīng)環(huán)境能力的關(guān)鍵指標(biāo)，在生物進(jìn)化過程中起到內(nèi)在動(dòng)力的作用，是物種生存與進(jìn)化的潛在遺傳基礎(chǔ)。遺傳多樣性程度越豐富，物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，生存與進(jìn)化能力也越強(qiáng)。反之，遺傳多樣性越貧乏，表明物種對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)、生存及進(jìn)化能力都會(huì)降低，甚至?xí){到物種的生存[42]。與其他海洋魚類相比，本研究中龍頭魚呈現(xiàn)出低單倍型多樣度、低核苷酸多樣度的格局，與郭易佳等[20]采用線粒體Cyt b 基因分析我國近海龍頭魚種群遺傳結(jié)構(gòu)獲得的結(jié)果一致，表明該魚類遺傳多樣性整體處于較低水平。此外，龍頭魚的遺傳多樣性（0.367 6±0.063 8）與核苷酸多樣性（0.000 427±0.000 424）相較于香魚Plecoglossus altivelis （0.708±0.041，0.002 42±0.000 33）[43]和少鱗鱚Sillago japonica （0.945 3±0.015 5，0.009 718±0.005 445）[44]都偏低，一定程度上也反映出龍頭魚較低的遺傳多樣性。

龍頭魚兩兩群體間平均遺傳距離較?。?.000 228～0.000 607），AMOVA 分析結(jié)果也顯示遺傳變異主要來自于種群內(nèi)個(gè)體間，表明龍頭魚不同地理群體間親緣關(guān)系較近，NJ 聚類樹也未形成明顯的分支，推測(cè)我國沿海龍頭魚可能來自于相同的祖先。從龍頭魚遺傳分化情況來看，兩兩群體間遺傳分化系數(shù)均為負(fù)值，推測(cè)可能是漂浮性魚卵和仔魚期易受到洋流等因素影響，群體間產(chǎn)生較為頻繁的基因交流引起同質(zhì)化現(xiàn)象，導(dǎo)致遺傳分化不顯著。

采用Tajima's D 和Fu's Fs 中性檢驗(yàn)對(duì)ND2 序列進(jìn)行種群擴(kuò)張事件檢測(cè)，結(jié)果表明除泉州群體外，其余4 個(gè)群體的Tajima's D 值和Fu's Fs 值均為負(fù)且P 值小于0.05，歷史上這些海域的龍頭魚可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張事件，估算擴(kuò)張時(shí)間在（1.87～1.30）萬年前的第四紀(jì)更新世晚期。推測(cè)擴(kuò)張事件與這一時(shí)期冰期與間冰期循環(huán)出現(xiàn)，海洋地理環(huán)境發(fā)生變化，從而引起的地理隔離、種群基因交流受到阻礙有關(guān)，使得龍頭魚種群出現(xiàn)了分化與擴(kuò)張[45]。

臺(tái)灣海峽作為我國重要的海上交通要道，被稱為海上交通的“咽喉”，頻繁的海上航運(yùn)與交通運(yùn)輸，對(duì)位于臺(tái)灣海峽西岸的泉州沿岸龍頭魚群體的生存棲息環(huán)境產(chǎn)生一定影響。此外，臺(tái)灣海峽海底蘊(yùn)藏著豐富的石油資源，泉州周邊石油開采和化工企業(yè)的生產(chǎn)運(yùn)營也給當(dāng)?shù)睾Ｓ蛟斐闪穗y以避免的危害，上述原因或許與泉州群體龍頭魚遺傳多樣性水平偏低有一定關(guān)系。作為我國近海重要的小型經(jīng)濟(jì)魚類，為實(shí)現(xiàn)龍頭魚種質(zhì)資源的保護(hù)與管理，需要根據(jù)實(shí)際情況制定切實(shí)可行的保護(hù)方案。首先，從棲息環(huán)境方面考慮。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)棲息地環(huán)境保護(hù)，規(guī)范海上作業(yè)方式，減少海洋環(huán)境污染，維持生態(tài)平衡，避免種質(zhì)資源遭受更大的危害[46]。其次，面對(duì)日益增加的捕撈壓力，可以從捕撈方式手段來考慮。實(shí)行捕撈許可證，限制捕撈工具的使用規(guī)格，采用合適的捕撈方式；實(shí)行休漁期、禁漁期，禁止產(chǎn)卵期捕撈作業(yè)，加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)卵場(chǎng)的保護(hù)[41]。另外，也有必要強(qiáng)化人們的法律意識(shí)，開展普法宣傳教育，加強(qiáng)漁業(yè)立法及漁業(yè)管理，加大執(zhí)法力度，實(shí)現(xiàn)漁業(yè)生產(chǎn)的高效管理[22]。