太行雞胚PRLR基因表達與主翼羽和覆主翼羽長關系

杜小龍，張樂超，趙麗杰，喬 寧，高 明，李蘭會,3*,李祥龍

(1.河北農業(yè)大學 動物科技學院，河北 保定071000；2.華裕農業(yè)科技有限公司，河北 邯鄲056000；3.河北省牛羊胚胎工程技術研究中心，河北 保定071000；4.河北科技師范學院，河北 秦皇島，066004)

羽型是判定雛雞性別的重要表型性狀之一，其中主翼羽和覆主翼羽長度差異是在雞胚生長過程中形成[1]。最早研究發(fā)現(xiàn)慢羽K基因和禽內源白血病毒ev21存在連鎖關系，并且普遍認為ev21病毒插入導致慢羽表型的形成[2-3]；后續(xù)研究重新定位K基因為包含催乳素受體(PRLR)在內的基因重復[4-7]，2015年本課題組驗證了PRLR基因的部分重復序列是導致羽型差異的分子基礎，并且發(fā)現(xiàn)ev21與K基因并非緊密連鎖[2,8]，TAKENOUCHI等[9]也發(fā)現(xiàn)ev21整合不是慢羽的分子基礎。PRLR基因定位在雞Z染色體，其編碼蛋白催乳素受體PRLR包含1個跨膜域[10-13]。PRLR與其配體催乳素PRL結合可以影響甲狀腺激素分泌和NaCl再吸收等從而對雞胚的發(fā)育起關鍵作用[14]，有研究表明PRLR抑制毛囊發(fā)育[2,15]。PRLR基因轉錄產生多種剪切體，編碼不同類型的膜結合型蛋白，其主要區(qū)別為胞外域的組成成分和序列的長度[2,16]。雞PRLR的Ⅰ型剪切體(PRLRS1)，受組織特異性啟動子P1調控，主要在成年雞小腸和腎表達，而種屬特異啟動子P2調控的Ⅱ型剪切體(PRLRS2)在成年雞和胚胎組織中廣泛表達，并且P2啟動子與人、大鼠和小鼠廣泛表達的PRLR通用啟動子PⅢ具有高度同源性[17]。PRLR多種轉錄剪切體與其信號傳導途徑的多樣性以及配體功能多樣性、組織表達的廣泛性相適應。在不同組織通過不同轉錄產生剪切體，發(fā)揮其各自功能[2,18]。

本研究對快慢羽太行雞胚發(fā)育過程中翅羽皮膚組織PRLR基因的不同剪切體表達進行分析，并檢測快慢羽雞胚主翼羽和覆主翼羽長度變化，以揭示羽型形成與PRLR基因表達調控間關系，為快慢羽雞主翼羽和覆主翼羽長度差異形成研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料62枚18胚齡和67枚19胚齡太行雞胚翅膀皮膚組織、主翼羽和覆主翼羽、肝臟均采集于河北農業(yè)大學太行雞孵化室；Easy Pure Genomic DNA Kit、TransZolTMUp PlusRNAKit、TransScriptROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMIX、Trans 2K Plus DNA Marker均購自北京全式金公司；Super GelRedR、2×ES Taq MasterMix(Dye)購自保定康為世紀公司；引物合成及測序由華大科技公司完成。

1.2 主翼羽和覆主翼長度測量分別收集雞胚右翅由內向外第1，2，3根主翼羽和覆主翼羽，測量長度(mm)，3根翅羽長度的平均值作為主翼羽和覆主翼羽的長度。

1.3 DNA、RNA提取及cDNA合成使用Easy Pure Genomic DNA Kit、TransZol TM Up Plus RNA Kit分別對肝臟、翅膀皮膚組織進行處理，提取DNA及總RNA。使用反轉錄試劑盒Trans ScriptROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super MIX將RNA合成cDNA。

1.4 太行雞胚羽型和性別檢測參考張秀玲等[6]試驗結果，合成羽型半定量鑒定引物1305和857；參考胡銳穎等[19]合成性別鑒定引物450-650。羽型和性別檢測擴增體系為：DNA 0.5 μL，Mix 5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)分別0.5 μL，ddH2O補足10 μL。PCR程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，退火30 s，72℃延伸 1 min 30 s，23～35個循環(huán)；72℃延伸10 min(表1)。

1.5 PRLR剪切體半定量檢測

1.5.1引物設計 NCBI下載PRLR的3種剪切體序列。Ⅰ型剪切體(PRLRS1，NM_204854.1)包含外顯子3(133 bp)，缺少外顯子8(121 bp)；Ⅱ型剪切體(PRLRS2，GQ184574.1)缺少外顯子3和8；Ⅲ型剪切體(PRLRS3，JX560222.1)有外顯子3和8。利用Primer Premier 5.0設計引物PR2和PR3，并用NCBI數(shù)據(jù)庫檢測引物特異性(表1)。

表1 試驗用引物信息

利用引物PR2和PR3進行PCR擴增，檢測雞胚翅皮膚組織PRLR剪切體存在類型(圖1)。PR2擴增得到180 bp產物表明PRLRS2表達，得到313 bp 產物說明PRLRS1或/和PRLRS3表達；PR3擴增得到361 bp產物表明PRLRS1或/和PRLRS2剪切體表達，得到482 bp說明PRLRS3有表達。

圖1 PRLR剪切體與引物示意圖

1.5.2PRLR剪切體表達的半定量分析 將目的片段引物設置退火溫度梯度或循環(huán)次數(shù)梯度，確定引物擴增到達平臺期前的最適退火溫度及循環(huán)數(shù)，與β-actin內參引物在同一條件下同時擴增。分別取2 μL 擴增產物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，每個樣本的目的產物與β-actin內參產物在同一膠孔，通過產物大小確定雞胚翅皮膚組織PRLR剪切體類型，使用Image J軟件檢測分析內參條帶與目的條帶灰度值(亮度)，以兩者的灰度值比值來表示不同剪切體相對表達量。

PCR反應體系：0.4 μL cDNA，2×Es Taq MasterMix 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，無核酸酶純水補足至10 μL。

PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火60℃ 30 s，72℃ 10 s，循環(huán)35次；72℃ 延伸10 min；4℃保存。

1.6 數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0一般線性模型分析胚齡、性別和羽型因素對主翼羽和覆主翼羽長和PRLR剪切體表達影響；單因素方差分析性別和胚齡對不同羽型雞羽長變化和PRLR基因剪切體表達變化，組間進行Duncan多重比較，α=0.05為影響顯著。

2 結果

2.1 DNA、總RNA提取及cDNA合成DNA、RNA和PCR產物經1%瓊脂糖電泳檢測，可見條帶致密、整齊、清晰無拖尾，PCR擴增特異性強，沒有非特異性條帶和引物二聚體出現(xiàn)，片段長度與預期一致，完全滿足后期試驗。圖2為肝臟組織提取的基因組DNA、皮膚組織提取的總RNA和以cDNA為模板擴增內參基因β-actin 的凝膠檢查結果。

圖2 DNA(A)、RNA(B)和β-actin(C)凝膠電泳檢測 A.太行雞肝臟組織提取基因組DNA;B.皮膚組織提取總RNA;C.以太行雞cDNA為模板擴增內參基因β-actin的凝膠檢查結果。M.DL5000 DNA Marker；1～5.樣品

2.2 羽型和性別鑒定羽型性別鑒定檢測結果顯示857 bp為快羽慢羽表型，均有GHR基因擴增條帶；1 305 bp為慢羽雞PRLR重復特異條帶。PCR產物經1%瓊脂糖電泳檢測，可見條帶清晰無拖尾，PCR擴增特異性強，沒有非特異性條帶和引物二聚體出現(xiàn)，片段長度預期片段長度一致，完全滿足下一步試驗(圖3)。

圖3 太行雞羽型(A)和性別(B)鑒定 A.羽型檢測結果(5,6,8.慢羽雞PCR產物;1,2,3,4,7.快羽雞PCR產物);B.性別鑒定結果(1,4.公雞;2,3,5,6,7,8.母雞)

2.3 主翼羽和覆主翼羽長度變化一般線性模型分析18胚齡(E18)和19胚齡(E19)不同性別快慢羽太行雞胚的主翼羽和覆主翼羽毛長，結果顯示胚齡和羽型對主翼羽和覆主翼羽長度影響的主效應均極顯著存在(P<0.01)，而性別不影響太行雞主翼羽和覆主翼羽長度(P>0.05)(表2)。

進一步分析E18和E19的快慢羽太行雞胚主翼羽和覆主翼羽毛長，結果顯示快羽雞18和19胚齡的主翼羽均長于覆主翼羽1.5 mm以上(P<0.05)，而慢羽雞主翼羽略長于覆主翼羽0.4 mm以上(P>0.05)。18和19 胚齡的快慢羽雞胚主翼羽長存在顯著差異(P<0.05)，快羽和慢羽雞胚的主翼羽長在18胚齡已經表現(xiàn)出顯著差異，快羽雞兩個胚齡的主翼羽均顯著長于慢羽雞2 mm左右。快羽雞18胚齡的覆主翼羽長長于慢羽雞1 mm(P<0.05)，而在19胚齡時，兩羽型間覆主翼羽長度沒有顯著差異(P>0.05)。太行雞快慢羽型間主翼羽在18～19胚齡已經表現(xiàn)并維持長度差異，覆主翼羽在18胚齡同樣表現(xiàn)出長度差異，但19胚齡兩羽型間覆主翼羽長度差異基本消失，快羽雞覆主翼羽生長速度降低(表3)。

表2 胚齡、性別和羽型對太行雞主翼羽和覆主翼羽長度主效應的影響

2.4 PRLR基因剪切體半定量結果129枚雞胚翅羽皮膚中均檢測到PRLRS1和PRLRS2剪切體的各自目的帶313和180 bp以及與PRLRS1/PRLRS2共同表達目的條帶361 bp，未檢測到PRLRS3目的條帶482 bp，說明太行雞皮膚組織中存在PRLRS1和PRLRS2兩種剪切體類型。利用目的條帶313和180 bp 的灰度值分別與內參目的條帶139 bp灰度值做比較，作為PRLRS1和PRLRS2剪切體的相對表達量(圖4)。

表3 兩種胚齡的快慢羽太行雞的主翼羽和覆主翼羽長度變化 mm

圖4 PRLR剪切體凝膠電泳檢測 1～5中361 bp條帶為PR3引物擴增產物;6～10中313 和180 bp條帶為PR2引物擴增產物；1～10中139 bp 條帶為β-actin引物PCR產物；M.DL5000 DNA Marker

2.5 羽型、胚齡和性別對PRLR剪切體表達影響胚齡、性別和羽型與PRLR兩種剪切體表達量關系結果表明，18和19胚齡兩種剪切體表達并沒有顯著性差異(P> 0.05)，不同性別之間也沒有顯著性差異(P> 0.05)，胚齡、性別對PRLRS1和PRLRS2表達都沒有影響。但兩種羽型間PRLRS2表達有顯著差異(P< 0.05)，說明PRLRS2表達可能是導致19胚齡后快慢羽羽長表型差異的主要原因，需進一步分析不同羽型的剪切體表達日齡變化(表4)。

2.6 兩種羽型的PRLRS1、PRLRS2表達隨日齡變化18和19胚齡剪切體PRLRS1表達量在快羽或慢羽系中并沒有隨時間推移發(fā)生顯著性變化(P>0.05)(圖5A)；剪切體PRLRS2表達量在18胚齡快、慢羽系間也沒有顯著差異(P>0.05)，但在19胚齡時慢羽表達量顯著高于快羽(P<0.05)(圖5B)。

表4 羽型、胚齡和性別對PRLR剪切體表達影響

3 討論

雞的羽毛顏色與其品種品系鑒定有關，在蛋雞的配套系生產中利用羽型進行商品代性別鑒定，PRLR基因的重復與慢羽表型連鎖，但是PRLR基因如何調控羽型形成尚不明確。羽型基因是伴性遺傳基因，并影響羽毛發(fā)育脫換[20]。婁義洲等[21]發(fā)現(xiàn)武農I系烏骨雞的主翼羽和覆主翼羽長度差異隨生長階段不同發(fā)生變化，第2周齡開始快慢羽雞之間的毛長差異隨著日齡增長而減小[22]。趙彩娟等[23]測定2～10周齡壩上長尾雞翅羽長度，沒有發(fā)現(xiàn)不同羽型公雞2～10周齡主翼羽長度的顯著差異，但是不同羽型母雞的主翼羽長度具有顯著差異。本課題組對18和19胚齡快慢羽太行雞的主翼羽和覆主翼羽長度及PRLR基因表達進行研究，發(fā)現(xiàn)快羽雞的主翼羽均長于慢羽雞2 mm左右；18胚齡的快羽雞覆主翼羽長于慢羽雞，而19胚齡時快、慢羽雞覆主翼羽長度沒有差異，源于19胚齡時快羽雞覆主翼羽生長速度降低。另外，兩個胚齡快羽雞主翼羽平均長于覆主翼羽1.7 mm左右，而慢羽雞主翼羽僅長于覆主翼羽0.4 mm左右。認為是快羽太行雞19胚齡覆主翼羽生長速度較慢羽雞快、慢羽表型形成差異的原因之一。

圖5 兩種胚齡兩種羽型雞胚皮膚組織PRLRS1(A)和PRLRS2(B)表達變化

另外，本研究發(fā)現(xiàn)在不同羽型太行雞皮膚組織中不存在PRLRS3剪切體，這與BU等[24]和CHEN等[25]在雞與鴿子上的研究結果一致。孵化期剪切體PRLRS1的表達在快慢羽間無顯著差異，而PRLRS2在19胚齡的慢羽雞表達顯著高于快羽，這與19胚齡慢羽雞的覆主翼羽生長速度的加快相對應。但剪切體PRLRS2在快慢羽雞19胚齡的表達差異，是否影響覆主翼羽的生長變化，還需要深入細胞培養(yǎng)試驗深入研究。馮宇等[26]發(fā)現(xiàn)慢羽雞PRLR的mRNA表達高于快羽，但是蛋白表達無差異，BU等[24]發(fā)現(xiàn)PRLRS2與cPRL共轉染不能激活HepG2細胞熒光素酶活性，說明PRLRS2在毛囊發(fā)揮作用的方式可能和PRLRS1不一樣，是否PRLRS2可以和PRL結合需要進一步驗證。垂體組織未形成的早期雞胚中已有cPRL-L的廣泛表達[27]，PRL與PRLR相互影響，共同調控催乳素信號通路。在鼠和牛的研究中發(fā)現(xiàn)PRL與PRLR基因敲出或突變影響被毛的生長循環(huán)及其長度[28-30]。非哺乳動物家禽的PRLR基因表達變化，尤其是PRLRS2在慢羽雞19胚齡的高表達可能與其調控覆主翼羽的生長有關。其中PRLRS2與PRL如何通過催乳素信號系統(tǒng)發(fā)揮羽毛生長作用，現(xiàn)在不得而知，因此關于太行雞PRLR剪切體如何調控主翼羽和覆主翼羽生長還需進一步研究。