人類輔助生殖技術用液類產(chǎn)品生產(chǎn)用水的胚胎毒性研究

【作 者】韓倩倩 ，季煦，常露，金星亮, ，王春仁，李靜莉

1 中國食品藥品檢定研究院，北京市，102629

2 南京優(yōu)而生物科技發(fā)展有限公司，南京市，210032

3 悉尼大學醫(yī)學院Kolling醫(yī)學研究院，悉尼再生發(fā)育醫(yī)學中心，澳大利亞新威爾士州，2065

0 引言

現(xiàn)代人類居住環(huán)境、工作社會壓力等因素導致了不孕不育的發(fā)病率越來越高。最新《中國不孕不育現(xiàn)狀調(diào)研報告》顯示，中國的不孕不育率從20年前的2.5%至3%攀升到12.5%至15%左右，患者人數(shù)超過4000萬，即每8對夫婦中就有1對有不孕不育問題。其中約20%需要通過輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）來治療。

輔助生殖用液的質(zhì)量直接關系到ART的成功率，其成分配方及生產(chǎn)工藝決定了這類產(chǎn)品的質(zhì)量。目前市場上的輔助生殖用液種類繁多，涉及到了ART的各個具體過程，包括配子收集處理、體外受精、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植、胚胎凍存復蘇以及胚胎活檢，甚至ART儀器設備的清洗等等。絕大多數(shù)以水作溶劑且占整個液體成分比例的90%以上，所以水的品質(zhì)是影響ART用液質(zhì)量的最主要因素之一[1]。

水為輔助生殖用液的主要成分，在制備純化水時，去除水中的污染物至關重要[1]。必須監(jiān)測水中污染物的水平。一般情況下,通過對經(jīng)過處理的自來水進行反滲透和電離,可以生產(chǎn)出高質(zhì)量的水。但是，通過鼠胚試驗發(fā)現(xiàn)：這并不能符合ART用水的要求。通過超純水系統(tǒng)、完善的水處理流程以及質(zhì)量控制手段，才可以生產(chǎn)適合體外人類胚胎培養(yǎng)的高質(zhì)量超純水。目前生產(chǎn)商采用的水為符合中國藥典或美國藥典或歐洲藥典的純化水或注射用水，并無相關的統(tǒng)一標準及要求。無論是純化水或注射用水，在其制備和標準要求方面，均未考慮到其對于胚胎發(fā)育的影響。所以，將鼠胚試驗列入輔助生殖用液類產(chǎn)品生產(chǎn)用水的質(zhì)控指標在我國輔助生殖行業(yè)建立統(tǒng)一的用水標準是有意義的。

本研究選取通過MilliQ系統(tǒng)制備的三種純化水，包括去離子反滲透水、超純化水及無內(nèi)毒素無核酸的超純化水，通過鼠胚試驗測試了它們的胚胎毒性，結果證明使用無內(nèi)毒素無核酸的超純化水制備的輔助生殖用液產(chǎn)品的鼠胚發(fā)育效果最好，囊胚總細胞數(shù)和內(nèi)細胞團數(shù)顯著高于其他三組，本研究證明了用于制備輔助生殖用液類產(chǎn)品的水，去除其中內(nèi)毒素和核酸成分的重要性，為輔助生殖用液的水質(zhì)選擇提供依據(jù)。

1 試驗材料及方法

1.1 自來水，去離子反滲透水、超純化水及無內(nèi)毒素的超純化水的制備

取水環(huán)境：十萬級凈化車間。

自來水（A）：符合生活用水標準的位于江蘇省南京市江北新區(qū)自來水。

去離子反滲透水（B）：將自來水先后經(jīng)過棉芯柱、活性炭柱，進入MilliQ純化系統(tǒng)（MERCK,CHINA）中，再通過Progard T3柱、RO膜和254 nm紫外照射進入儲水桶制成去離子反滲透性水（deionized reverse osmosis，DRO）。

超純水（C）：去離子反滲透水從儲水桶中再進入MilliQ純化系統(tǒng)（MERCK,CHINA）經(jīng)過185 nm紫外照射、Q-Park柱以及濾過系統(tǒng)（Millipak?Express 40）處理制成MilliQ超純化水。

無內(nèi)毒素無核酸的超純水（D）：MilliQ超純化水經(jīng)過超濾系統(tǒng)（BioPak ultrafiltration）處理制備成無內(nèi)毒素無核酸的MilliQ超純化水。

1.2 配制卵母細胞緩沖液、顆粒細胞去除液、胚胎培養(yǎng)液

利用以上四種水各配制一套鼠胚試驗用液，包括卵母細胞緩沖液、顆粒細胞去除液和胚胎培養(yǎng)液。所有的原材料購于MERCK。卵母細胞緩沖液是含有0.3%BSA，以HEPES為緩沖體系的HEPES-HTF[2]；顆粒細胞去除液是不含蛋白質(zhì)，但含有透明質(zhì)酸酶（150 μg/mL）的HEPESHTF；胚胎培養(yǎng)液為含必需氨基酸、非必需氨基酸及0.3%BSA的KSOM[3]。所有鼠胚試驗用液都不含抗生素。

1.3 鼠胚試驗

鼠胚試驗的基本流程簡述如下[4]：選4～8周齡F1雜交CBA/C57雌鼠，經(jīng)腹腔注射PMSG（孕馬血清促性腺激素）；48 h后經(jīng)腹腔注射hCG（人絨毛膜促性腺激素），與同品系雄鼠合籠過夜。注射hCG后20 h斷頸處死見栓雌鼠，在輸卵管壺腹部收集絮狀受精卵團，并在顆粒細胞去除液中處理，當胚胎周圍的卵丘和顆粒細胞分離后立即取出。用卵母細胞緩沖液清洗3次后，挑選出正常形態(tài)的受精卵，轉(zhuǎn)移到預平衡的胚胎培養(yǎng)液微滴中，以10個胚胎/10 μL胚胎培養(yǎng)液液滴的密度，上面覆蓋大約2 mm厚的礦物油，在37oC、5% CO2和90%飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h。

1.4 囊胚總細胞和內(nèi)細胞團的染色和計數(shù)

利用免疫熒光試劑盒（南京優(yōu)而生物）實施囊胚總細胞和內(nèi)細胞團的染色和計數(shù)[5]。96 h后的囊胚在胚胎漂洗液內(nèi)漂洗3次；漂洗后移入固定液，在室溫下固定30 min，然后移至細胞膜打孔液30 min，再以胚胎漂洗液漂洗胚胎10 min，重復2次；將上述處理后的胚胎在室溫下置于體積比為30%的與二級抗體相同源的山羊血清中3 h以封殺非特異性的抗體結合位點；在4～20oC條件下將處理后的胚胎與2 μg/mL初級抗體兔抗UTF1結合8～16 h，再以胚胎漂洗液漂洗胚胎10 min，重復3次；在室溫避光條件下將胚胎與山羊抗兔二級抗體結合1 h；再以胚胎漂洗液漂洗胚胎10 min，重復3次。并與37oC預熱的碘化丙啶DNA染色液（prepedium iodine,PI）在室溫避光條件下孵化10 min；將胚胎移至加于制片液的玻片，制片。采用熒光顯微鏡 （Nikon,Japan）技術檢查胚胎表達UTF1和DNA染色液的內(nèi)細胞團細胞數(shù)和囊胚總細胞數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

囊胚形成率是以擴張優(yōu)質(zhì)囊胚占全部受精卵的百分比。三次實驗數(shù)據(jù)囊胚形成率、囊胚總細胞數(shù)和內(nèi)細胞團細胞數(shù)各組間的差異性通過t-test分析，P值表示了統(tǒng)計學意義的差異性。

2 結果

鼠胚試驗（mouse embryo assay，MEA）可以作為水質(zhì)的質(zhì)控檢測手段[6]。使用自來水（A）、去離子反滲透性水（B）、MilliQ超純化水（C）和無內(nèi)毒素無核酸的MilliQ超純化水（D）制備卵母細胞緩沖液、顆粒細胞去除液和胚胎培養(yǎng)液，進行鼠胚試驗和囊胚染色計數(shù)，發(fā)現(xiàn)這四種水直接影響配制的輔助生殖用液的質(zhì)量，間接影響了鼠胚試驗的胚胎發(fā)育。通過96 h的培養(yǎng)，計算囊胚的形成率，并通過免疫熒光技術分析表達UFT1的囊胚ICM的細胞數(shù)及用PI核染色的囊胚細胞總數(shù)。根據(jù)YY/T 1434—2016標準，體外鼠胚試驗體系來說，囊胚發(fā)育率超過80%為符合要求。對于一個質(zhì)量良好的囊胚，須滿足總細胞數(shù)大于50個，內(nèi)細胞團細胞數(shù)大于12個。

結果顯示CBA/C57F1雜交小鼠的受精卵在自來水(A)和去離子水(B)配制的培養(yǎng)液不能達到基本的MEA要求（表1）（圖1(A)和(B)），有22.2%左右的受精卵在用自來水配制的培養(yǎng)液中也能發(fā)育到囊胚，但囊胚細胞數(shù)（20.1±0.82）和ICM數(shù)（3.4±0.23）非常少，并且細胞形態(tài)明顯異常。用去離子水（B）配制的培養(yǎng)液能使62.2%受精發(fā)育到囊胚，但囊胚總細胞數(shù)（32.2±0.64）及ICM的細胞數(shù)（6.7±0.45）分別不能達到正常囊胚的要求。相比之下，MilliQ超純化水（C）和無內(nèi)毒素無核酸的MilliQ超純化水（D）（表1）（圖1(C)和(D)）含低水平的無機離子、總有機碳和內(nèi)毒素濃度，用MilliQ超純化水（C）和無內(nèi)毒素無核酸的MilliQ超純化水（D）制備的輔助生殖用液培養(yǎng)囊胚的囊胚形成率分別為84.4%和86.7%，囊胚總細胞數(shù)分別為53.4±0.45和56.6±0.52，囊胚內(nèi)細胞團分別為12.4±0.32和14.1±0.20，達到要求，其鼠胚試驗的結果的三項指標都比A和B組更好（P值均＜0.001），當然，在MilliQ超純化水的基礎上經(jīng)過超濾系統(tǒng)（BioPak ultrafiltration）處理制備的無內(nèi)毒素無核酸的MilliQ超純化水（D）的MEA結果更佳，表現(xiàn)為更多的囊胚總細胞數(shù)（P＜0.05）和ICM細胞數(shù)（P＜0.05）。不同種水對體外小鼠受精卵囊胚形成率和細胞數(shù)的影響，如表1、圖1所示。

綜合以上研究結果證明使用無內(nèi)毒素無核酸的超純化水制備的輔助生殖用液產(chǎn)品的鼠胚發(fā)育效果最好，囊胚總細胞數(shù)和內(nèi)細胞團數(shù)顯著高于其他三組，也證明了去除內(nèi)毒素和去除核酸物質(zhì)的處理對于輔助生殖用液類產(chǎn)品生產(chǎn)用水的重要性。

表1 不同種水對體外小鼠受精卵囊胚形成率和細胞數(shù)的影響Tab.1 Effect of different kinds of water on the development of mouse embryo in vitro

圖1 不同種水對體外小鼠受精卵發(fā)育的影響Fig.1 Effect of different kinds of water on the development of mouse embryo in vitro

3 討論

水是輔助生殖用液類產(chǎn)品的主要組成成分，許多研究人員研究了水質(zhì)對動物胚胎發(fā)育的影響[7-10]。Nagano的研究也證明了無蛋白培養(yǎng)基中水的質(zhì)量對牛卵母細胞，體外受精和發(fā)育的影響。

通過本研究，分析四種純化水的鼠胚試驗結果發(fā)現(xiàn)，超純化水和無內(nèi)毒素無核酸的超純化水配制的胚胎培養(yǎng)液，其鼠胚試驗的囊胚形成率和囊胚總細胞數(shù)及內(nèi)外細胞團數(shù)目的結果均令人滿意。值得注意的是，由于各國，甚至同一個國家不同地區(qū)的水的質(zhì)量不同，在建立ART用水制備生產(chǎn)工藝時必須因地制宜，特別在國產(chǎn)化的過程中，更要考慮到各種因素，如環(huán)境、地質(zhì)及污染等等。要盡可能避免內(nèi)毒素和核酸的污染。

影響輔助生殖用液質(zhì)量的關鍵因素包括了多個方面。細菌污染及其副產(chǎn)品是用水質(zhì)量最主要關注的因素。多種技術已經(jīng)可以最大限度地減少水中細菌的含量，如反滲透，0.22 μm過濾器過濾和紫外線照射。在純水貯存過程中也可能發(fā)生細菌污染。因此，在執(zhí)行ART流程時，最可取的是使用新鮮的純化水。另一個重要因素是離子和重金屬，如銅、鉛和鎘等。此外，嚴格地控制輔助生殖用液的滲透壓是非常重要的。因此，制備用水中的離子水平應保持在最低限度。人類輔助生殖產(chǎn)品用水是產(chǎn)品的組成成分，其質(zhì)控要求非常重要。隨著體外輔助生殖行業(yè)在中國的不斷發(fā)展，水質(zhì)的要求應根據(jù)產(chǎn)品質(zhì)量的要求進行嚴格控制。