蒙藥地梢瓜的質(zhì)量標準研究

吳依靜 喜杰 鐘國躍 蘇日娜 李輝虎 羅維早

摘 要 目的：建立蒙藥地梢瓜的質(zhì)量標準。方法：采用薄層色譜法（TLC）鑒別地梢瓜藥材;按2015年版《中國藥典》（四部）方法檢測藥材中的水分、總灰分、醇溶性浸出物含量;采用高效液相色譜法（HPLC）測定藥材中地梢瓜苷的含量。結果：TLC圖斑點清晰，供試品（地梢瓜藥材）與對照品（地梢瓜苷）在相應位置上均顯示相同的黃綠色熒光斑點。22批地梢瓜藥材的水分含量為6.18%～12.97%，總灰分含量為4.64%～7.95%，醇溶性浸出物含量為12.46%～32.70%。地梢瓜苷檢測進樣量的線性范圍為0.048～3.050 μg（R 2=0.999 9）;精密度、穩(wěn)定性、重復性、耐用性試驗的RSD均小于1%;加樣回收率為104.03%～106.36%（RSD=0.96%，n=6）;22批地梢瓜藥材中地梢瓜苷的含量為0.006 2%～0.130 5%。結論：初步擬定地梢瓜中水分不得超過11.50%，總灰分不得超過7.50%，醇溶性浸出物不得少于17.00%，地梢瓜苷含量不得少于0.05%。所建質(zhì)量標準可用于蒙藥地梢瓜藥材的質(zhì)量控制。

關鍵詞 蒙藥;地梢瓜;地梢瓜苷;薄層色譜法;高效液相色譜法;含量測定;質(zhì)量標準

中圖分類號 R282;R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）18-2230-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.18.10

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the quality standards of Mongolian medicine Cynanchum thesioides. METHODS： TLC was used for the qualitative identification of C. thesioides. According to 2015 edition of Chinese Pharmacopeia （part Ⅳ）， the moisture， total ash and ethanol-soluble extract were determined. HPLC method was used to determine the content of thesioideoside in C. thesioides. RESULTS： TLC spots were clear， there were same yellow green fluorescent spots on the corresponding position of the sample （C. thesioides） and control （thesioideoside）. In 22 batches of samples， contents of moisture were 6.18%-12.97%， total ash were 4.64%-7.95%， ethanol-soluble extract were 12.46%-32.70%. The linear range of thesioideoside were 0.048-3.050 μg（R 2=0.999 9）. RSDs of precision， stability， repeatability and durability tests were all less than 1%. The recoveries were 104.03%-106.36% （RSD=0.96%， n=6）. The contents of thesioideoside in 22 batches of C. thesioides were 0.006 2%-0.130 5%. CONCLUSIONS： It is suggested that the moisture and total ash should not exceed 11.50% and 7.50%， respectively; the contents of ethanol-soluble extract and the sioideoside are no less than 17.00% and 0.05%， respectively. The established quality standards can be used for quality control of Mongolian medicine C. thesioides.

KEYWORDS? ?Mongolian medicine; Cynanchum thesioides; Thesioideoside; TLC; HPLC; Content determination; Quality standards

蒙藥“特莫-呼呼/特莫恩-胡乎（音譯）”，又稱地梢瓜，為蘿藦科植物地梢瓜[Cynanchum thesioides（Freyn）K. Schum.]的干燥果實，味苦，性鈍、燥、糙、涼，具有清“協(xié)日”、止瀉的功效[1]。在臨床上，地梢瓜常被蒙醫(yī)用于治療黃疸、腑“協(xié)日”熱、腸刺痛、菌痢、熱瀉等癥，同時該藥也是治療腸熱痢疾、腹瀉的經(jīng)典方劑“茵達日-4湯”的君藥[1]。目前，地梢瓜藥材尚無國家標準，僅在《衛(wèi)生部藥品標準（蒙藥分冊）》[2]和《內(nèi)蒙古蒙藥材標準》[3]中以“特莫-呼呼/地梢瓜”之名收載，以種子入藥且這兩種標準中僅有地梢瓜種子性狀和顯微鑒別，無其余藥用部位水分、總灰分檢查和浸出物含量測定，也未有其主要成分的薄層色譜鑒別（TLC）和含量測定。此外，據(jù)市場和使用現(xiàn)狀調(diào)查結果顯示，市售及臨床均以地梢瓜果實入藥。因此，有必要對其質(zhì)量標準進行完善，以全面有效地控制藥材質(zhì)量。有文獻發(fā)現(xiàn)，地梢瓜主要含有三萜類、甾體類、黃酮類、酚酸類等化學成分[4-7]，具有抗衰老、抗氧化、止瀉等藥理作用[8-11];其黃酮類主要成分地梢瓜苷對神經(jīng)細胞脂質(zhì)過氧化反應、DNA損傷及人臍靜脈內(nèi)皮細胞均有抑制或保護作用[12-13]。基于此，本研究采用TLC法對地梢瓜藥材進行鑒別，同時按2015年版《中國藥典》（四部）方法對其水分、灰分、醇溶性浸出物等進行考察;采用高效液相色譜法（HPLC）對其主要成分地梢瓜苷進行定量分析，旨在為完善其質(zhì)量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，包括LC-20 AT型輸液泵、SPD-M20A型二極管陣列檢測器、SIL-20A型自動進樣器、CTO-20A型柱溫箱、CBM-20A型系統(tǒng)控制器、Lab LC solutions工作站（日本Shimadzu公司）;2100型紫外-可見分光光度儀（北京瑞利分析儀器有限公司）;BT 124S型十萬分之一電子天平[賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司];KQ-5200 DB型超聲波清洗機（昆山市超聲波儀器公司）;DE-100g型萬能粉碎機（浙江紅景天工貿(mào)有限公司）;SX-2.5-10型箱式電阻爐控制箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;HH-W420型數(shù)顯恒溫水浴鍋（深圳市歐萊博科技有限公司）;DHG-Ⅲ型電熱鼓風干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

22批地梢瓜藥材（編號：S1～S22），經(jīng)江西中醫(yī)藥大學藥學院鐘國躍研究員鑒定為蘿藦科植物地梢瓜[C. thesioides（Freyn）K. Schum.]的干燥果實，其信息來源詳見表1。所有藥材樣品均于60 ℃干燥48 h后粉碎，過二號篩，備用。硅膠G薄層板（青島譜科分離材料有限公司）;地梢瓜苷對照品（本課題組自制，純度：>98%）;乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

取22批地梢瓜藥材（編號：S1～S22）粉末5 g，加入50%乙醇100 mL，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，濾過，濾液蒸發(fā)至無醇味后，以等體積乙酸乙酯萃取3次，再以等體積正丁醇萃取2次，合并正丁醇萃取液，揮干，殘渣加入甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液（Ⅰ）。精密稱取地梢瓜苷對照品適量，加入甲醇制成每l mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液（Ⅰ）。按照2015版《中國藥典》（四部）通則“薄層色譜法”[14]操作，吸取上述供試品溶液、對照品溶液各5 μL，分別點于硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-無水乙醇-水-甲酸（2.5 ∶ 2.5 ∶ 4 ∶ 0.5 ∶ 0.5，V/V/V/V/V）為展開劑，展距8 cm，飽和20 min后，展開，取出，烘干，噴以3%三氯化鋁溶液顯色，于105 ℃加熱至斑點清晰，置于紫外燈（365 nm）下檢視。結果，在供試品TLC中，于對照品TLC相應位置上顯相同的黃綠色熒光斑點，詳見圖1。

2.2 水分

取22批地梢瓜藥材（編號：S1～S22）粉末適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則“水分測定法”項下“烘干法”[14]測定水分，每批平行3次。結果，22批地梢瓜藥材水分含量為6.18%～12.97%，平均值為8.72%，詳見表2。將22批地梢瓜藥材水分含量均值上浮30%[15]，作為水分限度標準，即藥材水分含量不得超過11.50%。

2.3 總灰分檢查

取22批地梢瓜藥材（編號：S1～S22）粉末適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則“灰分測定法”項下“總灰分測定法”[14]測定總灰分，每批平行3次。結果，22批地梢瓜藥材總灰分為4.64%～7.95%，平均值為6.15%，詳見表2。將22批地梢瓜藥材總灰分均值上浮20%[15]，作為總灰分限度標準，即藥材總灰分不得超過7.50%。

2.4 醇溶性浸出物檢查

取22批地梢瓜藥材（編號：S1～S22）粉末適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則“浸出物測定法”項下“醇溶性浸出物測定法（熱浸法）”[14]以50%乙醇熱浸測定醇溶性浸出物含量，每批平行3次。結果，22批地梢瓜藥材醇溶性浸出物含量為12.46%～32.70%，平均值為21.00%，詳見表2。將22批地梢瓜藥材醇溶性浸出物含量均值下浮20%[15]，作為醇溶性浸出物限度標準，即藥材醇溶性浸出物不得少于17.00%。

2.5 含量測定

2.5.1 對照品溶液（Ⅱ）的制備 精密稱取地梢瓜苷對照品適量，加入50%乙醇，制成每1 mL含305 μg的對照品溶液（Ⅱ）。

2.5.2 供試品溶液（Ⅱ）的制備 取地梢瓜藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 檢測波長的確定 取“2.5.1”項下對照品溶液（Ⅱ）適量，加入50%乙醇稀釋，制成質(zhì)量濃度為0.76 μg/mL的檢測溶液，使用紫外-可見分光光度儀于190～900 mn全波長范圍內(nèi)進行掃描。結果，檢測溶液在254 nm波長處有最大吸收，故選擇該波長為檢測波長，詳見圖2。

2.5.4 色譜條件 色譜柱：Inertsustain C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動相：乙腈（A）-0.4%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，15%A→28%A;10～12 min，28%A→29%A;12～15 min，29%A→30%A;15～17 min，30%A→95%A）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測波長：254 nm;進樣量：20 μL。

2.5.5 系統(tǒng)適用性試驗 取上述對照品溶液（Ⅱ）、供試品溶液（Ⅱ）、空白溶液（50%乙醇溶液）適量，按“2.5.4”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，地梢瓜苷的保留時間約為13 min，其與相鄰峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按地梢瓜苷計應不低于3 000，空白溶液對測定無干擾，詳見圖3。

2.5.6 線性關系考察 取“2.5.1”項下對照品溶液（Ⅱ）適量，加入50%乙醇稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為152.5、76.25、38.13、19.06、9.53、4.76、2.38 μg/mL的系列線性溶液，分別精密吸取20 μL，按“2.5.4”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以地梢瓜苷進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果，地梢瓜的回歸方程為Y=2 023 470.17X-12 998.29（R 2=0.999 9），表明地梢瓜苷進樣量在0.048～3.050 μg范圍內(nèi)與峰面積的線性關系良好。

2.5.7 定量限與檢測限考察 取“2.5.6”項下質(zhì)量濃度為4.76 μg/mL的線性溶液適量，用50%乙醇倍比稀釋，按“2.5.4”項下色譜條件進樣測定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結果，地梢瓜苷的定量限為1.19 μg/mL，檢測限為0.53 μg/mL。

2.5.8 精密度試驗 取“2.5.6”項下質(zhì)量濃度為9.53 μg/mL的線性溶液適量，按“2.5.4”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，地梢瓜峰面積的RSD為0.02%（n=6），表明儀器精密度很好。

2.5.9 穩(wěn)定性試驗 取“2.5.2”項下供試品溶液（Ⅱ）（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、6、10、16、18、24 h時，按“2.5.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，地梢瓜苷峰面積的RSD為0.66%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.10 重復性試驗 取地梢瓜藥材（編號：S1）粉末約1.0 g，精密稱定，共6份，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液（Ⅱ），再按“2.5.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算地梢瓜苷含量。結果，地梢瓜苷的平均含量為0.074 4%（RSD=0.80%，n=6），表明方法重復性好。

2.5.11 加樣回收率試驗 取地梢瓜藥材（編號：S1）粉末約0.41 g，精密稱定，共6份，加入“2.5.1”項下對照品溶液（Ⅱ）1 mL，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

2.5.12 耐用性試驗 取地梢瓜藥材（編號：S1）粉末適量，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液（Ⅱ），再按“2.5.4”項下色譜條件以不同進樣量、流速、柱溫、色譜柱進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算地梢瓜苷含量。結果，地梢瓜苷含量的RSD均小于0.80%（n=3），表明方法耐用性良好，詳見表4。

2.5.13 樣品含量測定 分別取22批地梢瓜藥材（編號：S1～S22）粉末適量，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液（Ⅱ），再按“2.5.4”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并按外標法計算地梢瓜苷含量。結果，22批地梢瓜藥材中地梢瓜苷含量為0.006 2%～0.130 5%，平均含量為0.069 7%（n=3）[（該平均值為將所有數(shù)據(jù)采用G檢驗和D檢驗[16]，排除異常值（本試驗中S9樣品所測結果異常）后所得]，詳見表5。將22批地梢瓜藥材地梢瓜苷平均含量下浮25%[15]，作為含量限度標準，即地梢瓜苷含量不得少于0.05%。

3 討論

3.1 藥用部位的選擇

藏、蒙醫(yī)藥經(jīng)典《醫(yī)藥月帝》[17]（藏文本漢譯名為《月王藥診》，約8世紀）中記載，藥材“度格模農(nóng)”（藥材藏文名的漢文注音）來源于夾竹桃科植物止瀉木（Holarrhena antidysenterica Wall. ex A. DC.）的種子（藥材名為止瀉木子）;蒙醫(yī)藥古籍《必用藥劑諸品》[18]中首次記載“度格模農(nóng)”的蒙文名為“特莫恩-胡呼”;后據(jù)相關學者考證，“特莫恩-胡呼”為地梢瓜（C. thesioides），系蒙醫(yī)長期臨床使用的“度格模農(nóng)”（止瀉木子）的替代品[15]。筆者前期對地梢瓜藥材市場和在蒙醫(yī)醫(yī)療機構的使用情況進行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，地梢瓜均以果實入藥?；诖耍瑥乃幉募庸?、使用現(xiàn)狀、有效性及資源合理利用等方面綜合考慮，建議地梢瓜的藥用部位以果實為宜，并對其質(zhì)量標準進行了初步研究。

3.2 TLC條件篩選

本研究前期對不同展開系統(tǒng)[三氯甲烷-甲醇-甲酸（6 ∶ 3 ∶ 1，V/V/V）、環(huán)己烷-乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸（2.5 ∶ 3.5 ∶ 1，V/V/V）、正己烷-乙酸乙酯-無水乙醇-水-甲酸（2.5 ∶ 2.5 ∶ 4 ∶ 0.5 ∶ 0.5，V/V/V/V/V）]進行了考察。結果，以正己烷-乙酸乙酯-無水乙醇-水-甲酸（2.5 ∶ 2.5 ∶ 4 ∶ 0.5 ∶ 0.5，V/V/V/V/V）為展開劑時，供試品與對照品色譜在相應位置上顯示相同的黃綠色熒光斑點。同時，本研究還考察了在不同相對濕度（18%、88%）及溫度（4、35 ℃）條件下TLC法的耐用性。結果在上述條件下，TLC圖斑點均清晰，且分離度良好，表明本TLC法耐用性良好。

3.3 浸出物測定方法考察

本研究前期考察了不同浸出溶液（水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇）、浸出方法（冷浸、熱浸）對醇溶性浸出物測定結果的影響。結果，以50%乙醇熱浸所得浸出物含量較高，故選擇50%乙醇熱浸法為浸出物測定方法。

3.4 供試品溶液（Ⅱ）制備方法考察

本研究前期對不同提取溶劑（100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇）、提取方式（超聲、回流）、提取溶劑用量（25、50、100 mL）、提取時間（15、30、60 min）等因素進行了考察，最終確定采用“2.5.2”項下供試品溶液（Ⅱ）的制備方法。此外，在藥材粉碎過程中筆者發(fā)現(xiàn)，由于地梢瓜果皮和種毛纖維性強，難以粉碎且易起絨，不易過篩，使得取樣不均勻，從而導致所測地梢瓜苷含量偏差較大，故將地梢瓜藥材樣品于60 ℃干燥48 h后再行粉碎。

3.5 限度規(guī)定

本研究參照2015年版《中國藥典》（四部）[14]對地梢瓜藥材的水分、總灰分、浸出物進行了測定，并對地梢瓜苷的含量進行了定量分析;同時，參考相關文獻[15]，初步擬定地梢瓜水分含量不得超過11.50%，總灰分不得超過7.50%，醇溶性浸出物不得少于17.00%，地梢瓜苷含量不得少于0.05%。

綜上所述，本研究所建含量測定HPLC法穩(wěn)定性、重復性良好，可用于蒙藥地梢瓜中地梢瓜苷的含量測定;質(zhì)量標準可用于蒙藥地梢瓜藥材的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2020-05-13 修回日期：2020-07-03）

（編輯：陳 宏）