肉制品中雜環(huán)胺的形成及其機制

杜洪振 陳 倩 劉 騫 孔保華

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院 哈爾濱150030）

肉制品是人們?nèi)粘Ｉ攀车闹匾M成部分，為人體提供有價值的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。它是脂肪、蛋白質(zhì)、維生素、必需氨基酸和一些微量元素如鐵、鎂、硒、銅和鋅的主要來源[2]。肉和肉制品在蒸煮及煎炸過程中可能形成有毒、有害物質(zhì)，如亞硝胺、多環(huán)芳烴和雜環(huán)胺（Heterocyclic aromatic amines，HAAs）等典型的熱誘導化合物[3-4]。大多數(shù)熱誘導物已被證明對人體具有潛在的致突變或致癌作用[5]。

1939年，Widmark[6]發(fā)現(xiàn)將烤馬肉中提取的物質(zhì)反復涂抹在小鼠的背部，可以誘發(fā)乳腺腫瘤，而這一現(xiàn)象并沒有引起人們足夠的重視。1964年，Lijinsky等[7]發(fā)現(xiàn)肉制品加熱可形成致突變化合物。Sugimura等[8]進一步證實從牛肉和魚肉中提取的這些具有誘導突變作用的物質(zhì)屬于芳香烴類化合物。1977年，Nagao等[9]首次從燒焦的魚和肉中分離出HAAs。此后，已從熟肉制品中分離鑒定出30 多種具有致癌、致突變的雜環(huán)胺[10-11]。另外在咖啡[12]、酒精飲料[13]、油煙[14]、空氣[15]、香煙[16]、河水[17]、雨水[18]、柴油廢氣[19]、人體組織[20]、頭發(fā)[21]、母乳[22]中也檢測到不同種類和濃度的HAAs。

關(guān)于HAAs 致癌機制，在檢測手段優(yōu)化，抑制途徑等方面國外已展開了廣泛研究。在我國，這方面的研究起步較晚，近幾年也取得一系列成果。本文綜述了HAAs 的分類、危害、形成過程及分析等內(nèi)容，以增加消費者和食品工作者對HAAs 的認識和了解。

1 雜環(huán)胺的分類及危害

1.1 雜環(huán)胺的分類

HAAs 在其環(huán)系中含有2～5 個（通常為3 個）稠合芳環(huán)，其環(huán)系中具有1 個或多個氮原子，通常為1個環(huán)外氨基，除了Lys-P-1，harman 和norharman。按照產(chǎn)生的溫度可將HAAs 分為2種類型，熱解型HAAs 和熱型HAAs。肌肉加熱溫度超過300 ℃時產(chǎn)生熱解型HAAs 或非IQ 型；在100～300 ℃時形成的HAAs 稱為熱型HAAs、IQ 型或氨基咪唑烷，且熱型HAAs 的危害比熱解型HAAs 更大[23-26]。熱型HAAs 通常由游離氨基酸、肌酸酐或肌酸和己糖的反應(yīng)產(chǎn)生。雜環(huán)胺的結(jié)構(gòu)，名稱，縮寫，CAS 號以及特性等如表1所示。

1.2 雜環(huán)胺的危害

1993年，國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）將8種HAAs（MeIQ，8-MeIQx，PhIP，AαC，MeAαC，Trp-P-1，Trp-P-2，Glu-P-1）列為2B類致癌物，而將IQ 列為2A類致癌物并建議減少食用含有這些物質(zhì)的食物。2004年，IQ，MeIQ，8-MeIQx，PhIP 被列入美國國家毒理學計劃之中并將其認定為致癌物。2007年，世界癌癥研究基金和美國癌癥研究所報道稱過量食用紅肉和加工肉類與結(jié)腸直腸癌之間存在聯(lián)系[27]。且報告中建議，每人每周食用熟紅肉應(yīng)不超過500 g。Augustsson[28]和Becker[29]報道稱PhIP，MeIQx 和4，8-DiMeIQx 的成人平均日攝入量分別為63～72 ng/d，34～72 ng/d 和2～16 ng/d。雖然每日攝入量只有幾納克到幾十納克，但是流行病學研究表明結(jié)腸直腸癌風險值的增大與紅肉中含有HAAs 有關(guān)[30]。另一方面肉的種類、加工溫度、加工時間及加工方式等因素也會影響肉制品中HAAs 的含量。因此消費者對烹飪方式和飲食習慣的調(diào)整可以顯著減少這些化合物的攝入。

表1 雜環(huán)胺結(jié)構(gòu)式，名稱，縮寫和CAS 號，分子質(zhì)量及特性Table 1 Chemical structure of HAAs，name，abbreviation/ chemical name CAS No，molecular weight/ properties

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

1.2.1 雜環(huán)胺的致癌作用 大多數(shù)肉制品需要經(jīng)過煎、烤、烹、炸然后再被食用，而經(jīng)過高溫加工易產(chǎn)生HAAs。雖然HAAs 在加工肉制品中含量很低，且很難確定HAAs 的攝入數(shù)量，但是流行病學研究表明過量攝入含有HAAs 的加工肉制品與消化系統(tǒng)惡性腫瘤之間存在正相關(guān)[31-36]。Sinha等[37]報道稱女性長期過量食用高溫加工肉制品患乳腺癌的風險值為對照組的4.6 倍，且風險值與PhIP之間存在明顯的劑量關(guān)系。Nowell[38]和Butler[39]通過分析來自不同地區(qū)、年齡、種族等患有結(jié)腸直腸癌的人群與肉攝入量的關(guān)系，尤其參考烹飪方式、成熟度以及HAAs 的含量，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸直腸癌與成熟度高的肉制品的攝入量以及HAAs（尤其是MeIQx，DiMeIQx 和PhIP）之間存在正相關(guān)。此外，Kampman等[40]報道稱過量攝入含有HAAs 的肉制品患結(jié)腸直腸癌的風險值增大30%，且進一步研究發(fā)現(xiàn)HAAs 誘變性和結(jié)腸直腸癌風險值的增大與N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的催化修飾有關(guān)。以上研究結(jié)果表明，肉的加工熟度和加工溫度影響HAAs 的攝入量，且長期過量食用會提高癌癥發(fā)病率。因此消費者可以通過減少高溫烹飪?nèi)庵破返臄z入或選擇食用低溫肉制品從而達到減少HAAs 攝入量的目的。

1.2.2 雜環(huán)胺的代謝 HAAs 在中等酸性及堿性環(huán)境下較穩(wěn)定，也可在干燥低溫環(huán)境下保藏1年。雖然HAAs 屬于高效誘變劑，然而在哺乳動物細胞的基因毒性測定以及長期致癌性測定中，它們的誘變效力要弱得多[41]。當HAAs 進入動物體內(nèi)后，便變會被消化吸收并立刻擴散至全身。Turesky等[42]研究發(fā)現(xiàn)HAAs 主要通過嚙齒動物和人體內(nèi)的肝P450 1A2 代謝，以及肝外組織中的P450s 1A1 和1B1 代謝，即必須被代謝活化形成DNA 加合物的中間體，導致DNA 鏈斷裂，染色體畸變，才會誘發(fā)突變和致癌作用。其中生物活化途徑是通過細胞色素P450 酶（CYP）氧化環(huán)外胺基團產(chǎn)生具有基因毒性的N-羥基-HAA 代謝物[43]，而N-羥基化主要由CYP1A2 和CYP1A1 催化，但其它CYP 也參與其中[44]。如圖1所示，PhIP 在肝微粒體中在細胞色素P450 介導作用下經(jīng)CYP1A2 催化形成N-羥基化化合物；然后N-羥基化代謝物會進一步被N-乙酰轉(zhuǎn)移酶和N-磺基轉(zhuǎn)移酶進行II期酯化激活；最后N-乙酰氧基-PhIP 或N-磺酰氧基-PhIP 產(chǎn)生的芳基硝基離子與DNA 中的親核位點（主要在鳥嘌呤堿基上的C8 原子）反應(yīng)，形成dG-C8-PhIP 加合物[45]。此外，IQ 和MeIQx 形成活性中間體后，IQ 和MeIQx 上的C-5 原子會與脫氧鳥苷（dG）上的N2 原子之間形成加合物；IQ 和MeIQx 上的C-5 原子會與脫氧腺苷（dA）上的N6原子形成微量加合物[46-47]（圖2）。這說明HAAs 本身誘變效力和致癌作用很低，當進入動物或人體內(nèi)后通過酶的催化和激活形成加合物才具有誘變和致癌作用。另一方面也說明，肉制品本身并沒有危害，不能因高溫加工后可產(chǎn)生危害物質(zhì)而片面地認為食用肉制品有害健康，只要通過合理的加工即可減少甚至消除有害物質(zhì)。

圖1 PhIP 體內(nèi)代謝形成DNA 加合物的過程[45]Fig.1 Pathway of metabolic activation of PhIP leading to DNA adduct formation[45]

圖2 dG 和dA 與HAAs 之間形成的代表性DNA 加合物[46-47]Fig.2 Representative DNA adducts formed between dG and dA and HAAs[46-47]

2 HAAs 形成動力學

已知加熱溫度和加熱時間能夠顯著影響肉及肉制品中HAAs 的含量，且不同加熱溫度產(chǎn)生的雜環(huán)胺的種類也不同。例如，加熱溫度低于200 ℃時，在肉制品中檢測不到熱解型HAAs，而當加熱溫度高于250 ℃時，模擬體系中的熱型HAAs 卻顯著降低[48]。另一方面肌肉組織中常見的化合物如肌酸、肌酸酐、游離氨基酸、己糖以及部分小分子肽等是形成HAAs 的前體物質(zhì)。因此將這些化合物混合加熱，模擬肉制品在加熱時的外部環(huán)境，便能夠探究HAAs 受熱形成的熱動力學行為。Arvidsson等[49]用肌酐、肌肽、氨基酸和葡萄糖制備模擬體系探究極性HAAs 形成動力學，并提出了雜環(huán)胺形成遵循一級動力學（1），同時指出HAAs形成過程中溫度對速率常數(shù)的影響采用Eyring（2）方程進行分析而非典型的Arrhenius（3）方程，因為Eyring 方程給出了活化熵ΔS*，這可能反映了化學反應(yīng)機理。隨后，Arvidsson等[50]使用牛肉汁作為模型系統(tǒng)檢驗HAAs 形成動力學模型，進一步驗證了IQx類HAAs 的形成滿足動力學一階模型（1），并且溫度依賴性遵循Eyring 方程。Ahn等[51]采用動力學方法研究加熱時間、加熱溫度和前體物質(zhì)對真正肉系統(tǒng)中極性和非極性HAAs 形成的影響，結(jié)果表明極性和非極性HAAs 的形成依賴于加熱時間、加熱溫度和前體，并遵循一級動力學。但還需要進一步的研究了解前體與HAAs 形成之間的關(guān)系。這些研究表明在模擬體系中能夠很好地闡述HAAs 形成的動力學行為，然而肌肉體系與模擬體系不同，如肌肉的體系更為復雜，傳熱，傳質(zhì)也不同，且在加熱時因表面水分蒸發(fā)而形成硬殼，使得動力學行為計算變得更為復雜。

式（1）中：Ct——作為時間的函數(shù)HAAs 的濃度，mmol/L HAA/mmol 肌酸酐；C0——形成HAAs的化合物的濃度，mmol HAA/mmol 肌酸酐；t——加熱時間，min；k1——降解C0的速率常數(shù)，同時也是形成Ct的速率常數(shù)，min-1；k2——HAAs 降解速率常數(shù)，min-1。

式（2）中：κ——速率常數(shù)；kb——玻爾茲曼常數(shù)；h——普朗克常數(shù)；T——溫度，K；R——氣體常數(shù)（8.314 J/mol/K）；ΔG——活化的自由能，kJ/mol。

式（3）中：κ——速率常數(shù)，min-1；Ea——反應(yīng)所需的最小能量，J/mol；R——氣體常數(shù)（8.314 J/K/mol）；T——溫度，K；A——1 個預先指數(shù)因素。

3 雜環(huán)胺的形成機制

HAAs 結(jié)構(gòu)多樣且形成機制復雜。研究人員提出，HAAs 的形成是游離氨基酸、肌酸、肌酸酐、單糖、二糖或二肽縮合的結(jié)果，另外這些物質(zhì)都可以在高溫烹飪過程中充當HA 的前體。在高溫烹飪?nèi)忸悤r，有許多形成HAAs 的途徑，如美拉德反應(yīng)途徑和自由基反應(yīng)途徑。己糖和氨基酸之間通過美拉德反應(yīng)形成的雜環(huán)吡啶和吡嗪經(jīng)Strecker 醛和肌酸（酐）的參與通過自由基反應(yīng)進一步轉(zhuǎn)化產(chǎn)生咪唑并喹喔啉。當加熱溫度超過300 ℃時，通過自由基反應(yīng)產(chǎn)生許多反應(yīng)性片段。這些片段可以縮合形成新的雜環(huán)結(jié)構(gòu)同時熱解誘變劑可能通過自由基反應(yīng)形成。Jagerstad[52]和Murkovic[53]推測美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物吡啶和吡嗪是由Strecker 降解產(chǎn)生，經(jīng)過醛醇縮合形成HAAs。Lee等[54]向煮沸的豬肉汁中分別添加了4種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，其中添加四氫噻吩和2，3-二甲基吡嗪觀察到致突變性增強，表明這2種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可能參與煮沸的豬肉汁中IQ 型誘變劑的形成；然而，添加2-乙酰吡咯和咪唑極大地抑制了豬肉汁的致突變性，故美拉德反產(chǎn)物也能抑制誘變劑的形成。Pearson等[26]認為二烷基吡嗪自由基和肌酸酐反應(yīng)產(chǎn)生MeIQx 和4，8-DiMeIQx。Milic等[55]認為HAAs 的產(chǎn)生是美拉德反應(yīng)和自由基機制共同作用的結(jié)果。以上結(jié)果表明，僅一個理論或反應(yīng)機制無法清楚地解釋HAAs 的形成過程，它是多個理論和反應(yīng)機制共同作用的結(jié)果。單獨的幾種成分混合反應(yīng)形成HAAs，只能說明這些物質(zhì)能夠形成HAAs，而肉制品是一個相對復雜的體系，是否還有其它成分在HAAs 的形成中起到關(guān)鍵性作用，依然未知。

許多研究闡述了PhIP 的產(chǎn)生機制，現(xiàn)在已經(jīng)清楚地證明PhIP是由苯丙氨酸與肌酸/肌酐反應(yīng)產(chǎn)生的。Felton等[56]將Phe（Phenylalanine，苯丙氨酸）和肌酸加熱反應(yīng)生成了PhIP。其中，來自Phe的3 個碳原子，氨基氮和完整的苯環(huán)被結(jié)合到PhIP 中，以及來自標記的肌酸的甲基碳，1-氮和氨基氮。這表明Phe 上的碳原子形成吡啶部分，肌酸形成咪唑部分。Zochling等[57]在模型試驗中鑒定了PhIP 的形成經(jīng)歷了以下反應(yīng)步驟：首先，通過Strecker 降解由苯丙氨酸形成苯乙醛，而肌酸經(jīng)過加熱環(huán)化形成肌酸酐；形成的苯乙醛與肌酸酐通過醛醇縮合反應(yīng)形成中間產(chǎn)物；最后經(jīng)過一系列的縮合環(huán)化生成PhIP。反應(yīng)機理如圖3所示。從反應(yīng)過程可以看出，PhIP 的生成不需要葡萄糖的參與，從而進一步說明美拉德反應(yīng)不是生成HAAs的唯一途徑。

圖3 模型體系中PhIP 的生成機制[57]Fig.3 Mechanism of formation PhIP in model systems[57]

β-咔啉類HAAs 主要通過氨基酸或小分子肽熱解而成，其中較為常見的為Norharman 和harman。相比于其它β-咔啉類HAAs，Norharman 和harman 的反應(yīng)可以在較低的溫度下形成，且多存在于熟肉、魚和肉提取物中[58]。關(guān)于Norharman 的形成，Monnier等[59]提出了相關(guān)生成途徑（如圖4）。首先呋喃糖形式的色氨酸Amadori 重排產(chǎn)物（ARP）（1）經(jīng)歷脫水反應(yīng)，然后通過環(huán)氧的孤對電子輔助的β-消除形成共軛氧鎓離子。該反應(yīng)性中間體可以通過脫水形成延伸的共軛體系進一步穩(wěn)定自身，或者進行C-C 鍵裂解以產(chǎn)生中性呋喃衍生物（3）和亞胺陽離子（4）。最后，中間體進行分子內(nèi)親核取代反應(yīng)以形成β-咔啉。而其它咔啉通常在高于300 ℃條件下經(jīng)過氨基酸熱解形成。

圖4 色氨酸Amadori 重排產(chǎn)物形成Norharman 的機制[59]Fig.4 Mechanism of formation Norharman from tryptophan Amadori rearrangement product[59]

4 雜環(huán)胺的分析

4.1 樣品前處理

雖然加工肉制品中含有許多種類的HAAs，但是它們在肉制品中的含量僅為ng/g，且存在極性和非極性2種類型。因此分離純化肉制品中的HAAs是眾多研究人員致力解決的一個問題。目前最長見的HAAs 樣品制備方法為固相萃取法[60]。該方法最早由Gross等[61]提出，該方法主要包含3 個部分，即堿化，提取和分離純化。首先采用強堿溶液如NaOH 將肉制品堿化；然后將堿化后的樣品與吸附劑（如硅藻土）和有機試劑（如乙酸乙酯或二氯甲烷等）等混合萃?。蛔詈蟛捎么?lián)的PRS（丙基磺酸）和C18 固相萃取小柱作為陽離子交換劑將提取的HAAs 進行凈化分離。目前大多數(shù)方法均以此為基礎(chǔ)經(jīng)過不斷優(yōu)化得來，如采用OASIS MCX 柱替換PRS 和C18 固相萃取以及更換洗脫溶劑和洗脫順序，可以實現(xiàn)HAAs 的一步凈化[62]；或?qū)aOH 和甲醇與肉制品混合后均質(zhì)離心，實現(xiàn)HAAs 一步萃取[63]。Gross 系列方法雖然在HAAs 檢測中應(yīng)用廣泛，但是流程繁瑣，耗時長，且回收率較低。為了簡化HAAs 的前處理方法，Khan等[64]用高壓密封液態(tài)提取法提取HAAs，成功的將提取時間縮短了近4 倍。Ruiz等[65]采用單滴微萃取提取和測定MeIQx，極大地簡化和縮短了HAAs的提取過程和提取時間。Cooper等[66]采用中空纖維膜液相微萃取來萃取HAAs，從而實現(xiàn)堿性樣品和低酸性樣品的處理和檢測。以上研究說明無論采用哪種處理方法，均不能完全將HAAs 從肉制品中提取出來，且HAAs 具有極性和非極性2種類型，這也為樣品的處理和提取帶來了難度。因此開發(fā)高回收率和高選擇性的前處理方法尤為重要。

4.2 雜環(huán)胺的檢測

HAAs 的測定方法多采用不同檢測系統(tǒng)的電泳或色譜技術(shù)，如毛細管電泳法[67]，薄層色譜法[68]，酶聯(lián)免疫法[69]，氣相色譜法-質(zhì)譜法[70]，液相色譜-質(zhì)譜法[71]等。最常用的HAA 分離技術(shù)是高效液相色譜（HPLC）與紫外線（UV）和熒光檢測串聯(lián)質(zhì)譜（MS）相結(jié)合[60]。液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）是定性和定量大多數(shù)HAAs 的重要方法，并結(jié)合熱噴霧離子化[72]，電噴霧離子化（ESI）[73]或2種方式組合[74]。此外Barcelo等[75]使用超高效液相色譜（UHPLC）-MS/MS 在2 min 內(nèi)實現(xiàn)對16種HAAs 進行靈敏、可重復的定性、定量測定。Samy等[76]采用含有四極桿飛行時間質(zhì)譜的LC-MS 測定了氣溶膠中9種水溶性HAAs。雖然HPLC 在HAAs 的檢測中應(yīng)用較廣泛，但是HPLC 選擇性較低，當基質(zhì)較為復雜時分離效果不理想。此外受檢測極限的限制，無法對痕量HAAs 進行檢測。因此需要開發(fā)和引入一種選擇性高和靈敏度強的檢測方法。

相比于液相色譜，氣相色譜（GC）具有更高的選擇性，可應(yīng)用于肉制品中多種HAAs 的同步檢測。然而HAAs是非揮發(fā)性物質(zhì)，使用氣相色譜法測定時氣相色譜柱上往往會過度保留，從而導致色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。因此使用氣相色譜法測定時，需要采用衍生化的方式（如酰基化、烷基化、硅烷化）降低HAAs 的極性[12]，提高HAAs 的揮發(fā)性和分離度。然而，衍生化過程操作復雜，衍生效率的誤差很大，使得氣相色譜法在HAAs 測定中的應(yīng)用受到限制。

5 展望

肉制品烹飪會產(chǎn)生誘人的芳香氣味，同時也保證了微生物學上的安全。然而肉制品在高溫加工過程中易形成HAAs。本文對近年來肉制品中HAAs 的危害和形成機制研究簡單進行了介紹。目前仍有許多方面需要進一步完善。首先，HAAs 致癌、致突變作用機制尚不清楚。HAAs 的致癌、致突變主要與HAAs 在人或動物體內(nèi)的代謝有關(guān)。通過鑒定代謝過程中的生物標志物，參與代謝（激活和解毒）及DNA 修復酶能夠闡明這些化學物質(zhì)在人體內(nèi)的吸收過程。但代謝過程中形成的標志性中間產(chǎn)物依然不清楚，且對于這些中間產(chǎn)物的檢測依然缺乏相關(guān)檢測方法。其次，HAAs 的形成機制不明確。雖然在模型體系中已經(jīng)揭示了部分HAAs 的形成機制，但在模型系統(tǒng)中相互反應(yīng)的物質(zhì)較少，而肉制品的構(gòu)成比較復雜，因此模型體系不能夠準確說明HAAs 的產(chǎn)生機制。再次肉制品中HAAs 的提取回收率較低，檢測技術(shù)需要進一步完善。目前，樣品前處理回收率在50%～70%左右，而對于個別HAAs 回收率更低。此外，雖然HPLC-MS/MS 和GC-MS等檢測技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于HAAs 的檢測，但HPLC 的選擇性較低，當基質(zhì)較為復雜時分離效果不理想；GC 在測定HAAs時需要先將HAAs 衍生成低極性化合物，而目前提出的酰基化、烷基化、硅烷化等衍生化技術(shù)尚不成熟，因此限制了該方法的推廣。最后，消費者對HAAs 的危害了解甚少。相關(guān)部門及媒體應(yīng)該加大宣傳教育，提倡多吃低溫肉制品，減少食用肉制品的焦糊部分，提高消費者的食品安全意識。