MnSOD、SIRT3在肺腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)及其與臨床病理、預(yù)后的關(guān)系分析

戚永超，繆 勁，張愛平，鄭 琳

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院/南京市第一醫(yī)院心胸血管外科，江蘇南京 210000)

肺腺癌是起源于肺支氣管黏膜上皮的原發(fā)性惡性腫瘤疾病，多數(shù)為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，以胸悶、氣短、咳嗽、咯血、呼吸急促為臨床癥狀，居癌癥原因死亡首位[1]。錳超氧化物歧化酶(MnSOD)則是存在于線粒體基質(zhì)的抗氧化酶，可清除機(jī)體細(xì)胞代謝產(chǎn)生的活性氧(ROS)，保護(hù)線粒體免受超氧陰離子損傷，對維持正常細(xì)胞功能、細(xì)胞存活至關(guān)重要[2]。FU等[3]的動物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，MnSOD過表達(dá)可觸發(fā)叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1(FoxM1)上調(diào)，誘導(dǎo)和維持人肺癌細(xì)胞自我更新，促進(jìn)NSCLC進(jìn)展。去乙?；?(SIRT3)作為NDA依賴的去乙酰化酶，也是重要的線粒體蛋白，可依據(jù)不同細(xì)胞、腫瘤類型發(fā)揮抑癌或致癌基因作用[4]。XIONG等[5]報道，SIRT3通過轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)控Akt的活化，增加NSCLC惡性程度，但對鱗狀細(xì)胞癌的致癌傾向更明顯。基于此，本研究采集資料著重分析MnSOD、SIRT3在肺腺癌患者肺腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)及其與臨床病理、預(yù)后的關(guān)系，旨在為肺腺癌的臨床診治提供參考依據(jù)，具體報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院心胸血管外科2016年1月至2018年12月收治的60例留存有肺腺癌及癌旁組織標(biāo)本的肺腺癌患者作為研究對象。所納入患者均經(jīng)手術(shù)病理活檢確診為肺腺癌，有明確病理診斷結(jié)果，在肺腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本采集前均無任意放化療或靶向治療史，無肺腺癌以外的其他內(nèi)外科疾病，如心腦血管疾病，肝、腎功能異常及慢性阻塞性肺疾病等非腫瘤性疾病。

1.2儀器與試劑 MnSOD免疫組織化學(xué)SP試劑盒、MnSOD一抗、二抗均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，SIRT3一抗、二抗均購自Santa Cruz公司，SIRT3免疫組織化學(xué)SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自上海基爾頓生物公司。

1.3方法 以查閱電子病歷方式統(tǒng)計(jì)患者性別、年齡、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、肺腺癌亞型等臨床病理資料，采用免疫組織化學(xué)(SP法)檢測MnSOD、SIRT3在肺腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，比較不同臨床病理特征患者肺腺癌組織MnSOD、SIRT3表達(dá)差異。

1.3.1免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟、脫水處理，采用3%H2O2溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，采用pH值為6.0的枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，依次滴加SIRT3抗體一抗、二抗，DAB顯色，400倍顯微鏡下觀察染色程度，若染色滿意則立即用PBS沖洗終止染色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，逆梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察攝片。MnSOD、SIRT3免疫組織化學(xué)染色均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，以已知陽性組織切片為陽性對照，陰性對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。

1.3.2讀片 每張切片隨機(jī)選取5個視野(×400)，顯微鏡下觀察顯色反應(yīng)，由1名病理科醫(yī)生、2名讀片者采用免疫組織化學(xué)評分系統(tǒng)(IRS)雙盲讀片，顯微鏡下可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒則為MnSOD表達(dá)陽性，對染色結(jié)果進(jìn)行評分(染色深度面積×染色面積比例)；其中染色深度按完全陰性、弱陽性、中度陽性、強(qiáng)陽性對應(yīng)0～3分，著色細(xì)胞比例按染色細(xì)胞比例為全視野的0%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%～100%對應(yīng)1～4分，IRS總分12分，8～12分為陽性，否則為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分比表示，行χ2檢驗(yàn)或連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)，采用Cox回歸模型分析影響患者預(yù)后的危險因素，繪制Kaplan-Meier生存曲線分析MnSOD、SIRT3對肺腺癌患者生存時間的影響，生存率的比較采用Log-Rank檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MnSOD、SIRT3在肺腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá) MnSOD、SIRT3均定位于肺腺癌細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒表達(dá)，且在肺腺癌組織中MnSOD陽性表達(dá)率、SIRT3陽性表達(dá)率均明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 MnSOD、SIRT3在肺腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)[n=60，n(%)]

2.2MnSOD、SIRT3與肺腺癌臨床病理的關(guān)系 不同性別、年齡、肺腺癌亞型，以及有、無吸煙史的肺腺癌患者肺腺癌組織MnSOD、SIRT3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但隨著組織學(xué)分級增加肺腺癌組織MnSOD陽性表達(dá)率、SIRT3陽性表達(dá)率，呈明顯下降趨勢，TNM分期為Ⅲ期患者的肺腺癌組織MnSOD陽性表達(dá)率、SIRT3陽性表達(dá)率明顯低于Ⅰ+Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 MnSOD、SIRT3與肺腺癌臨床病理的關(guān)系[n(%)]

2.3MnSOD、SIRT3與預(yù)后的關(guān)系 60例患者隨訪時長為18～38個月，平均(26.37±4.12)個月。將患者臨床病理特征、肺腺癌組織MnSOD及SIRT3表達(dá)、治療方案均納入Cox回歸模型協(xié)變量范圍，結(jié)果顯示，MnSOD陰性、SIRT3陰性與組織學(xué)分級Ⅲ級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期均是影響肺腺癌患者生存的獨(dú)立危險因素，見表3。

表3 MnSOD、SIRT3與預(yù)后的關(guān)系

續(xù)表3 MnSOD、SIRT3與預(yù)后的關(guān)系

2.4不同MnSOD、SIRT3表達(dá)的Kaplan-Meier生存分析 MnSOD、SIRT3陰性表達(dá)患者累積生存率明顯低于MnSOD、SIRT3陽性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.601、8.895，P=0.010、0.003)，見圖1。

注：A為MnSOD；B為SIRT3。

3 討 論

ROS是產(chǎn)生于細(xì)胞線粒體的氧化呼吸鏈，適量的ROS可對細(xì)胞增殖、分化、凋亡等發(fā)揮正向調(diào)控機(jī)制，ROS過表達(dá)則可能引起細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)損傷，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[6]。MnSOD則是線粒體內(nèi)重要的超氧陰離子自由基清除劑，也是線粒體內(nèi)主要的抗氧化酶，可維持細(xì)胞氧化還原平衡，使其免受ROS損害[7-8]。在機(jī)體內(nèi)，MnSOD的表達(dá)直接影響細(xì)胞內(nèi)ROS的清除情況，但基于當(dāng)前臨床研究，MnSOD在腫瘤疾病中或可發(fā)揮雙向作用，如在鼻咽癌中MnSOD便呈明顯高表達(dá)[9]，而在前列腺癌組織中MnSOD則呈明顯低表達(dá)[10]。由此可見，MnSOD表達(dá)或可因腫瘤部位、不同病理類型的瘤細(xì)胞或組織中ROS的不同而呈不同表達(dá)趨勢。因此，研究不同腫瘤疾病中MnSOD表達(dá)十分必要。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌患者肺腺癌組織MnSOD陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織。這與MARTIN等[11]的報道結(jié)論相符。隨著組織學(xué)分期增加，肺腺癌組織MnSOD陽性表達(dá)率呈明顯下降趨勢，TNM分期為Ⅲ期患者肺腺癌組織MnSOD陽性表達(dá)率明顯低于Ⅰ+Ⅱ期患者，進(jìn)一步提示MnSOD在肺腺癌組織中或充當(dāng)抑癌基因。

SIRT3與MnSOD相似，同樣可維持適當(dāng)?shù)腞OS生產(chǎn)以防止細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖；同時，SIRT3還能通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)穩(wěn)定，保護(hù)線粒體膜完整性，增加細(xì)胞對氧化應(yīng)激的抗性，從而抵抗細(xì)胞凋亡，發(fā)揮致癌作用[12]。而在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，SIRT3也可通過對ROS的維持作用防治細(xì)胞凋亡、抵抗癌變，發(fā)揮抑癌作用[13]。隨著研究的深入，SIRT3在腫瘤疾病中所發(fā)揮的臨床價值逐漸引起重視，但其功能可因細(xì)胞類型、腫瘤類型而呈現(xiàn)差異性表達(dá)，因此SIRT3與腫瘤間的關(guān)系存在爭議，分析SIRT3在單一腫瘤疾病中的表達(dá)，明確其與腫瘤的關(guān)系十分必要。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌組織SIRT3陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，這與XIAO等[14]的報道結(jié)論相似，且其與臨床病理的關(guān)系也與MnSOD相似，由此可見，肺腺癌組織中，SIRT3與MnSOD相似，均表現(xiàn)出抑癌作用。

本研究還對MnSOD、SIRT3表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，MnSOD陰性、SIRT3陰性與組織學(xué)分級Ⅲ級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期均是影響肺腺癌患者生存的獨(dú)立危險因素，提示MnSOD、SIRT3表達(dá)與肺腺癌患者生存密切相關(guān)，進(jìn)一步繪制生存曲線分析生存率，同樣獲得相似結(jié)論，MnSOD、SIRT3陰性患者的累積生存率明顯低于MnSOD、SIRT3陽性患者。分析原因可能是，在肺腺癌組織中SIRT3高表達(dá)可通過增加Bax/Bcl-2、Bad/Bcl-XL比值促進(jìn)AIF易位至細(xì)胞核，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。

4 結(jié) 論

肺腺癌患者肺腺癌組織MnSOD、SIRT3陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，其表達(dá)與肺腺癌組織學(xué)分級、TNM分期、預(yù)后等關(guān)系密切，或可用于肺腺癌患者病情、預(yù)后評估。本課題組擬在下階段深入探究MnSOD、SIRT3在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制。