酶法改性對米糠蛋白凝膠硬度及功能性質(zhì)的影響

于殿宇 張 欣 鄒丹陽 唐月 劉文質(zhì) 任嘉嘉 王立琦 杜 晶*

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 哈爾濱150030 2 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 哈爾濱150028 3 中機康元糧油裝備（北京）有限公司 北京100083）

米糠蛋白是一種營養(yǎng)價值很高的植物源蛋白質(zhì)，其必需氨基酸組成齊全[1-2]，并且必需氨基酸的比例較為平衡，接近FAO/WHO 推薦模式[3-5]。因米糠蛋白與牛乳中酪蛋白的生物效價非常接近，故消化率相對較高[6]。另外，米糠蛋白具有過敏性低的優(yōu)點，可大力開發(fā)并將其應(yīng)用到的嬰幼兒食品中[7-8]。米糠蛋白還具有良好的溶解性、乳化性、起泡性及持油性等一系列功能性質(zhì)，具有非常可觀的開發(fā)潛力[9-10]，可作為理想的食用蛋白質(zhì)資源加以開發(fā)利用[11]。米糠為稻米加工中的副產(chǎn)品，目前我國米糠的年產(chǎn)量達1000 萬噸以上。米糠蛋白質(zhì)含量占總質(zhì)量的12%～15%，生物效價為2.0～2.5，其營養(yǎng)價值遠優(yōu)于酪蛋白，可與雞蛋蛋白相媲美[12-16]。鑒于此，米糠蛋白作為天然優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)值得大力開發(fā)和利用。

米糠蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的天然植物蛋白質(zhì)資源，其組成成分和功能性質(zhì)會影響米糠食品的感官和質(zhì)構(gòu)等特性[17-18]。蛋白質(zhì)改性可通過對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行一定修飾，從而改善其蛋白質(zhì)產(chǎn)品在貯藏過程中的物理化學(xué)性質(zhì)[19-21]。蛋白質(zhì)改性方法主要包括：物理改性、化學(xué)改性、基因工程改性及生物酶改性等[22]。酶法改性是最常用的改性方法，其最大的優(yōu)點是不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)中營養(yǎng)成分損失，也很少產(chǎn)生毒理學(xué)方面的問題[23]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Transglutaminase，TG）是催化轉(zhuǎn)?；磻?yīng)和催化同一種蛋白質(zhì)或者不同種蛋白質(zhì)分子之間交聯(lián)、聚合形成新共價鍵的一種聚合酶[24]，而改變共價鍵的數(shù)目和強度都會使蛋白質(zhì)的凝膠性能發(fā)生改變。使用該酶對蛋白質(zhì)改性的途徑包括胺的導(dǎo)入、交聯(lián)及脫胺，這3種途徑不僅提高了蛋白質(zhì)的營養(yǎng)效價，還改善了食品的功能特性，延長了貨價期，減少食品中的過敏源。

本試驗研究了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TG）改性后米糠蛋白的凝膠硬度、溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性等功能性質(zhì)的變化情況，探討蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、加酶量及改性時間等對米糠蛋白凝膠硬度的影響，為今后改善植物蛋白品質(zhì)提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠，黑龍江省北大荒農(nóng)業(yè)股份有限公司。經(jīng)堿溶酸沉提取米糠蛋白，經(jīng)測定蛋白質(zhì)含量為92.5%。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TG，酶活力100 U/g）、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鹽酸等均為分析純級，中國化學(xué)試劑網(wǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

TA.XT Plus 物性測試儀，英國Stable Micro Systems 公司；AL2044 型電子天平，上海衡平儀器儀表廠；752 型紫外可見分光光度計，上海佑科儀器有限公司；PHS－3C 精密pH 計，上海大普儀器；FW100 高速萬能粉碎機，上海頂帥儀器有限公司；LXJ－ⅡB 離心機，上海安亭儀器廠；C－18F 電磁爐，廣東銀港科技股份有限公司；電熱恒溫水浴鍋，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；BCD－257SL 型冰箱，中國海爾集團；DHG－9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；S-3400N掃描電鏡，日本Hitachi 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 TG 改性米糠蛋白的制備 稱取一定質(zhì)量米糠蛋白，加入不同含量TG 后，加入100 mL pH為8 的磷酸緩沖液，于45 ℃條件下水浴1～5 h，水浴結(jié)束后置于3 000 r/min 的離心機中離心15 min，凍干后儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、改性時間及加酶量為試驗單因素的基礎(chǔ)上，以酶改性后米糠蛋白的硬度為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。采用Design Expert 8.0.6 統(tǒng)計軟件，設(shè)計及分析響應(yīng)面試驗，試驗因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面影響因素及水平Table 1 Influence factors and levels of response surface

1.3.3 TG 改性米糠蛋白凝膠硬度測定 運行模式：TPA，測前速度：2.0 mm/s，測試速度：0.8 mm/s，下壓距離：50%，測后速度：0.8 mm/s，數(shù)據(jù)采集速率：200 pps。試驗重復(fù)3 次。凝膠硬度為第一次擠壓變形時產(chǎn)生的最大刺破力（g）。

1.3.4 TG 改性米糠蛋白功能性質(zhì)的測定

1.3.4.1 持水力測定 稱取0.5 g 改性后米糠蛋白，溶于9.5 mL 蒸餾水中，用玻璃棒攪拌均勻，置于室溫下30 min，于3 000 r/min 條件下離心10 min，稱量下沉物質(zhì)量m，持水力（Water binding capability，WBC）根據(jù)式（1）計算：

式中，m——下沉物質(zhì)量，g；0.5——米糠蛋白質(zhì)量，g；WBC——持水力，g/g。

1.3.4.2 溶解性測定[25]稱取0.25 g 改性后米糠蛋白溶于10 mL 蒸餾水中，置于磁力攪拌機中均勻攪拌1 h，于3 000 r/min 條件下離心10 min，采用凱氏定氮法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量。

1.3.4.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性 參照Ali等[26]的方法，采用pH 為8 的磷酸緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)為0.6%的蛋白質(zhì)溶液。量取24 mL 蛋白質(zhì)溶液加入8 mL 一級大豆油，在剪切乳化儀中高速均質(zhì)（10 000 r/min）1 min 制成乳狀液狀態(tài)，立即用移液管量取1 mL 乳狀液與9 mL SDS（0.1%）溶液混勻，并用0.1% SDS 溶液作為空白對照，采用分光光度計在波長500 nm 處測定吸光值（A0）。乳狀液靜置20 min 后，再次取樣測定。乳化活力（EA）以剛開始的吸光值A(chǔ)0表示，乳化穩(wěn)定指數(shù)（ESI）根據(jù)式（2）計算：

式中，A0——初始乳化液的吸光值；Δt——20 min；ΔA——20 min 后的吸光度與A0之差。

1.3.4.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性[27]將改性的米糠蛋白配置成質(zhì)量分數(shù)為1%的蛋白溶液，取100 mL 蛋白溶液在組織搗碎機中高速攪打（10 000 r/min）2 min 后，迅速倒入200 mL 量筒中，記錄泡沫體積V1，靜置10 min 后再次測量泡沫體積V2，起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別按式（3）和式（4）計算：

式中，V1——靜置前泡沫體積，mL；V2——靜置后泡沫體積，mL。

1.4 掃描電子顯微鏡的測定

將酶改性前后的凍干米糠蛋白樣品用導(dǎo)電雙面膠布均勻分散并固定在樣品臺上，采用Hitachi E-1010 離子濺射儀鍍金，在加速電壓為5.0 kV的條件下用掃描電子顯微鏡對樣品的微觀形態(tài)進行觀察。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗指標均重復(fù)測定3 次，試驗結(jié)果取平均值和標準誤差值，數(shù)據(jù)采用Origin 7.5 與Design Expert 8.0.6 進行分析和繪制。采用SPSS 22.0 進行ANOVA 單因素方差分析，采用Ducan 檢驗（P＜0.05）檢驗數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶改性條件對米糠蛋白凝膠硬度的影響

2.1.1 米糠蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)對米糠凝膠硬度的影響 在加酶量19 U/g，改性時間3 h 的條件下，研究米糠蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)對米糠蛋白凝膠硬度的影響。由圖1可知，當(dāng)米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)在5%～13%范圍內(nèi)，凝膠硬度不斷增大，在蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為13%～21%范圍內(nèi)，凝膠硬度呈下降的趨勢，在蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為13%時凝膠效果最佳。蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為5%時，硬度為0 不成凝膠，這是可能是由于蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)較低時，蛋白質(zhì)分子之間的接觸幾率較低，因而不能形成凝膠。在一般情況下，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量分數(shù)較低時，蛋白質(zhì)與溶劑之間的相互作用高于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，蛋白質(zhì)與溶劑的作用占據(jù)了主導(dǎo)優(yōu)勢，因此體系形成凝膠的難度較大。然而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量分數(shù)相對較高時，酶的相對濃度較低，導(dǎo)致蛋白分子與酶分子的碰撞幾率降低，反應(yīng)速度降低，凝膠硬度也隨之降低[28]。

2.1.2 TG 加酶量對米糠凝膠硬度的影響 在米糠蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為13%，改性時間為3 h 的條件下，研究加酶量對米糠蛋白硬度的影響。

由圖2可知，加酶量在0～16 U/g 范圍內(nèi)，凝膠硬度隨著加酶量的增加而增加。而當(dāng)加酶量在16～32 U/g 范圍內(nèi)，凝膠硬度隨著加酶量的增加而逐漸降低，這是因為當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分數(shù)一定時，加酶量會存在一個臨界值[29]。當(dāng)酶添加量小于16 U/g時，由于酶的添加量過少，不能夠結(jié)合所有的底物，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成不完全，導(dǎo)致凝膠硬度較低。加酶量過高反而會破壞體系中底物與酶的動態(tài)平衡，使得凝膠硬度降低。

2.1.3 改性時間對米糠蛋白凝膠硬度的影響 在加酶量為19 U/g，米糠蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為13%的條件下，研究改性時間對米糠蛋白硬度的影響。

由圖3可知，改性時間在1～3 h 范圍內(nèi)，米糠蛋白的凝膠硬度隨著時間的增加而增大，改性時間為3 h 時，凝膠硬度達到最大值，這可能是由于作用時間的增加，酶與蛋白質(zhì)底物持續(xù)反應(yīng)，交聯(lián)的復(fù)合產(chǎn)物不斷增多，進而提高凝膠硬度。當(dāng)改性時間繼續(xù)增加，凝膠硬度呈下降趨勢，推測可能是由于過長時間的改性導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)中疏水基團發(fā)生變化，氫鍵以及非共價鍵斷裂，使得凝膠硬度降低。

圖1 米糠蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)對米糠蛋白凝膠硬度的影響Fig.1 Effects of protein mass fraction on gel hardness of rice bran protein

圖2 TG 加酶量對米糠蛋白凝膠硬度的影響Fig.2 Effects of enzyme addition on firmness of rice bran protein gel

圖3 改性時間對米糠蛋白凝膠硬度的影響Fig.3 Effects of modification time on hardness of rice bran protein gel

2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面法的試驗結(jié)果及方差分析 采用Design Expert 8.0.6 對表2 中的試驗數(shù)據(jù)回歸擬合，得到硬度R 與自變量改性時間（A）、蛋白質(zhì)質(zhì)質(zhì)量分數(shù)（B）、加酶量（C）的二次回歸編碼方程模型為：

R=+90.32+4.91A+0.44B+12.38C-11.70AB+0.88AC-18.06-15.46B2-13.48C2

由于二次回歸編碼方程模型在響應(yīng)面設(shè)計中的各個因素均經(jīng)過無量綱性編碼處理，且各因素間一次項、交互項與平方項的回歸系數(shù)均不相關(guān)，故可以根據(jù)編碼方程中各個回歸系數(shù)的絕對值大小直接比較各因素對響應(yīng)值的影響程度，依次為：加酶量（C）＞改性時間（A）＞蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)（B）。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Respone plane test plan design and results

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The test results of variance analysis

由表3可知，回歸方程的因變量與自變量之間存在明顯的線性關(guān)系，該模型回歸顯著（P<0.0001），失擬項不顯著（P>0.05），由表3可知失擬項P 值為0.7079，大于0.05 表明失擬項不顯著，模型P<0.0001，小于0.05 表明模型顯著，并且模型中的參數(shù)A，B，C，AB，AC，A2，B2，C2均顯著。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9997，表明模型擬合度較好，能較好地反映各因素與相應(yīng)值變化的關(guān)系。

2.2.2 最優(yōu)條件的求證及驗證 采用軟件Design Expert 8.0.6 得到酶改性米糠蛋白的最佳工藝條件為改性時間3.2 h，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)12.8%，加酶量19.7 U/g，預(yù)測最佳凝膠硬度的理論值為93.58 g。對優(yōu)化條件進行驗證試驗，重復(fù)3 次，凝膠的硬度可達到93.54 g，預(yù)測值與理論值基本一致，表明響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝條件真實可靠。

2.3 改性前、后米糠蛋白功能性質(zhì)的研究分析

在最佳改性條件下，即加酶量19.7 U/g，改性時間3 h，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為13%，得到酶改性前后米糠蛋白功能性質(zhì)。

由表4可知，經(jīng)酶改性處理后米糠蛋白持水力增加了162%，推測是由于肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ 一羧酰胺基和賴氨酸殘基的ε－氨基分別作為?；墓w和受體，在一定條件下形成蛋白質(zhì)分子內(nèi)以及分子間的ε－（γ－谷氨酰）賴氨酸異肽鍵[30]，使蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生交聯(lián)，形成了更多水的結(jié)合位點，留住更多的水分，使得酶改性后米糠蛋白的持水性顯著提高。

酶改性后米糠蛋白的溶解度有一定程度的提高，然而改善效果不明顯，溶解度增加約31.1%。這可能是由于蛋白質(zhì)分子交聯(lián)使分子質(zhì)量增大，并且交聯(lián)后可能會導(dǎo)致內(nèi)部的疏水基團暴露在蛋白質(zhì)分子表面，從而使得溶解度下降；TG 使谷氨酰胺和天冬酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸和天冬氨酸，使得電離出的離子團增多，導(dǎo)致米糠蛋白溶解度增加[31]。

圖4 蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)和酶改性時間對米糠蛋白凝膠硬度的影響Fig.4 Effects of protein mass fraction and enzyme modification time on gel hardness of rice bran protein

圖5 加酶量和酶改性時間對米糖蛋白凝膠硬度的影響Fig.5 Effects of enzyme addition and enzyme modification time on gel hardness of rice bran protein

圖6 加酶量和蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)對米糖蛋白凝膠硬度的影響Fig.6 Effects of enzyme addition and protein mass fraction on gel hardness of rice bran protein

酶改性后的米糠蛋白的乳化性提高了52.7%，乳化穩(wěn)定性提高了25.4%。已有報道指出蛋白質(zhì)的構(gòu)象對蛋白質(zhì)的乳化性有著至關(guān)重要的作用[32]。TG 酶水解使得蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，影響蛋白質(zhì)的疏水作用，使原本包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性殘基暴露，進而提高了蛋白質(zhì)在油、水界面的吸附能力。并且由于酶改性后蛋白質(zhì)分子中凈電荷數(shù)量增加，增大了靜電斥力，使得油滴更難以聚合，最終提高了蛋白質(zhì)的乳化性和乳化穩(wěn)定性。酶改性后米糠蛋白的起泡性提高了33.3%，穩(wěn)定性略微提高了7.2%。蛋白質(zhì)的起泡能力與靜電相互作用、疏水相互作用以及二硫鍵的穩(wěn)定性有關(guān)，酶解可能使得蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)部分展開，破壞了疏水相互作用和離子鍵，降低了表面張力，導(dǎo)致氣、水界面更容易吸附空氣中的泡沫，從而增加泡沫穩(wěn)定性[33]。疏水性的增加同時也可以增強起泡能力[34]，使得蛋白質(zhì)在氣、水界面快速吸附，進而提高起泡能力和泡沫穩(wěn)定性。

表4 改性對米糠蛋白功能性質(zhì)的影響Table 4 Effects of modification on functional properties of rice bran protein powder

酶改性后米糠蛋白的持油性提高了114%，這可能是由于酶處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，更多疏水基團暴露，使得更多油相被截留，導(dǎo)致持油性顯著提高。

2.4 不同加酶量對米糠蛋白結(jié)構(gòu)的影響

于蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為12.8%，改性時間為3.2 h，TG 酶添加量分為0，16，20，24 U/g 的條件下酶改性后的米糠蛋白掃描電鏡圖如圖7所示。

向米糠蛋白中添加TG 會使蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這種酶改性作用會導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部或蛋白質(zhì)分子間的共價鍵或非共價鍵斷裂，并對蛋白質(zhì)的次級鍵產(chǎn)生一定影響，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞。掃描電子顯微鏡（SEM）可以直觀的觀察到米糠蛋白經(jīng)過酶改性后其空間微觀結(jié)構(gòu)的變化情況，圖7a是米糠蛋白酶改性前的SEM 圖，與圖7b，7c，7d 對比可以明顯看出，改性前的米糠蛋白結(jié)構(gòu)較為緊密，隨著加酶量增加至16 U/g 時（圖7b），米糠蛋白呈現(xiàn)出與海綿類似的結(jié)構(gòu)，空洞明顯變多、變大，之前較緊密的片層結(jié)構(gòu)間出現(xiàn)了一些較大的空洞。當(dāng)加酶量增加到20 U/g 時（圖7c），米糠蛋白海綿狀結(jié)構(gòu)變得更加緊密，孔洞結(jié)構(gòu)變小。當(dāng)加酶量增加至24 U/g 時（圖7d），米糠蛋白酶改性效果不理想，結(jié)構(gòu)變化不顯著。因此，酶添加量20 U/g 的條件下米糠蛋白酶改性效果較好。

3 結(jié)論

經(jīng)TG 改性后的米糠蛋白質(zhì)的持水力顯著提高，溶解度略微增加，乳化性和乳化穩(wěn)定性得到了一定程度提高，起泡性提高而起泡穩(wěn)定性略微提高，持油性明顯提高。由掃描電子顯微鏡觀察酶改性前、后米糠蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，可以看出改性后的孔洞結(jié)構(gòu)變多，由原來緊密的結(jié)構(gòu)變?yōu)轭愃坪＞d結(jié)構(gòu)，說明酶改性可有效改善米糠蛋白的結(jié)構(gòu)。