納米金剛石對(duì)癲癇模型P65表達(dá)的影響*

都 昇， 宋君浩， 劉丹瓊， 張 欣， 王泳怡， 易 杭， 謝曉桐， 何 嫣， 朱曉琴

廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣州 511436

納米金剛石(Nanodiamond，ND)是新型的碳族納米材料，ND有較強(qiáng)的生物相容性[1]和較好的細(xì)胞吸收率[2-3]，無(wú)細(xì)胞毒性[3-4]，具有抗氧化作用[5]，且低濃度(50 μg/mL)的ND能降低炎性因子表達(dá)[6]。最新研究表明，每天定量使用ND的阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)大鼠在水迷宮第3或第4天尋找平臺(tái)時(shí)間就已經(jīng)接近對(duì)照組的水平，其機(jī)制可能與ND降低AD大鼠腦內(nèi)NF-κB以及炎性因子的水平有關(guān)，提示ND在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中具有應(yīng)用前景[7]。本課題組的ND采用激光液相燒蝕法一步合成，具有生物酶活性、催化活性、粒徑小、分散性好、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)[8]。

NF-κB是具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，作為轉(zhuǎn)錄因子參與多種炎癥基因的調(diào)控[9]。它由包括P65在內(nèi)的5個(gè)成員組成[10]。NF-κB的激活與癲癇的神經(jīng)病理過(guò)程密切相關(guān)[11-12]。研究表明，NF-κB亞單位P65的表達(dá)和磷酸化在癲癇時(shí)顯著增加[13-14]，而抑制NF-κB，則可以減少驚厥發(fā)作[12]，提示NF-κB P65可能與癲癇有關(guān)。

本課題組前期研究表明，癲癇時(shí)P65及下游IL-1β、IL-6[15-16]等炎性因子表達(dá)水平上升，硫化氫可以下調(diào)P65的水平從而減少IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子的生成，抑制癲癇發(fā)作[17]。ND在神經(jīng)系統(tǒng)取得了廣泛的應(yīng)用，但能否對(duì)癲癇起抑制作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究選擇ND進(jìn)行干預(yù)，觀察并記錄其對(duì)癲癇動(dòng)物模型的影響，對(duì)癲癇神經(jīng)元活性的影響以及對(duì)癲癇發(fā)作后NF-κB P65表達(dá)水平的影響，以探討ND抗癲癇的可能機(jī)制，為癲癇治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 納米金剛石的準(zhǔn)備 納米金剛石由廣州醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)材料研究室田秀梅副研究員提供，采用激光液相燒蝕法制備，在溶液中分布均勻，平均粒徑3.63 nm。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生(24 h內(nèi))的Sprague-Dawley(SD)乳鼠，SPF級(jí)，雌雄不限；成年健康SD大鼠48只，雄性，體重(250±30)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)條件下飼養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清、Neurobasal Medium培養(yǎng)液、B-27添加劑購(gòu)自Gibco公司；細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)購(gòu)自DOJINDO公司；戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)購(gòu)自Macklin公司；Biozol試劑購(gòu)自博日科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購(gòu)自ToYoBo公司；引物合成由上海Invitrogen生物工程公司完成；兔抗大鼠GAPDH、P65單克隆抗體購(gòu)自CST公司；兔抗大鼠β-actin單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；BeyoECL Plus購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。主要儀器設(shè)備：熒光定量PCR儀(ABI7500 Fast)；熒光顯微鏡(Olympus公司)；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Thermo公司)；垂直電泳儀(Bio-Rad公司)等。

1.1.4 材料配制 種植培養(yǎng)液配制：體積分?jǐn)?shù)90% DMEM/F12培養(yǎng)液，10%胎牛血清，1×105U/L青霉素和鏈霉素。維持培養(yǎng)液配制：98% Neuralbasal培養(yǎng)液，2%B-27添加劑，0.2 mol/LL-谷氨酰胺，1×105U/L青霉素和鏈霉素。無(wú)鎂細(xì)胞外液配制：NaCl 145 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，HEPES緩沖液10 mmol/L，CaCl22 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，甘氨酸0.002 mmol/L，溶于1000 mL去離子水，NaOH調(diào)pH值7.0～7.2，過(guò)濾除菌。正常細(xì)胞外液配制：上述配方補(bǔ)充MgCl21 mmol/L，NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2，過(guò)濾除菌。

1.2 原代海馬神經(jīng)元分離培養(yǎng)

新生SD乳鼠，消毒，斷頭，取海馬于D-hank’s溶液中，剪碎，0.25%胰蛋白酶37℃恒溫水浴箱消化20 min，血清終止消化，200目細(xì)胞篩過(guò)濾，濾液1000 r/min離心5 min后棄上清，加入種植培養(yǎng)液重懸。種板后放入37.5℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，換用維持培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h相同培養(yǎng)液全量換液，隨后每隔2 d維持培養(yǎng)液全量換液，倒置顯微鏡定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性

使用96孔板。每孔中加入10 μL CCK-8溶液并在37℃下孵育1 h，得到橙色的formazan，其吸光度(A)與海馬神經(jīng)元的活細(xì)胞數(shù)呈正比。酶標(biāo)儀中450 nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的A值。

1.4 CCK-8法進(jìn)行納米金剛石最佳濃度的測(cè)定

用PBS稀釋ND至500 μg/mL。將海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為5組，用ND和維持培養(yǎng)液制備下列濃度ND：①正常對(duì)照組(ND 0 μg/mL)；②ND 10 μg/mL組；③ND 20 μg/mL組；④ND 50 μg/mL組；⑤ND 100 μg/mL組。培養(yǎng)9 d的96孔板神經(jīng)元以上述溶液處理24 h，CCK-8法測(cè)定A值，讀數(shù)代表不同濃度下細(xì)胞活性。

1.5 細(xì)胞分組與造模

按照Sombati等[18]的方法建立海馬神經(jīng)元癲癇狀態(tài)細(xì)胞模型。在6/96孔板中培養(yǎng)9 d的海馬神經(jīng)元用于以下評(píng)估。將細(xì)胞隨機(jī)分成4組：①對(duì)照組(Control)：正常細(xì)胞外液處理3 h，維持培養(yǎng)液處理24 h；②致癇組(EPI)：無(wú)鎂細(xì)胞外液預(yù)處理3 h，維持培養(yǎng)液處理24 h；③ND干預(yù)組(ND + EPI)：含20 μg/mL ND的維持培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)4 h，無(wú)鎂細(xì)胞外液處理3 h，恢復(fù)ND維持培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；④ND對(duì)照組(ND)：處理方法同上，無(wú)鎂細(xì)胞外液改為正常細(xì)胞外液。

1.6 側(cè)腦室注射

大鼠稱重，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)后麻醉，固定在腦立體定位儀上，2枚鋼針尖端分別對(duì)準(zhǔn)耳蝸固定頭顱，牙齒固定針固定牙齒。剪開(kāi)皮膚，剝離筋膜暴露前囟，根據(jù)Paxinos等[19]的方法坐標(biāo)定位：前囟后0.9 mm，矢狀縫旁開(kāi)1.6 mm，硬腦膜下4.0 mm，為側(cè)腦室注藥點(diǎn)，鉆孔，微量注射器以2 μL/min的速度注射。ND對(duì)照組與ND干預(yù)組側(cè)腦室注射100 μg/mL ND[3]10 μL，對(duì)照組與致癇組注射等劑量生理鹽水。留針10 min，緩慢退出，縫合傷口并消毒。

1.7 動(dòng)物分組與戊四氮誘導(dǎo)癲癇

將大鼠隨機(jī)分為與細(xì)胞分組相同的4組，每組12只大鼠。PTZ溶于生理鹽水中配成1%溶液。癲癇模型制備：于側(cè)腦室注射完成2 h后，致癇組(EPI)，ND干預(yù)組(ND+ EPI)采用首劑PTZ(40 mg/kg)腹腔注射，觀察大鼠行為學(xué)變化，若10 min后未觀察到典型發(fā)作，則再以原始劑量的半量(20 mg/kg)注射，之后每隔10 min補(bǔ)加小劑量PTZ(10 mg/kg)，直至大鼠癲癇發(fā)作，記錄每組癲癇發(fā)作級(jí)別、潛伏期、持續(xù)發(fā)作時(shí)間。對(duì)照組，ND對(duì)照組大鼠給予等劑量生理鹽水腹腔注射。根據(jù)Racine癲癇發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)[20]評(píng)估癲癇發(fā)作強(qiáng)度。0級(jí)：無(wú)發(fā)作；Ⅰ級(jí)：口周及頭面部肌肉抽搐；Ⅱ級(jí)：頭面部痙攣伴點(diǎn)頭樣發(fā)作；Ⅲ級(jí)：前肢陣攣發(fā)作；Ⅳ級(jí)：前肢強(qiáng)直陣攣發(fā)作伴隨直立；Ⅴ級(jí)：全身強(qiáng)直發(fā)作伴摔倒。其中Ⅰ～Ⅱ級(jí)為輕型發(fā)作，Ⅲ～Ⅴ級(jí)為重型發(fā)作。

1.8 腦電圖(EEG)記錄

各組大鼠麻醉后稱重。固定，定位海馬區(qū)(大腦左側(cè)后3.8 mm，矢狀縫旁邊2.5 mm)，鉆孔并通過(guò)硬腦膜將電極植入硬膜下3.0 mm?？p合部分皮膚，活性碘消毒，將大鼠置于屏蔽籠中。待大鼠清醒后引導(dǎo)電極信號(hào)通過(guò)BL-420S生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，一邊腹腔注射PTZ一邊記錄大鼠癲癇發(fā)作時(shí)海馬腦電圖的變化。記錄時(shí)間為1 h。

1.9 Western blot檢測(cè)海馬組織或神經(jīng)元P65蛋白的表達(dá)

各組造模成功4 h后SD大鼠麻醉處死，取海馬組織或培養(yǎng)至第9天造模完成的海馬神經(jīng)元，RIPA裂解提取蛋白，4℃ 12000 r/min離心5 min，取上清。BCA法定量，10%SDS-PAGE垂直電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉1.5 h，TBST漂洗，兔抗大鼠P65單克隆抗體(1∶1000)和兔抗大鼠β-actin(1∶3000)或兔抗大鼠GAPDH(1∶3000)4℃下孵育過(guò)夜，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5000)室溫下孵育1 h后進(jìn)行ECL顯色，蛋白條帶采用Bio-Rad成像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。使用Image J軟件測(cè)定所得條帶灰度值，P65蛋白表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化以GAPDH/β-actin作為內(nèi)參處理。

1.10 qRT-PCR檢測(cè)海馬組織或神經(jīng)元P65 mRNA的表達(dá)

每50 mg大鼠海馬組織溶于500 μL Biozol，神經(jīng)元細(xì)胞6孔板每孔加入Biozol 200 μL提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。β-actin的引物序列：上游5′-GGAGATTACTGCCCGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為150 bp。NF-κB P65的引物序列：上游5′-CGATCTGTTTCCCCTCATCT-3′，下游5′-ATTGGGTGCGTCTTAGTGGT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為275 bp。qRT-PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 s；55℃ 10 s，72℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 15 mins，95℃ 15 s。分析P65和β-actin RNA循環(huán)閾值(Ct)之差(ΔCt)計(jì)算得到相關(guān)基因的表達(dá)情況。計(jì)算對(duì)比的樣本間基因表達(dá)的差異(ΔΔCt)，表達(dá)差異的倍數(shù)(relative quantity，RQ)為2-ΔΔCt，以對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量RQ值為1，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)表達(dá)量是相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)[21]。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測(cè)不同濃度納米金剛石對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性的影響

使用CCK-8法檢測(cè)不同濃度ND對(duì)海馬神經(jīng)元活性的影響。不同濃度ND作用于神經(jīng)元細(xì)胞24 h，各濃度ND組吸光度分別為：10 μg/mL組(1.042±0.079)，20 μg/mL組(1.205±0.028)，50 μg/mL組(1.153±0.016)，100 μg/mL組(1.143±0.015)；正常對(duì)照組吸光度(1.096±0.002)。各濃度ND組與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞活性未見(jiàn)下降，表明10、20、50、100 μg/mL濃度的ND在共孵育24 h不引起細(xì)胞毒性，與細(xì)胞相容良好，并在20 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活性達(dá)到最高值，相比其他濃度增高更明顯，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 CCK-8檢測(cè)ND對(duì)癲癇細(xì)胞模型的影響

結(jié)果顯示，無(wú)鎂細(xì)胞外液處理后，各組的A值分別為：對(duì)照組(0.553±0.007)，EPI組(0.281±0.009)，ND+EPI組(0.463±0.032)，ND組(0.525±0.014)。EPI組、ND+EPI組與對(duì)照組比較A值明顯降低，表明EPI組、ND+ EPI組細(xì)胞活性下降(均P<0.05)，說(shuō)明無(wú)鎂細(xì)胞外液處理造成的病理性癲癇狀態(tài)會(huì)造成神經(jīng)元損傷和細(xì)胞凋亡；但與EPI組相比，ND+EPI組A值提高，即細(xì)胞活性相對(duì)增高(P<0.05)，說(shuō)明ND對(duì)癲癇海馬神經(jīng)元有一定保護(hù)作用。ND對(duì)照組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 大鼠行為學(xué)表現(xiàn)

模型組24只大鼠中有4只死亡，其余20只均有癲癇發(fā)作，造模成功率為83.3%。EPI組大鼠在注射PTZ后，依次出現(xiàn)Ⅰ～Ⅴ級(jí)發(fā)作的表現(xiàn)，其潛伏期短(20.40±4.61)min，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)(101.60±11.24)s，發(fā)作等級(jí)為Ⅳ～Ⅴ級(jí)(M=4.5)；ND(100 μg/mL)+EPI組在多次腹腔注射PTZ后造模成功，較EPI組其癲癇發(fā)作潛伏期[(28.40±7.56)min]明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，持續(xù)時(shí)間[(66.40±10.14)s]縮短(P<0.05)，發(fā)作等級(jí)為Ⅲ～Ⅳ級(jí)(M=3.5)，較EPI組下降(P<0.05)。對(duì)照組、ND組的大鼠注射生理鹽水后發(fā)作等級(jí)為0級(jí)，見(jiàn)圖1。

A：癲癇發(fā)作等級(jí)中位數(shù)；B：潛伏期；C：持續(xù)時(shí)間；與致癇組(EPI)比較，*P<0.05圖1 各組癲癇大鼠行為學(xué)數(shù)據(jù)Fig.1 The behavioral data of epileptic rats

2.4 腦電圖檢測(cè)結(jié)果

腦電圖檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組(57.465±4.502)μV、ND組(67.211±3.131)μV，未出現(xiàn)癇樣波，為正常腦電圖波形，波形規(guī)律，波幅小；EPI組(192.465±5.548)μV，記錄到明顯的尖波、棘波等癇樣波，腦電波幅明顯增大，ND+EPI組(132.915±3.448)μV，癇樣波減弱或消失，波幅較EPI組減小(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.5 qRT-PCR檢測(cè)癲癇細(xì)胞模型/大鼠海馬P65 mRNA表達(dá)

海馬細(xì)胞體外培養(yǎng)的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果分析顯示，與對(duì)照組相比，EPI組、ND+EPI組P65 mRNA表達(dá)增高，其中EPI組表達(dá)最高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與EPI組相比，ND+EPI組P65 mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。海馬組織的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果分析顯示，與對(duì)照組相比，EPI組、ND+EPI組P65 mRNA表達(dá)增高(均P<0.05)。與EPI組相比，ND+EPI組P65 mRNA的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.6 Western blot檢測(cè)癲癇細(xì)胞模型/大鼠海馬P65蛋白表達(dá)

海馬細(xì)胞體外培養(yǎng)的Western blot結(jié)果分析顯示，與對(duì)照組相比，EPI組、ND+EPI組P65蛋白表達(dá)增高，其中EPI組表達(dá)最高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與EPI組相比，ND+EPI組P65蛋白的表達(dá)降低(P<0.05)。海馬組織的Western blot結(jié)果分析顯示，與對(duì)照組相比，EPI組、ND+EPI組P65蛋白表達(dá)量增高，其中EPI組表達(dá)最高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與EPI組相比，ND+EPI組P65蛋白的表達(dá)相對(duì)降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

A：對(duì)照組腦電圖波形；B：EPI組腦電圖波形；C：ND+EPI組腦電圖波形；D：ND組腦電圖波形；E：各組波幅比較；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與致癇組(EPI)比較，#P<0.05圖2 各組大鼠海馬腦電記錄Fig.2 Electroencephalogram(EEG)of rat hippocampus in each group

A：細(xì)胞P65 mRNA表達(dá)情況；B、C：細(xì)胞P65蛋白表達(dá)情況；D：海馬組織P65 mRNA表達(dá)情況；E、F：海馬組織P65蛋白表達(dá)情況；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與致癇組(EPI)比較，#P<0.05圖3 各組細(xì)胞及海馬組織P65 mRNA及蛋白表達(dá)情況Fig.3 The expression levels of P65 mRNA and protein in hippocampal neurons and hippocampal tissue

3 討論

ND是一種新型的納米材料，近年來(lái)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有較大的研究進(jìn)展。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)不同濃度的ND對(duì)海馬神經(jīng)元進(jìn)行孵育，發(fā)現(xiàn)ND不會(huì)降低細(xì)胞活性，且在20 μg/mL時(shí)明顯提高神經(jīng)元的活性，進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射ND不會(huì)引起動(dòng)物腦電圖的改變。研究表明，在使用ND對(duì)不同系統(tǒng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性和遺傳毒性的測(cè)試中，低濃度的ND(<250 μg/mL)無(wú)細(xì)胞毒性，且可以被吸收[4]。此外，ND可以減少γ射線對(duì)紅細(xì)胞帶來(lái)的損傷[5]。在神經(jīng)系統(tǒng)的研究表明，ND可以被神經(jīng)細(xì)胞吸收，且不產(chǎn)生細(xì)胞毒性，通過(guò)顱內(nèi)注射也不會(huì)引起大鼠行為改變[3]。

正常情況下，NF-κB與抑制性蛋白結(jié)合，以非活性形式存在于細(xì)胞核外，當(dāng)受到刺激活化后，進(jìn)入核中與靶基因驅(qū)動(dòng)子κB上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)編碼趨化因子、細(xì)胞因子、粘附分子、炎癥反應(yīng)相關(guān)酶和抑制凋亡因子等炎性反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[22]。PTZ和無(wú)鎂細(xì)胞外液廣泛用于動(dòng)物和神經(jīng)細(xì)胞癲癇造模[18]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在不同的癲癇模型中，NF-κB激活增加且表達(dá)升高[23-24]。N-甲基-d-天冬氨酸(NMDA)受體是一種由不同亞基構(gòu)成的異聚體復(fù)合物，其表達(dá)增多會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元興奮毒性，是導(dǎo)致癲癇的重要原因之一[25]。研究表明，NF-κB亞單位P65在NMDA導(dǎo)致的興奮毒性的細(xì)胞核中積聚；通過(guò)沉默P65的表達(dá)，可以延緩NMDA誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的損傷[26]。因此，NMDA受體過(guò)度激活誘導(dǎo)的興奮毒性與P65水平的提高關(guān)系密切。我們的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，致癇組的P65在mRNA和蛋白質(zhì)水平相比對(duì)照組明顯提高，與上述研究結(jié)果相符，其表達(dá)水平上升可能與NMDA在癲癇狀態(tài)下表達(dá)增高有關(guān)。

為了探究ND能否對(duì)癲癇起抑制作用，我們使用CCK-8法檢測(cè)不同組別的乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)致癇組、ND干預(yù)組相比對(duì)照組細(xì)胞活性下降，但ND干預(yù)組的細(xì)胞活性較致癇組提高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，致癇組癲癇發(fā)作迅速，癇樣波明顯；ND干預(yù)組較致癇組癲癇發(fā)作潛伏期明顯延長(zhǎng)，而癇樣波減弱。以上結(jié)果說(shuō)明ND可以抑制大鼠的癲癇發(fā)作。

為進(jìn)一步探究ND抑制癲癇的機(jī)制，我們對(duì)乳鼠海馬神經(jīng)元和大鼠海馬組織進(jìn)行了Western blot和qRT-PCR分析。結(jié)果表明，致癇組的P65蛋白/mRNA水平升高，而ND干預(yù)組的P65蛋白/mRNA水平相比致癇組明顯下降，與Alawdi等[7]在老年癡呆大鼠的研究中的結(jié)論相符，其進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，NF-κB水平下調(diào)使信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)的磷酸化水平增加以及B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(bcl-2)表達(dá)水平下降，減少AD神經(jīng)元的凋亡，提示ND下調(diào)NF-κB水平從而緩解AD可能與減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。同時(shí)，ND可以顯著降低巨噬細(xì)胞中炎性因子(TNF-α、CCL2以及IL-1β)的基因表達(dá)[6]。因此，我們推測(cè)ND抑制癲癇的可能機(jī)制為：通過(guò)下調(diào)NF-κB的水平，減少炎性因子，以此抑制癲癇發(fā)作。

研究表明，ND具有與金剛烷類似的金剛烷核結(jié)構(gòu)，后者可通過(guò)優(yōu)先阻斷NMDA受體的過(guò)度激活來(lái)延緩AD的發(fā)展，且不會(huì)破壞正常的神經(jīng)元活動(dòng)[7]。本研究表明，ND可以通過(guò)下調(diào)NF-κB的水平從而抑制癲癇發(fā)作；沉默NF-κB亞單位P65又可以延緩NMDA誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷。ND是否也能通過(guò)類似金剛烷的機(jī)制來(lái)阻斷癇性發(fā)作時(shí)NMDA受體的過(guò)度激活，從而抑制癲癇，還有待進(jìn)一步研究。