杜鵑組培微枝試管外生根影響因素研究

王愛芝 王清君 劉運(yùn)偉

摘要： ?對(duì)杜鵑組培微枝試管外生根影響因素研究的結(jié)果表明，基質(zhì)類型、基質(zhì)處理方法、基質(zhì)含水率、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑均對(duì)生根率有很大影響。在杜鵑無菌莖芽增壯培養(yǎng)基中添加0.8 μmol/L的2-ip培養(yǎng)7～8周，用300 mg/L的GGR速蘸莖芽基部，扦插在均勻拌入菌蟲雙殺0.84 g/L的純草炭土中（pH值5.8，含水率75%），在室內(nèi)組培馴化室進(jìn)行試管外生根可得到較好的生根效果。

關(guān)鍵詞： ?杜鵑; ?組織培養(yǎng); ?微枝; ?試管外生根

中圖分類號(hào)： ? S 722. 3 + 7， ?S 685. 21 ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ? A ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：1001 - 9499（2020）02 - 0010 - 04

杜鵑（Rhododendron）是杜鵑花科植物中種類最多的一個(gè)屬，原產(chǎn)于北美洲、西歐和北亞，目前共發(fā)現(xiàn)1 000多種[ 1 ]。杜鵑的花期長(zhǎng)，從冬末到初夏皆可開花，且花色種類豐富，被廣泛用作風(fēng)景林地的觀賞植物。此外，杜鵑還具有環(huán)境監(jiān)測(cè)功能，可以作為NO和NO2等氣體的敏感監(jiān)測(cè)樹種[ 2 ]。我國(guó)從20世紀(jì)80年代開始進(jìn)行杜鵑組織培養(yǎng)的研究，并取得了一定進(jìn)展。楊乃博等以毛葉杜鵑葉片為外植體培養(yǎng)得到再生植株[ 3 ];有的學(xué)者用組培苗的葉片作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)獲得成功[ 4 ];鐘宇對(duì)西洋杜鵑的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)獲得成功[ 5 ];程雪梅對(duì)馬纓杜鵑的莖尖、莖段、葉片、根等進(jìn)行組織培養(yǎng)，以建立其快繁技術(shù)[ 6 ];宋慧娟和莊雪影對(duì)毛棉杜鵑的組織培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化[ 7 ];吳影倩等對(duì)2種杜鵑雜交種不定芽生根培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化[ 8 ]。目前，我國(guó)已經(jīng)初步建立了杜鵑組培快繁體系，但杜鵑品種間的差別大、莖葉等外植體消毒難、不定芽分化率低、優(yōu)良品種生根困難和移栽成活率低等問題，仍是杜鵑花組織培養(yǎng)中急需研究和解決的問題。

試管外生根技術(shù)是杜鵑組織培養(yǎng)難題的突破口，它將組培莖芽的生根誘導(dǎo)和馴化培養(yǎng)兩個(gè)過程合二為一，即直接將無菌莖芽扦插到試管外有菌環(huán)境中，在誘導(dǎo)生根的同時(shí)進(jìn)行馴化培養(yǎng)[ 9 ]。目前，以頂芽和腋芽為外植體大量繁殖杜鵑無根莖叢的技術(shù)已經(jīng)成形[ 10 - 15 ]。為了縮短育苗周期，降低生產(chǎn)成本，在短期內(nèi)得到大量健壯的杜鵑苗，本研究以經(jīng)壯苗培養(yǎng)的杜鵑無根莖叢為材料，扦插在不同基質(zhì)上，通過控制基質(zhì)的含水量和培養(yǎng)條件，找到影響杜鵑試管外生根的主要因素和適合杜鵑試管外生根的最佳條件，進(jìn)而生產(chǎn)大量苗木以滿足日益增大的市場(chǎng)需求，為杜鵑實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供更廣泛的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為從美國(guó)引進(jìn)的杜鵑雜交種最佳組培系10瓶，品種為Rhododendron'western's Prink Diamond'，是R. dauricum×R. minus×R. mucronatum的雜交種。該杜鵑品種生長(zhǎng)旺盛，早春開花，花粉色雙邊，鈴鐺狀花形;冬季半數(shù)葉片呈綠色，其余葉片呈紅褐色。該品種兼具有幾個(gè)親本的優(yōu)良特性，可在一定程度上克服杜鵑適應(yīng)性及抗寒性差的缺陷。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 杜鵑無菌莖芽增壯培養(yǎng)

做無菌莖芽增壯培養(yǎng)時(shí)，將杜鵑莖芽從培養(yǎng)瓶中取出，去葉至頂芽處留3～4片小葉。將頂芽剪下并垂直接種到培養(yǎng)基中，剩余部分則剪成1.0～1.5 cm長(zhǎng)的莖段，水平接種在培養(yǎng)基上。將杜鵑頂芽和莖段分別接種，每個(gè)瓶中接種10個(gè)外植體。增壯培養(yǎng)基為：WPM+蔗糖25 g/L+瓊脂7 g/L，添加不同濃度的細(xì)胞分裂素2-ip（0 μmol/L和0.8 μmol/L），pH值5.8。采用日光燈照射，進(jìn)行光照培養(yǎng)，每天22 h光照/2 h黑暗或全光照培養(yǎng)，溫度25±2 ℃，濕度70%～80%。培養(yǎng)7周后，調(diào)查0 μmol/L和0.8 μmol/L濃度2-ip對(duì)杜鵑莖芽質(zhì)量的影響，測(cè)定苗高和半木質(zhì)化的外植體數(shù)，然后進(jìn)行組培莖叢微枝扦插。

1. 2. 2 杜鵑組培莖叢微扦插

在事先澆好水的移栽基質(zhì)上均勻打出約1.5 cm深的小孔，為了保證生根一致，將杜鵑試管苗去葉至頂芽處保留4～6片葉子，得到約3 cm高的莖芽。將小苗插入基質(zhì)的孔中，壓實(shí)后在葉面上噴水蓋上蓋子培養(yǎng)。培養(yǎng)在25 ℃左右，濕度60%～70%，每天光照16 h/黑暗8 h的培養(yǎng)室中。微扦插時(shí)，瓶苗從無菌狀態(tài)的高溫、高濕、弱光的環(huán)境過渡到有菌狀態(tài)的自然條件，為了適應(yīng)微扦插后的較低濕度以及較強(qiáng)的光照，需先將無菌芽放到煉苗室內(nèi)煉苗3～7 天。

1. 2. 3 杜鵑無菌莖芽試管外生根

移栽基質(zhì)的種類和組分決定了該基質(zhì)的特性，并對(duì)無根苗的生根和生長(zhǎng)造成直接影響。根據(jù)杜鵑喜酸的特性，本試驗(yàn)選用5種移栽基質(zhì)扦插杜鵑組培莖芽，分別為購自昆明的粗草炭土、購自昆明的細(xì)草炭土、購自黑龍江省朗鄉(xiāng)林業(yè)局的草炭土、購自黑龍江省朗鄉(xiāng)林業(yè)局的草炭土與沙子等比例混合、純沙子，將基質(zhì)分裝在培養(yǎng)盒內(nèi)，基質(zhì)至盒身高度的3/5處，將其壓實(shí)，澆水待移栽。按照土壤pH值的測(cè)定方法[ 15 ]，測(cè)定5種移栽基質(zhì)的pH值和含水量。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)開展以下試驗(yàn)：（1）移栽基質(zhì)試驗(yàn)。在5種基質(zhì)中進(jìn)行微扦插培養(yǎng)，每個(gè)處理最少130株，設(shè)3次重復(fù);培養(yǎng)8周后，調(diào)查平均生根率，篩選出最佳移栽基質(zhì)。（2）基質(zhì)處理方法試驗(yàn)。采用不同方法處理最佳基質(zhì)，一是在基質(zhì)中按比例攪拌菌蟲雙殺（山東省青州市日中經(jīng)貿(mào)有限公司生產(chǎn)）0.84 g/L，二是對(duì)基質(zhì)進(jìn)行高溫滅菌，三是不處理，每個(gè)處理40株，設(shè)3次重復(fù);培養(yǎng)8周后，調(diào)查平均生根率，篩選出最佳基質(zhì)處理方法。（3）基質(zhì)含水率試驗(yàn)。設(shè)4種不同含水率，水體積與基質(zhì)體積之比分別為3∶20，4∶20，5∶20和6∶20，每個(gè)處理120株，3次重復(fù)。培養(yǎng)6周后，調(diào)查試管外生根率和苗高增長(zhǎng)量，確定基質(zhì)最佳含水率。（4）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑試驗(yàn)。基于以上3項(xiàng)試驗(yàn)得到的最佳基質(zhì)配置，采用NAA、IBA、ABT1、ABT2和GGR等5種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，每種均采用50、100、200和300 mg/L4個(gè)水平，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，用速蘸法進(jìn)行微枝扦插，培養(yǎng)8周后，調(diào)查試管外生根率、苗高、地徑、根數(shù)和根長(zhǎng)等指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 壯苗期2-ip濃度對(duì)杜鵑莖芽質(zhì)量的影響

由不同2-ip濃度對(duì)杜鵑莖芽質(zhì)量的影響（表1）可以看出，壯苗期間添加不同濃度的2-ip，對(duì)杜鵑莖芽的生長(zhǎng)和增殖影響存在差異。添加0.8 μmol/L 2-ip的無根莖芽，不論是平均苗高還是半木質(zhì)化百分率，均優(yōu)于未添加2-ip的處理，因此應(yīng)在培養(yǎng)基中添加0.8 μmol/L 2-ip。

2. 2 移栽基質(zhì)對(duì)杜鵑組培莖芽試管外生根的影響

據(jù)測(cè)定，昆明和朗鄉(xiāng)純草炭的pH值均呈酸性，沙子的pH值則接近中性，朗鄉(xiāng)草炭和沙子等比例混合的基質(zhì)pH值居于二者之間。在不同基質(zhì)中微扦插培養(yǎng)8周后，調(diào)查試管外生根率。由不同移栽基質(zhì)對(duì)杜鵑試管外生根率的影響（表2）可以看出，以純沙子為基質(zhì)，試管外生根率為8.1%，推測(cè)其不適合杜鵑試管外生根;用草炭和沙子為基質(zhì)，生根率為10.9%;在昆明粗草炭和細(xì)草炭2種基質(zhì)上進(jìn)行微扦插的杜鵑無根苗，死亡率分別為7.9%和5.4%，雖然死亡率不高，但最終生根率只達(dá)到57.4%和40.0%，所以也不是杜鵑試管外生根最佳的移栽基質(zhì);在朗鄉(xiāng)草炭土上微扦插苗的死亡率僅為9.2%，且平均生根率也最高，說明黑龍江省朗鄉(xiāng)草炭土較適合杜鵑無根苗試管外生根。由此可知，購自黑龍江朗鄉(xiāng)pH值為5.82的草炭土作為基質(zhì)最適于杜鵑試管外生根。

2. 3 基質(zhì)處理方法對(duì)杜鵑莖芽試管外生根的影響

由不同基質(zhì)處理方法對(duì)杜鵑試管外生根率的影響（表3）可以看出，在攪拌菌蟲雙殺0.84 g/L的草炭土基質(zhì)中微扦插苗平均生根率最高，達(dá)到了91.7%;在經(jīng)過高溫滅菌的草炭土基質(zhì)中的平均生根率為85.0%;在未經(jīng)任何處理的草炭土基質(zhì)中的平均生根率只有27.5%。造成生根率過低的原因可能是扦插前基質(zhì)中含有大量細(xì)菌和微生物，杜鵑無根莖芽受到雜菌污染所致。由此可知，攪拌菌蟲雙殺0.84 g/L的草炭土操作快捷簡(jiǎn)單，又非常有效。

2. 4 基質(zhì)含水率對(duì)杜鵑試管外生根的影響

由不同含水率基質(zhì)對(duì)杜鵑試管外生根的影響（表4）可以看出，基質(zhì)的含水率對(duì)莖芽試管外生根及小苗生長(zhǎng)影響很大，水分過多或過少都對(duì)苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。水體積與草炭土體積比分別為3∶20，4∶20，5∶20和6∶20時(shí)，對(duì)杜鵑試管苗的生根率和平均苗高增長(zhǎng)量的影響呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)?？梢姡|(zhì)含水率過高和過低都不適合杜鵑無根苗的生根和生長(zhǎng)，基質(zhì)中水體積與草炭土體積比為5∶20（含水率75%）時(shí)，比較適合杜鵑試管外生根和苗高生長(zhǎng)。

2. 5 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)杜鵑莖芽試管外生根的影響

由生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)杜鵑試管外生根及生長(zhǎng)情況的影響（表5）可以看出，NAA在各試驗(yàn)濃度的生根率隨著濃度的增加呈上升趨勢(shì)，但平均生根率均小于50%;IBA和ABT1在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)生根率均小于30%;ABT2和GGR較前三者生根率較高，其中當(dāng)ABT2濃度為50 mg/L時(shí)，生根率可達(dá)86.4%，GGR對(duì)其生根率的影響效果最顯著，隨著濃度的增加而不斷升高，在300 mg/L時(shí)生根率達(dá)最大值88.6%。

5種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)的影響結(jié)果差別不明顯，平均根數(shù)大部分集中在2～4條。GGR在各試驗(yàn)濃度時(shí)根數(shù)多數(shù)為3或4條，其中最多根數(shù)有6條，最少的有2條。5種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)根長(zhǎng)的影響順序?yàn)椋篒BA>GGR>ABT2>NAA>ABT1;同時(shí)，試管外生根苗的苗高受生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度的影響各不相同，除了ABT1處理外，苗高均能達(dá)到4～5 cm;ABT2在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)濃度的平均苗高均大于5 cm，GGR在各濃度平均苗高也達(dá)到4 cm左右。此外，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類對(duì)地徑的影響順序?yàn)椋篏GR>ABT2>IBA>NAA>ABT1。由此可知，在經(jīng)過GGR和ABT2處理后，幼苗的苗高和地徑優(yōu)于其它3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理。

經(jīng)試驗(yàn)，各種濃度的ABT1處理對(duì)試驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)的效果都不好，ABT2和GGR處理后的生根情況較其它3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑好。綜合考慮杜鵑莖芽試管外生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)、苗高和地徑等指標(biāo)，300 mg/L GGR處理的杜鵑苗生根率最高達(dá)88.6%，苗高可達(dá)4.91 cm，地徑最粗為0.65 mm，最多根數(shù)可達(dá)6條，平均根長(zhǎng)為1.00 cm。因此，用300 mg/L GGR速蘸莖芽基部是杜鵑試管外生根的最佳處理。

3 結(jié)論與討論

3. 1 采用引進(jìn)的杜鵑瓶苗，經(jīng)多次增殖培養(yǎng)，出瓶前經(jīng)過增壯培養(yǎng)（添加2-ip 0.8 μmol/L的WPM培養(yǎng)基）7～8周，瓶苗出瓶前閉瓶煉苗3～7天（溫度為25 ℃左右，濕度為60%～70%，以日光燈照射，較強(qiáng)的光照條件）。扦插時(shí)，將杜鵑無根莖芽剪成單株，用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑GGR以300 mg/L速蘸其基部，然后扦插在事先處理好的純草炭土，拌入菌蟲雙殺0.84 g/L，pH值5.8左右，含水率75%左右，在室內(nèi)組培馴化室進(jìn)行試管外生根培養(yǎng)，可得到較好的生根效果。

3. 2 進(jìn)行杜鵑組培微枝試管外生根試驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意：在生根期間，每天早晚打開蓋子通風(fēng)，用水噴灑葉面，根據(jù)基質(zhì)的干濕情況進(jìn)行澆水，始終保證基質(zhì)潮濕。杜鵑生根很慢，通常1個(gè)月后才會(huì)有3%～5%的莖叢長(zhǎng)根，大部分到6～8周才會(huì)陸續(xù)生根，逐漸用小鑷子將盒蓋支起，不斷增加光照直到把盒蓋完全撤去。生根期間如果基質(zhì)的濕度過大，1個(gè)月后基質(zhì)表面就會(huì)長(zhǎng)綠苔，但如果開蓋，基質(zhì)很快會(huì)干，沒有生根的幼苗會(huì)隨之干枯，所以控制基質(zhì)的濕度十分關(guān)鍵。另外，要逐漸增加光照和通風(fēng)時(shí)間，一般4周后幼苗逐漸長(zhǎng)出新葉，生根率在80%以上，幼苗葉片翠綠，莖粗壯。

3. 3 不同種類和濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)杜鵑試管外生根率的影響并不規(guī)律，造成這種現(xiàn)象的原因可能是杜鵑組培莖芽本身木質(zhì)化程度低，用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理后基部組織受到損傷，不能正常吸收水分和養(yǎng)分，分化根原基進(jìn)而分化成根，導(dǎo)致扦插后不久有死苗現(xiàn)象。另外，扦插后的管理也很重要，如基質(zhì)含水率控制不嚴(yán)格也可能造成影響不規(guī)律。

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第1作者簡(jiǎn)介： ?王愛芝（1975-）， ?女， ?博士， ?助理研究員， ?主要從事種苗培育原理與技術(shù)的研究工作。

通訊作者： ?沈海龍（1962-）， ?男， ?博士， ?教授， ?博士生導(dǎo)師， ?主要從事森林培育學(xué)的教學(xué)和科研工作。

收稿日期： 2020 - 01 - 20

（責(zé)任編輯： ? 王 巖）

Abstract The results of research on influencing factors of Micro-cuttings Ex-vitro rooting of Rhododendron tissue culture showed that substrate type， substrate treatment method， substrate moisture content， and growth regulators all have a great effect on rooting rate. Add 0.8 mol/L of 2-ip to the sterile growth of rhododendron culture for 7～8 weeks. Quickly dip the base of the stem bud with 300 mg / L GGR， and cut into 0.84 g / L of double-killed bacteria pure peat soil （pH value of 5.8 and water content of 75%） ） can be better rooted when cultivated in an indoor tissue culture and domestication room for external rooting.

Key words Rhododendron; ?Tissue culture; ?Micro-cuttings; ?Ex-vitro Rooting