外泌體環(huán)狀RNAs：人類癌癥的新型生物標(biāo)志物*

商安全 綜述，孫俊俊，谷晨崢，平伊麗，孫祖俊，李 冬△ 審校

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200065；2.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200065；3.江蘇省鹽城市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，江蘇鹽城 224005)

外泌體(Exo)是一種納米大小的膜性囊泡，含有活性物質(zhì)(DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等)，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間的多種生物過程，在生物學(xué)功能及正常機(jī)體反應(yīng)中為細(xì)胞間傳遞效應(yīng)信息提供了一種新的方法。環(huán)狀RNA(circRNAs)是一類具有封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA(ncRNA)。circRNAs作為微小RNA(miRNA)海綿、RNA結(jié)合蛋白海綿和翻譯調(diào)節(jié)因子在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。circRNAs與疾病的發(fā)展密切相關(guān)，已成為研究熱點(diǎn)。

1 Exo

1.1Exo的起源與特征 Exo是由大多數(shù)細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞)產(chǎn)生和釋放的一類直徑為30～200 nm的細(xì)胞外囊泡(EVs)。Exo直接從質(zhì)膜出芽，在其表面有多種生物分子，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂類等[1]。在Exo內(nèi)部同樣存在DNA、信使RNA(mRNA)、miRNA和不同的蛋白質(zhì)。Exo來源于內(nèi)泌體途徑[2]。在內(nèi)體成熟的早期到晚期，內(nèi)體特殊地向內(nèi)出芽形成多泡體(MVBs)。MVBs可與溶酶體融合，致使內(nèi)腔小泡(ILVs)發(fā)生降解。當(dāng)MVBs與細(xì)胞膜融合時(shí)，ILVs中又發(fā)生了一次向內(nèi)芽接，產(chǎn)生納米級(jí)的囊泡，并將這些分子分泌到細(xì)胞外空間，稱為Exo。運(yùn)輸所需的內(nèi)體分選復(fù)合體(ESCRT)機(jī)制在促進(jìn)內(nèi)體的形成中起著至關(guān)重要的作用[3]。其中，ESCRT0在晚期核內(nèi)體膜中識(shí)別并獲得泛素化蛋白，ESCRT1和ESCRT2都觸發(fā)了MVBs的萌發(fā)和蛋白質(zhì)Exo的分類，ESCRT3則形成螺旋狀結(jié)構(gòu)，有助于MVBs萌芽頸的閉合和腺苷三磷酸酶(ATPase)細(xì)胞液泡分選蛋白4(Vps 4)驅(qū)動(dòng)膜的切斷。在這個(gè)過程的最后，Vps 4介導(dǎo)所有ESCRT分子的回收，而泛素化蛋白對(duì)ESCRT的定位和功能起修飾或調(diào)節(jié)作用[4]。Exo的分泌則由不同的分子調(diào)節(jié)，如Rab27[5]、Rab35和Ral蛋白[6]。

1.2Exo的功能

1.2.1調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng) Exo具有不同的功能，包括抗原呈遞、免疫激活和免疫逃逸?？乖蔬f分為抗原遞呈細(xì)胞(APC)直接傳遞和間接傳遞。由于Exo的大小和結(jié)合位點(diǎn)的限制，與間接傳遞相比，Exo的直接傳遞較弱。在腦膠質(zhì)瘤小鼠模型中，來自樹突狀細(xì)胞的Exo可誘導(dǎo)強(qiáng)大而有效的抗腫瘤T細(xì)胞免疫反應(yīng)。富含伴侶蛋白的細(xì)胞裂解物(CRCLs)可能在抗腫瘤疫苗中很重要。在該研究中，抗腫瘤的作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)Cbl-b和c-Cbl信號(hào)來實(shí)現(xiàn)的[7]。Exo激活免疫系統(tǒng)的同時(shí)，也導(dǎo)致免疫逃逸。腫瘤細(xì)胞釋放的EVs抗原可阻止T細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞活化[8]。

1.2.2促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移 癌癥轉(zhuǎn)移的機(jī)制非常復(fù)雜，Exo可能對(duì)此有所幫助。癌癥細(xì)胞分泌的Exo能促進(jìn)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[9]，這是癌細(xì)胞從上皮至間質(zhì)表型的重編程。EMT為癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供了“友好”的環(huán)境。Exo也決定了有機(jī)性轉(zhuǎn)移[10]。腫瘤特異性Exo被器官特異性細(xì)胞攝取，并制備了轉(zhuǎn)移前的基質(zhì)。DHONDT等[11]發(fā)現(xiàn)，Exo中的某些miRNAs也會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。例如，含miR-200的Exo可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[12]。Exo中miR-105破壞了血管內(nèi)皮屏障，從而促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移[13]。乳腺癌分泌的Exo攜帶miR-122編程葡萄糖代謝，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[8,14]。

1.2.3生物標(biāo)志物 近年來，Exo被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)，其在疾病診斷和創(chuàng)新治療中的臨床應(yīng)用也不斷被挖掘[15]。目前，臨床上普遍認(rèn)為Exo具有作為生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的巨大潛力。CAMUSSI等[16]發(fā)現(xiàn)了Exo介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊的4種機(jī)制。首先，Exo通過直接刺激靶細(xì)胞作為信號(hào)復(fù)合物發(fā)揮作用，這是不可缺少的，特別是在血小板凝固過程中，中性粒細(xì)胞可釋放表達(dá)活化的白細(xì)胞整合素αMβ2(或Mac-1)的Exo，從而促進(jìn)血小板活化。第二，Exo能夠在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移受體。受體轉(zhuǎn)移過程可以發(fā)生在各種類型的細(xì)胞上，如B細(xì)胞[17]、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。其次，Exo可以在靶細(xì)胞內(nèi)釋放，并釋放其攜帶的蛋白質(zhì)。研究表明，NPC細(xì)胞可以釋放含有半乳糖凝集素9蛋白(GAL9)和(或)LMP1的人類白細(xì)胞抗原(HLA)Ⅱ類陽(yáng)性的Exo，后者具有固有T細(xì)胞抑制活性[18]。最后，Exo主要通過依賴Exo攜帶的miRNAs、mRNAs或DNAs的轉(zhuǎn)化來傳遞遺傳信息，從而影響靶細(xì)胞中的表達(dá)。XUE等[19]發(fā)現(xiàn)，血清中的exo-miR-93與臨床特征(包括分期和腫瘤大小)之間存在明顯相關(guān)性。除了通過轉(zhuǎn)運(yùn)遺傳物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞間通信的信使外，Exo還直接與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)相互作用。活化的中性粒細(xì)胞來源的Exo分別通過整合素Mac-1和表面結(jié)合的中性粒細(xì)胞彈性酶(NE)與ECM結(jié)合并降解，從而形成中性粒細(xì)胞胞外陷阱(NETs)導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支氣管肺發(fā)育不良(BPD)的特征[20]。這些發(fā)現(xiàn)表明Exo在生理和病理過程中具有明顯的多功能性。因此，Exo是一種理想的生物標(biāo)志物。在此，筆者總結(jié)了癌癥中已知的exo-miRNA生物標(biāo)志物[21]，見表1。

表1 腫瘤來源與相同細(xì)胞類型非腫瘤細(xì)胞的Exo相比

2 circRNAs

2.1circRNAs起源與特征 人類基因組超過70%是主動(dòng)轉(zhuǎn)錄的，但蛋白質(zhì)編碼基因只占人類基因組的1%～2%，而絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本是ncRNA[22]。ncRNA可以分為兩個(gè)子類[23]，即管家ncRNA(rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA)和調(diào)節(jié)型ncRNA。調(diào)節(jié)型ncRNA按長(zhǎng)度分類如下：(1)短鏈非編碼RNA(<200 bp)，包括miRNA、snRNA、piRNA、siRNA和其他；(2)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA，> 200 bp)。在lncRNA中，circRNAs最近作為一類新的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)出現(xiàn)，它們形成了一個(gè)共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)，沒有5′帽和3′尾巴，并廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。20多年前，NIGRO等[24]在鑒定候選腫瘤抑制基因的剪接轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)了circRNAs。然而，這種新型的RNA產(chǎn)物被認(rèn)為是由于沒有功能的剪接錯(cuò)誤導(dǎo)致的。由于高通量測(cè)序的快速發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多circRNAs，并且發(fā)現(xiàn)了它們的一些特性。首先，circRNAs似乎在組織或發(fā)育階段特異性表達(dá)[25]。其次，在體內(nèi)，circRNAs比相關(guān)的線性mRNA更穩(wěn)定，因?yàn)樗鼈儗?duì)RNase活性具有抗性[25-26]。第三，來自人類成纖維細(xì)胞中超過14%的活躍轉(zhuǎn)錄基因的circRNAs，在某些情況下，其豐度比相關(guān)線性mRNA的豐度高10倍以上[26]。第四，circRNAs主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，但是有些似乎富集在細(xì)胞核中[25-27]。circRNAs是一類新的ncRNA生物標(biāo)志物，在循環(huán)過程中具有抗外切酶降解和增強(qiáng)穩(wěn)定性的特點(diǎn)。根據(jù)各種生物遺傳模式，circRNAs可以分為以下三類：外顯子circRNA(EcircRNA)[26]、環(huán)狀內(nèi)含子RNA(ciRNA)和外顯子-內(nèi)含子circRNA(EIciRNA)。

2.2circRNA功能 circRNAs的幾種潛在功能[25]包括：(1)通過與ceRNA競(jìng)爭(zhēng)，再與miRNA結(jié)合，稱為miRNA海綿；(2)通過內(nèi)含子ciRNA和EIciRNA促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄；(3)與蛋白質(zhì)相互作用；(4)被翻譯成蛋白質(zhì)或多肽。

2.2.1circRNAs作為miRNA海綿 作為miRNA海綿是circRNA分子最常見的功能。研究表明，miRNA可以與circRNA結(jié)合并失活。結(jié)合位點(diǎn)是靶向mRNA的3′非編碼區(qū)(3′UTR)上的互補(bǔ)位點(diǎn)。一個(gè)circRNA可以捕獲多個(gè)miRNAs，這意味著每個(gè)circRNA具有多個(gè)miRNAs目標(biāo)位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄本(CDR1as)可以充當(dāng)miR-7a/b的海綿[28]。CDR1as包含74個(gè)miR-7的結(jié)合位點(diǎn)，并且可以負(fù)調(diào)控miR-7的功能。CDR1as過表達(dá)時(shí)，大量miR-7與CDR1as結(jié)合，導(dǎo)致miR-7的靶基因表達(dá)被上調(diào)。相反，miR-7的靶基因?qū)⒃贑DR1as下調(diào)后被下調(diào)。睪丸特異性circRNAs性別決定區(qū)域Y基因(SRY)可能具有與CDR1as類似的特征和功能，與miR-138有16個(gè)靶位，可作為miR-138海綿。在過去的幾年中，越來越多的海綿模型出現(xiàn)。在此，筆者總結(jié)了一些常見的充當(dāng)miRNA海綿的circRNAs[21]，見表2。

表2 circRNAs作為miRNA海綿

2.2.2circRNAs作為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子 一些EIciRNA通過與U1 snRNA相互作用來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。EIciRNA和U1 snRNP形成的EIciRNA-U1 snRNA化合物與RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合體相互作用，促進(jìn)基因表達(dá)。通過RNA和DNA調(diào)節(jié)模型，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了SEPALLATA3(SEP3)蛋白，其是從SEP3基因外顯子生成的circRNA，并且該circRNA影響相應(yīng)的同源mRNA剪接。SEP3與相應(yīng)的DNA序列穩(wěn)定結(jié)合，產(chǎn)生RNA和DNA雜交，從而暫停轉(zhuǎn)錄，提高RNA剪接因子并形成可變剪切。

2.2.3circRNAs與蛋白質(zhì)相互作用 circRNAs可以與Argonaute(AGO)蛋白、RNA聚合酶Ⅱ和RNA結(jié)合蛋白(RBP)結(jié)合。SALZMAN等[29]研究證明，circRNAs CDR1as可以通過光活性增強(qiáng)的核糖核苷交聯(lián)和免疫共沉淀(PAR-CLIP)與AGO緊密結(jié)合。ci-ankrd52、circEIF3J，以及與聚腺苷酸結(jié)合蛋白相互作用的circPAIP2蛋白可以與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合。

2.2.4circRNAs作為蛋白質(zhì)/肽翻譯器 circ-ZNF609與重聚體相關(guān)，可被翻譯成蛋白質(zhì)[30]。但是，蛋白質(zhì)翻譯的效率與其對(duì)應(yīng)的線性RNA不同，線性RNA的效率是circ-ZNF609的2倍。另一項(xiàng)研究表明，circRNAs可以直接翻譯成多肽，他們分析了果蠅腦組織中的核糖體印跡，發(fā)現(xiàn)一些circRNAs可以整合到核糖體中[31]。通過一些驗(yàn)證測(cè)試，他們認(rèn)為某些circRNAs可以翻譯成蛋白質(zhì)。核糖體印跡分析表明，該circRNAs(circMbl)的終止密碼子與核糖體結(jié)合，并在蛋白質(zhì)譜中發(fā)現(xiàn)circMbl編碼的蛋白質(zhì)。

2.2.5circRNAs與癌癥 研究表明，circRNAs與人類多種疾病相關(guān)，例如，動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、帕金森病、糖尿病及癌癥等[32]。在分析6種人類正常組織(腦、心臟、肺、肝、結(jié)腸和胃)和7種人類癌癥(膀胱癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、大腸癌、腎透明細(xì)胞和前列腺癌)超過27 000個(gè)circRNAs候選基因的測(cè)序數(shù)據(jù)。與正常組織相比，circRNAs通常在腫瘤組織中下調(diào)，而且circRNAs水平與臨床特征明顯相關(guān)，包括分期、年齡、性別和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，這歸因于惡性腫瘤反向剪接機(jī)制的錯(cuò)誤——miRNA的異常調(diào)節(jié)(由于癌組織中circRNAs的降解，或由于細(xì)胞增殖增加而導(dǎo)致的circRNAs減少)。

2.2.6circRNAs介導(dǎo)腫瘤免疫監(jiān)視 與癌癥相關(guān)的免疫反應(yīng)可以通過破壞癌細(xì)胞或抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)來保護(hù)宿主。另一方面，它們還可以通過選擇腫瘤逃逸變異或在腫瘤微環(huán)境(TME)內(nèi)建立促進(jìn)腫瘤特異性、適應(yīng)性免疫應(yīng)答發(fā)展的條件來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。近年來，已發(fā)現(xiàn)circRNAs在調(diào)節(jié)腫瘤免疫力中起潛在作用。作為免疫系統(tǒng)抗原，外源純化的circRNAs可以通過體外激活視黃酸誘導(dǎo)型基因1(RIG-1)介導(dǎo)的途徑來調(diào)節(jié)先天免疫的激活[33]。circRNAs誘導(dǎo)的RIG-1是眾所周知的先天免疫調(diào)節(jié)劑[34]，并且已證明RIG-1激動(dòng)劑可以激活抗癌免疫反應(yīng)來對(duì)抗腫瘤[35]。因此，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的外源性circRNA具有影響RIG-1和激活抗腫瘤免疫力的潛力。

2.2.7circRNAs作為癌癥轉(zhuǎn)錄因子 某些circRNAs可以增強(qiáng)其親本基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制或促進(jìn)癌癥進(jìn)展。例如，過表達(dá)微小染色體維持蛋白(MCM5)與大腸癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)，提示不良預(yù)后[36]。反之，沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT7)的低表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)的侵襲性腫瘤表型和預(yù)后不良有關(guān)[37]。cZNF292可通過降低cyclin A、p-CDK2、CDK2、β-catenin、p-STAT3(Tyr705)和p-STAT5(Tyr694)的表達(dá)來抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和血管形成。下調(diào)cZNF292導(dǎo)致E2F1、NF-κB、Sp1、HIF-1、AP-1、STAT3和STAT5的轉(zhuǎn)錄降低，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的血管生成[38]。因此，被認(rèn)為是另一種剪接異構(gòu)體的circRNA可能在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用，從而導(dǎo)致癌癥相關(guān)基因的表達(dá)失調(diào)。

2.2.8circRNAs作為潛在的癌癥生物標(biāo)志物 circRNAs具有跨物種高度保守的特征，在唾液、血液和Exo中穩(wěn)定表達(dá)，并具有組織或發(fā)育階段的特定特性，故可以滿足潛在的癌癥生物標(biāo)志物的要求。與濃度較低的miRNA相比，circRNA更容易被檢測(cè)。另外，與通過抗原-抗體反應(yīng)檢測(cè)蛋白質(zhì)相比，通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和原位雜交檢測(cè)circRNA的方法更加靈敏和特異。因此，circRNA可能具有充當(dāng)潛在癌癥生物標(biāo)志物的優(yōu)勢(shì)。在不同的癌癥中已經(jīng)有多種circRNAs被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)志物。

胃癌的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，circ_002059在胃癌組織中下調(diào)，其表達(dá)水平失調(diào)與性別、年齡、TNM和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[39]。WAN等[40]發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，70%的肺癌組織中circ-ITCH的表達(dá)明顯降低。YAO等[41]證實(shí)，在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的腫瘤組織中，circ_100876明顯上調(diào)，其過表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480和HCT116的研究中，證明了miR-7、miR-20a和miR-214的circ-ITCH海綿活性[42]。circ_001569也被證明在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平高于正常組織。有研究還發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織具有高水平的circ-BTG3相關(guān)核蛋白(BANP)[43]。GUO等[44]研究證明，circ_0000069在CRC中也呈過表達(dá)。circ_001059、circ_000167、circ_0067934和circ-ITCH等circRNAs的表達(dá)水平與食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)的癌癥相關(guān)病死率有關(guān)。在乳腺癌相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)circ Foxo3在腫瘤患者標(biāo)本和一組癌細(xì)胞中下調(diào)，而當(dāng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，其在癌細(xì)胞中呈高表達(dá)水平。circ Foxo3在乳腺癌細(xì)胞系和乳腺腫瘤組織中明顯下調(diào)。HCC組織中有61種差異表達(dá)的circRNAs，且circ_0005075可能作為miRNA海綿抑制miR-23b-5p在癌癥中的表達(dá)。另一研究證明，circ_0001649在HCC組織中表達(dá)明顯降低[45]。此外，Cdr1as在HCC組織中明顯上調(diào)[46]。高通量分析發(fā)現(xiàn)，circ-NT5C2在骨肉瘤中表達(dá)異常，通過調(diào)控miR-448的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展和代謝[47]。此外，低表達(dá)的circ-PVT1降低了經(jīng)典的多藥耐藥相關(guān)基因ATP結(jié)合盒B亞家族1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，這表明circ-PVT1在診斷骨肉瘤方面可能比堿性磷酸酶更有效[48]。綜上，人類癌癥中異常表達(dá)的circRNAs可作為人類一類新的診斷、預(yù)后和治療性生物標(biāo)志物。

3 exo-circRNAs

3.1exo-circRNAs的起源 circRNAs被證明存在于Exo中，這一發(fā)現(xiàn)為circRNAs的研究開辟了新的方向。circRNAs多位于細(xì)胞質(zhì)中，并且Exo中circRNAs的種類根據(jù)不同類型的細(xì)胞質(zhì)類型有所不同，這表明特定circRNAs轉(zhuǎn)移至Exo的過程可能受到積極調(diào)控，這是一個(gè)選擇性過程。既往研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs轉(zhuǎn)移至Exo可能存在兩種作用機(jī)制：一種是細(xì)胞之間的交流方式，因?yàn)镋xo中的物質(zhì)使遠(yuǎn)端細(xì)胞的物質(zhì)、信息交流更方便；另一種是Exo中的circRNA可幫助去除細(xì)胞中積累的circRNA[49]。

3.2exo-circRNAs作為生物標(biāo)志物 目前，在各類腫瘤的早期診斷、手術(shù)方法、放療及化療等方面取得了一定的臨床進(jìn)展，然而，一些腫瘤的早期癥狀并不典型，最終的診斷往往需要復(fù)雜的組織活檢，這對(duì)患者來說是痛苦的。目前臨床上仍缺乏快速、準(zhǔn)確、無創(chuàng)的早期診斷生物標(biāo)志物。

眾所周知，大多數(shù)類型細(xì)胞可分泌一種稱為Exo的內(nèi)溶酶體起源的納米級(jí)EVs，內(nèi)含特定負(fù)載的mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)，能夠影響細(xì)胞行為，并可能用于診斷多種人類疾病。有研究證實(shí)，Exo中存在幾種具有潛在生物學(xué)功能的circRNAs，特別是人類血清Exo已被證明含有超過1 000個(gè)circRNAs，這可能是由于腫瘤中circRNAs進(jìn)入血流所致[50]。研究血清e(cuò)xo-circRNAs的存在和表達(dá)水平可以將癌癥患者與健康個(gè)體區(qū)分開，從而確定新的潛在的基于Exo的癌癥生物標(biāo)志物。有研究通過RNA 測(cè)序鑒定了Exo中的RNA群體，包括circRNA、lncRNA、miRNA、mRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、snRNA、snoRNA和piRNA等[51]。這些RNA可以從親代細(xì)胞轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，在那里它們調(diào)節(jié)靶基因或作為蛋白質(zhì)合成的模板。Exo還可充當(dāng)miRNA的納米載體，并在癌癥進(jìn)展中起雙重作用。研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs在癌癥Exo中穩(wěn)定富集，Exo對(duì)circRNAs等核酸的轉(zhuǎn)運(yùn)保護(hù)了核酸在細(xì)胞外空間免受降解和稀釋的保護(hù)，從而允許通過血流或組織液進(jìn)行長(zhǎng)距離分布[52]。

由于Exo中含有豐富的circRNAs，它們可以被人類血液收集。為了檢測(cè)exo-circRNAs是否進(jìn)入血液循環(huán)并可量化用于癌癥診斷，在荷瘤小鼠的血清中Exo中檢測(cè)到了人circRNA-CDYL，并且在異種移植小鼠中發(fā)現(xiàn)這種circRNA-CDYL的量與腫瘤發(fā)展相關(guān)，進(jìn)一步證明circRNAs可做癌癥的早期診斷生物標(biāo)志物[49]。

3.3exo-circRNAs的檢測(cè)方法 許多常用的分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于exo-circRNAs的檢測(cè)，目前主要技術(shù)包括：RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)、微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)、Northern blotting、微陣列(Microarrays)、RNA測(cè)序(RNA Sequencing)、NaroString Technologies nCounter等。每一項(xiàng)技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，見表3。

表3 exo-circRNAs的主要檢測(cè)方法

3.4exo-circRNAs在癌癥中的作用 有研究在KRAS突變狀態(tài)不同的3種同基因結(jié)直腸癌細(xì)胞系的細(xì)胞和Exo中發(fā)現(xiàn)，circRNAs在KRAS突變的結(jié)直腸癌中被下調(diào)，并且可以在Exo中分泌。在HCC中，circRNA_100284隨著惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的Exo中釋放，并轉(zhuǎn)移到鄰近的正常細(xì)胞中，促進(jìn)肝細(xì)胞異常增殖。一些來自脂肪組織的exo-circRNAs可以影響HCC中的去泛素化，尤其是在體脂率較高的患者中，存在更多的外環(huán)去泛素化(circ-DB)[53]。在胃癌研究中，發(fā)現(xiàn)血漿中一種名為ciRS-133的exo-circRNA與白色脂肪組織(WAT)的褐變和癌癥相關(guān)的惡病質(zhì)密切相關(guān)[54]。PDAC是最具有侵略性和致命性的癌癥之一，其5年生存率低至5%，這是由于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)所致[55-56]。研究人員在Exo介導(dǎo)的circRNAs在PDAC中作用機(jī)制研究中，通過芯片分析，circ-PDE8A在PDAC中是一種高表達(dá)的circRNA[57]。一項(xiàng)研究表明，circ-PRMT5可以作為miR-30c海綿促進(jìn)膀胱尿路上皮癌細(xì)胞EMT，從而增強(qiáng)其靶基因SNAIL1和E-cadherin的表達(dá)，使細(xì)胞更具侵襲性[58]。XU等[59]通過RNA-seq技術(shù)分析circRNAs在子宮內(nèi)膜癌患者和健康個(gè)體血清中分離出的Exo中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與健康受試者相比，子宮內(nèi)膜癌患者Exo中上調(diào)circRNAs的數(shù)量高于下調(diào)circRNAs的數(shù)量。以上研究數(shù)據(jù)表明，源自人類癌癥的circRNAs可以進(jìn)入血液，并易于在血清中定量，而exo-circRNAs可以影響靶細(xì)胞，有助于識(shí)別癌癥發(fā)展的新機(jī)制。

5 小結(jié)與展望

對(duì)RNA領(lǐng)域的不斷深入研究表明，circRNAs在生理和病理過程中起著重要的作用。盡管關(guān)于circRNAs的研究很多，但是其形成機(jī)制和清除機(jī)制仍不清楚。作為納米級(jí)的生物囊泡，Exo仍被認(rèn)為是“粗糙的鉆石”，其攜帶了特殊的蛋白質(zhì)和RNA序列，可以作為細(xì)胞間信息交換的新方法，從而促進(jìn)細(xì)胞間的通信。由于其獨(dú)特性和高特異性，Exo與circRNAs結(jié)合可以增加其作為癌癥早期診斷和預(yù)后標(biāo)志物的潛力，而且它們可以作為許多疾病的生物標(biāo)志物。生物標(biāo)志物是血液、組織和體液中含有的生物分子，可以作為正常和病理狀態(tài)的客觀評(píng)價(jià)和測(cè)量指標(biāo)[60]。生物標(biāo)志物的使用對(duì)于不同疾病的早期檢測(cè)和診斷以及對(duì)治療反應(yīng)的監(jiān)測(cè)具有很重要的臨床意義[61]。這些生物標(biāo)志物的典型特征，如穩(wěn)定性、敏感性和特異性，使其能夠在臨床實(shí)踐中得到應(yīng)用。

精準(zhǔn)醫(yī)療尤其是液體活檢的目標(biāo)是發(fā)現(xiàn)癌癥生物標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物對(duì)癌癥風(fēng)險(xiǎn)指征具有較強(qiáng)的監(jiān)測(cè)能力，有助于患者接受最合適的治療，并有助于臨床醫(yī)生監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展或復(fù)發(fā)。研究表明，Exo是癌癥診斷預(yù)后和預(yù)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物，Exo用作生物標(biāo)志物的目的是與全身體液相比，大大降低了樣品的復(fù)雜性，并且在液體活檢中具有微創(chuàng)性，甚至是無創(chuàng)性[62]。此外，由于Exo具有良好的生物分布和生物相容性，為了成功地開發(fā)治療癌癥的漸進(jìn)治療方法，尤其是精準(zhǔn)醫(yī)療，exo-circRNA應(yīng)是治療靶標(biāo)的一種選擇。盡管如此，與Exo lncRNA和miRNA相比，目前對(duì)circRNAs與Exo之間關(guān)系的了解仍然存在許多空白，例如，exo-circRNA在體液中傳遞的機(jī)制，以及exo-circRNAs在癌癥中的作用。闡明與人類癌癥相關(guān)的exo-circRNAs的功能和分子機(jī)制將開辟新的認(rèn)識(shí)途徑，為惡性腫瘤的診療提供新的方法。