小黑楊MYB122基因生物信息學(xué)及表達(dá)1)

呂冠斌 趙凱 劉悅 姜廷波 周博如

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

植物生長(zhǎng)在自然環(huán)境中經(jīng)常受到干旱和鹽等逆境脅迫[1]。植物在生長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)化出復(fù)雜的防御機(jī)制以更好地適應(yīng)極端的外界環(huán)境。植物受到干旱和鹽脅迫，一些基因就會(huì)產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，以降低脅迫造成的傷害[2]。這些脅迫應(yīng)答基因包括AP2/ERF、MYB、NAC、WRKY、bZIP和bHLH，研究證明其在植物應(yīng)答脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。MYB家族是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，包括大約200個(gè)具有高度保守的DNA結(jié)合域的基因。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)具有極其廣泛的生物學(xué)功能，主要體現(xiàn)在參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育[3]、次生代謝產(chǎn)物的合成、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、對(duì)逆境產(chǎn)生應(yīng)答[4]以及參與葉片等器官形態(tài)建成等。許多研究表明，植物在逆境脅迫下有許多MYB基因參與應(yīng)答反應(yīng)[5]。在鹽脅迫中，Jung et al.[6]發(fā)現(xiàn)擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtMYB44的過(guò)表達(dá)植株比野生型和其敲除系具有明顯的耐旱和耐鹽性。低溫脅迫下，Agarwal et al.[7]發(fā)現(xiàn)擬南芥MYB15過(guò)表達(dá)植株的耐低溫能力減弱，說(shuō)明MYB15對(duì)植物的耐低溫能力呈負(fù)調(diào)控，并且植物中大部分R2R3-MYB蛋白能夠影響轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力[8]。小黑楊(Populusimonii×P.nigra)抗寒、抗旱、速生等優(yōu)良特征可提高中國(guó)北方沙荒干旱地區(qū)綠化水平，培育小黑楊抗逆轉(zhuǎn)基因植物，提高栽培植物的抗逆性[9]，可以使一些自然條件較差的土地適于種植，進(jìn)而可以擴(kuò)大栽培的面積。

1 材料與方法

1.1 植物材料

培養(yǎng)1個(gè)月的小黑楊組培苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建pMD19-T-PsnMYB122載體

利用天恩澤柱式植物RNAout試劑盒(北京天恩澤科技有限公司)提取野生型小黑楊RNA，并用PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，Dalian，China)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA；在楊樹(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)中找出MYB122基因序列，根據(jù)查找的基因序列設(shè)計(jì)引物MYB122-F，5′-CTAAGGCACAAGCAGATAGC-3′；MYB122-R，5′-CGTTAGCATTGGAGGTCAAGAGC-3′，以小黑楊的cDNA為模板，MYB122-F和MYB122-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的條帶；然后利用膠回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收，將膠回收產(chǎn)物連接于pMD19-T Vector(試劑盒購(gòu)于大連寶生物公司)載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)并送測(cè)序，將測(cè)序正確的陽(yáng)性菌液中1∶1加入體積分?jǐn)?shù)50%的甘油，于冰箱中-80 ℃保存。

1.2.2PsnMYB122基因的生物信息學(xué)

利用在線軟件Bioxm查找MYB122的開(kāi)放閱讀框(ORF)[10]；利用ExPASy(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/)中Protparam程序分析氨基酸的理化性質(zhì)[11]；使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線軟件對(duì)氨基酸進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)[12]；利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp)查找MYB122氨基酸序列同源性高的不同物種，利用BioEdit軟件Clustal W程序進(jìn)行多序列比對(duì)[13]，并利用MEGA(Version 5.2)Neighbor-Joining Tree進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建[14]。

1.2.3 構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體

根據(jù)測(cè)序成功的MYB122的ORF序列，設(shè)計(jì)單酶切引物MYB122-GFP-F，5′-CCGGGTCGACTGAATGCTTGGTGTTCG-3′；MYB122-GFP-R，5′-CTCACCATACTAGTGATGCCTGTTTCTCTCA-3′。以pMD19-T-PsnMYB122載體的質(zhì)粒為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增并膠回收，用speⅠ限制性內(nèi)切酶酶切pBI121-GFP載體質(zhì)粒，將空載線性質(zhì)粒與膠回收產(chǎn)物在50 ℃下用In-Fusion高效連接酶進(jìn)行連接，并用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)中，37 ℃培養(yǎng)后挑單菌落后送生物公司測(cè)序(生工)，獲得pBI121-MYB122-GFP的重組質(zhì)粒，采用基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至洋蔥表皮細(xì)胞(儀器PDS-1000)，暗培養(yǎng)24～48 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察其在細(xì)胞中的表達(dá)部位[15]。

1.2.4PsnMYB122基因的時(shí)空表達(dá)測(cè)定

將培養(yǎng)1個(gè)月的小黑楊組培苗，在60%～70%相對(duì)濕度、16 h光/8 h暗、平均溫度25 ℃條件下，在水中繼續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月后分為24組，每3組施以1種處理。分別用水(對(duì)照組)和0.15 mol·L-1(實(shí)驗(yàn)室篩選耐鹽基因濃度)NaCl處理0、3、6、12、24 h后，分別提取樣本的根、莖、葉，液氮速凍后，利用天恩澤柱式植物RNAout試劑盒(北京天恩澤科技有限公司)提取樣本組織RNA，并利用PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，每個(gè)處理包含3個(gè)生物重復(fù)。根據(jù)楊樹(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)中MYB122基因序列設(shè)計(jì)避開(kāi)保守結(jié)構(gòu)域的定量引物MYB122-F，5′-GGAGTTACTGGATGCCAAG-3′，MYB122-R；5′-CCAGGATTTGAGCAGTGTG-3′，以Actin(基因登錄號(hào)：JM986590)和UBQ(基因登錄號(hào)：FJ438462)為內(nèi)參引物進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系參照熒光定量試劑盒為SYBR?Premix Ex Taq II，在ABI7500熒光PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性12 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，95 ℃延伸30 s；共45個(gè)循環(huán)，用公式2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5PsnMYB122酵母自激活

根據(jù)已經(jīng)測(cè)序成功的MYB122基因序列將其拆分成4個(gè)不同長(zhǎng)度的區(qū)段(MYB122-BDFR1含145將其個(gè)氨基酸；MYB122-BDF1R含172個(gè)氨基酸；MYB122-BDF1R2含112個(gè)氨基酸；MYB122-BDF2R含60個(gè)氨基酸)，分別設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1，利用引物將基因片段擴(kuò)增出來(lái)，以pMD19-T-PsnMYB122載體的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。將膠回收產(chǎn)物與空載質(zhì)粒雙酶切，并將酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。連接pGBKT7載體，并將其產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。第2天挑點(diǎn)，單克隆檢測(cè)，將條帶正確的菌液送測(cè)序。提取pGBKT7-PsnMYB122質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞，將其涂于SD/-Trp和SD/-Trp/-His培養(yǎng)基中。然后放在恒溫箱中30 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑點(diǎn)于加入X-α-Gal的SD/-Trp中，觀察是否變藍(lán)來(lái)檢測(cè)自激活活性。

表1 PsnMYB122構(gòu)建pGBKT7載體的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 pMD19-T-PsnMYB122載體構(gòu)建

以小黑楊嫩葉的cDNA為模板進(jìn)行PCR，連接pMD19-T Vector載體，擴(kuò)增出1 100 bp左右的條帶(圖1)。

2.2 PsnMYB122基因蛋白的理化性質(zhì)

ExPASy ProtParam預(yù)測(cè)表明，MYB122基因編碼氨基酸的數(shù)目為317個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量39 007.7，理論等電點(diǎn)(PI)為5.87，蛋白質(zhì)分子式為C1588H1486N460O496S14，不穩(wěn)定系數(shù)為56.47，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。脂溶指數(shù)為75.36，總平均親水性的數(shù)值為-0.698，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白[16]。

2.2.1 PsnMYB122蛋白質(zhì)的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

使用SignalP 4.1 Server在線軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，未發(fā)現(xiàn)該蛋白含有信號(hào)肽。同時(shí)，由于第49位甘氨酸殘基原始剪切位點(diǎn)最高分值為0.112，綜合剪切位點(diǎn)最高分值為0.109，第12位精氨酸信號(hào)肽最高分值為0.148，最后氨基酸加權(quán)平均值為0.109遠(yuǎn)小于0.5，推測(cè)不存在信號(hào)肽(表2)。

表2 MYB122蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2.2PsnMYB122編碼蛋白進(jìn)化樹(shù)

利用MEGA5.0軟件對(duì)MYB122氨基酸序列與其他物種中的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，MYB122保守結(jié)構(gòu)域序列與其他物種MYB具有很高的一致性(圖2)，MYB122和毛白楊(Populustomentosa)、胡楊(P.euphratica)、毛果楊(P.trichocarpa)親緣關(guān)系最近；與橡膠(Heveabrasiliensis)、木薯(Manihotesculenta)、蓖麻(Ricinuscommunis)、榴蓮(Duriozibethinus)、擬南芥、煙草(Nicotianatabacum)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。在線Blast比對(duì)結(jié)果表明，MYB122編碼的氨基酸序列與毛白楊的同源性最高，相似性達(dá)到95.90%。

2.3 PsnMYB122基因的時(shí)空表達(dá)特性

2.3.1PsnMYB122基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

利用基因槍將MYB122-GFP融合表達(dá)載體和GFP蛋白表達(dá)載體對(duì)洋蔥表皮進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，結(jié)果顯示在融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)GFP綠色熒光，而陽(yáng)性對(duì)照GFP蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞可見(jiàn)全細(xì)胞表達(dá)熒光，說(shuō)明MYB122轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核內(nèi)(圖4)。

2.3.2PsnMYB122應(yīng)答鹽脅迫差異表達(dá)

MYB122基因表達(dá)具有組織特異性，并對(duì)脅迫產(chǎn)生應(yīng)答。在非脅迫條件下，其在根中表達(dá)水平比在莖和葉中高，約為莖表達(dá)水平的6.306倍，約為葉表達(dá)水平的5.897倍。而在莖和葉中的表達(dá)水平差距不明顯。鹽脅迫下，MYB122基因在根莖葉中都表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，葉中9 h表達(dá)量達(dá)到最大，約為對(duì)照的8.168倍，根中12 h表達(dá)量達(dá)到最高，約為對(duì)照的8.714倍，莖中12 h表達(dá)量達(dá)到最高，約為對(duì)照的7.710倍(表3)。

表3 鹽脅迫下楊樹(shù)MYB122基因的相對(duì)表達(dá)量

2.4 PsnMYB122自激活驗(yàn)證

MYB122基因的4個(gè)片段中能夠轉(zhuǎn)錄自激活的均為C端的片段，說(shuō)明該基因的自激活結(jié)構(gòu)域位于此基因的C端(圖5)。隨著C端區(qū)域片段縮小到60個(gè)氨基酸時(shí)，轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞在SD/Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并呈現(xiàn)藍(lán)色，說(shuō)明MYB122轉(zhuǎn)錄因子的自激活結(jié)構(gòu)域在基因的C端1～60個(gè)氨基酸間。

3 結(jié)論與討論

MYB轉(zhuǎn)錄因子作為植物中功能多樣且存在最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族，其作用于植物生命過(guò)程中的一生，包括植株的代謝活動(dòng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)分化等。本研究通過(guò)PlantTFDB在線網(wǎng)站獲取毛果楊MYB122基因的CDS全長(zhǎng)，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)小黑楊PsnMYB122基因的特異性引物，克隆獲得MYB122目的基因。通過(guò)在線軟件分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白，沒(méi)有信號(hào)肽。將MYB122與其他物種的MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)以及構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)小黑楊MYB122與毛白楊、毛果楊、胡楊等物種親緣關(guān)系較近。對(duì)MYB122轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位研究表明，該基因定位在細(xì)胞核，和大部分的轉(zhuǎn)錄因子定位結(jié)果[17]一致。有研究發(fā)現(xiàn)，R2R3-MYB亞族FtMYB13基因通過(guò)改變植物的生理和生化反應(yīng)以及增加脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)擬南芥的干旱和鹽脅迫耐受性[18]。Tang et al.[19]研究發(fā)現(xiàn)水稻(Oryzasativa)OsMYB6過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽和抗干旱能力較野生型水稻高。在對(duì)野生型小黑楊進(jìn)行鹽脅迫處理后取不同的組織進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，脅迫處理后，MYB122基因在根莖葉中表達(dá)量都表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，根和莖在12 h的表達(dá)量達(dá)到最高，而葉在9 h的表達(dá)量達(dá)到最高，推測(cè)該基因可能和楊樹(shù)抗逆脅迫相關(guān)。

大部分植物轉(zhuǎn)錄因子都有轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和DNA結(jié)合區(qū)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)決定轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因的表達(dá)起激活或抑制作用，所以對(duì)轉(zhuǎn)錄因子激活區(qū)域的研究有重要意義[20]。利用轉(zhuǎn)錄因子酵母自激活技術(shù)來(lái)檢測(cè)該基因具有自激活活性。并且通過(guò)分段來(lái)進(jìn)一步檢測(cè)該基因的自激活區(qū)域，將其氨基酸不同區(qū)域連接到BD載體上再次進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，最后得出該基因自激活區(qū)域在C端1～60個(gè)氨基酸間，這和已有研究證明部分MYB轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活域在其C端結(jié)果[21]一致。