右美托咪定通過Trx1/AMPK通路減輕心肌缺血再灌注損傷中的氧化應(yīng)激*

吳志林， 朱 軼

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科，武漢 430022

右美托咪定是一種高選擇性腎上腺素能α2受體激動(dòng)劑，能夠減少交感張力，減慢心率，降低心肌氧耗，產(chǎn)生心肌保護(hù)作用，同時(shí)還可以減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，減少術(shù)后譫妄的發(fā)生。在臨床上該藥物廣泛用于ICU患者的鎮(zhèn)靜以及手術(shù)患者的輔助麻醉[1]。研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定對(duì)缺血再灌注損傷具有較強(qiáng)的保護(hù)作用。行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)手術(shù)或者冠脈搭橋術(shù)的冠心病患者使用右美托咪定能夠減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)心臟功能的恢復(fù)，從而改善患者預(yù)后[2]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌缺血再灌注模型中使用右美托咪定預(yù)處理能夠減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低炎癥因子的表達(dá)[3]，提示右美托咪定可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生保護(hù)作用。然而，右美托咪定如何參與氧化應(yīng)激的分子機(jī)制仍然不清楚。硫氧還蛋白-1(Thioredoxin-1，Trx1)是心肌內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激分子，并且與AMP激活的蛋白激酶(AMPK)通路關(guān)系密切，本研究擬對(duì)右美托咪定在心肌缺血再灌注Trx1/AMPK通路中的作用進(jìn)行研究，探索其在減輕心肌缺血再灌注損傷中氧化應(yīng)激的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

雄性SD大鼠30只，體重250～300 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。兔抗AMPK一抗，兔抗p-AMPK一抗，購自美國(guó)CST公司；兔抗Trx1一抗，購自美國(guó)Abclonal公司；TUNEL試劑盒購自瑞士Roche公司；ROS試劑盒購自江蘇碧云天公司。

1.2 動(dòng)物模型制備及各組實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)，心肌缺血再灌注組(Ischemia/Reperfusion，I/R組)，右美托咪定預(yù)處理+心肌缺血再灌注組(Dex組)。每組10只。經(jīng)腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，將大鼠固定于操作臺(tái)，連接心電圖并監(jiān)測(cè)。手術(shù)部位消毒后分離右側(cè)股動(dòng)靜脈并分別置管。右美托咪定組給予右美托咪定5 μg/kg負(fù)荷劑量后，以5 μg/(kg·h)持續(xù)輸注1 h，其他組給予等量生理鹽水輸注，同時(shí)股動(dòng)脈置管連接powerlab采集系統(tǒng)記錄血壓。輸注結(jié)束后分離氣管，插入氣管導(dǎo)管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，潮氣量10 mL/kg，呼吸頻率80～100次/min，剪開左側(cè)胸壁，暴露胸腔，剪開心臟包膜，顯露心臟，左心耳下緣結(jié)扎冠脈左前降支30 min，以心電圖出現(xiàn)ST段抬高或者與高聳T波融合為結(jié)扎成功的標(biāo)志，然后再灌注120 min。假手術(shù)組按照相同的方法進(jìn)行麻醉、開胸及左心耳下緣穿線操作，但不進(jìn)行結(jié)扎。

1.3 標(biāo)本采集和測(cè)定

各組在行缺血再灌注結(jié)束后麻醉狀態(tài)下迅速放血處死大鼠取出心臟，摘除結(jié)扎線以下的左心室心肌組織，取出后用生理鹽水反復(fù)沖洗。取適量心肌組織制成10%勻漿，1000×g，4℃離心10 min，棄沉淀，取上清，依據(jù)說明書測(cè)定心肌組織活性氧(ROS)含量，另取適量組織裂解后Western blot檢測(cè)Trx1和AMPK、p-AMPK蛋白表達(dá)。其余組織石蠟包埋，按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行染色，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行染色，細(xì)胞核染成藍(lán)色；TUNEL染色，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核染成棕色。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)比較

采用股動(dòng)脈置管方法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血壓，利用Powerlab軟件計(jì)算平均動(dòng)脈壓(MAP)。結(jié)果顯示3組在持續(xù)輸液期間血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)并無顯著差異，持續(xù)輸注右美托咪定并未引起顯著的血流動(dòng)力學(xué)改變。缺血再灌注期間，Dex組的心率(HR)和血壓較I/R組得到明顯改善(均P<0.05)。見圖1。

與Sham組比較，*P<0.05 **P<0.01；與I/R組比較，#P<0.05；n=10圖1 心肌缺血再灌注各組血流動(dòng)力學(xué)比較Fig.1 Comparison of hemodynamics in ischemia/reperfused hearts

2.2 心肌細(xì)胞凋亡率的比較

采用TUNEL染色后，I/R組心肌細(xì)胞凋亡率為(27.93±2.41)%，較Sham組(3.33±0.83)%顯著增加(P<0.01)，Dex組為(18.54±1.94)%，與I/R組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 心肌組織ROS的變化

與Sham組比較，I/R組和Dex組心肌組織ROS水平顯著升高(分別P<0.01，P<0.05)，而Dex組與I/R組相比，ROS水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

與Sham組比較，**P<0.01；與I/R組比較，#P<0.05；n=10圖2 缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡率的比較Fig.2 Comparison of myocardial cell apoptosis rates in ischemia/reperfused myocardial tissue

與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01；與I/R組比較，#P<0.05；n=10圖3 缺血再灌注心肌組織ROS水平的比較Fig.3 Comparison of ROS levels in ischemia/reperfused myocardial tissues

2.4 心肌組織Trx1和AMPK磷酸化水平表達(dá)變化

Western blot檢測(cè)提示，I/R組和Dex組與假手術(shù)組相比磷酸化AMPK水平顯著增高，Trx1蛋白含量顯著降低，而Dex組Trx1表達(dá)較I/R組顯著升高，同時(shí)AMPK磷酸化水平進(jìn)一步升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖4。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是發(fā)生于缺血性心臟病血管再通手術(shù)后一種常見的病理生理現(xiàn)象，表現(xiàn)為缺血心肌恢復(fù)了血供，但是梗塞的面積不見縮小，反而進(jìn)一步擴(kuò)大，導(dǎo)致患者的死亡率增加。近年來，缺血再灌注對(duì)心肌所帶來的危害受到越來越多的關(guān)注，對(duì)心肌缺血再灌注損傷的研究在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)成為熱點(diǎn)，怎樣能夠降低心肌缺血再灌注損傷，如何增加臨床治療的安全性，從而提高患者的滿意度，成為麻醉醫(yī)師需要關(guān)注的一個(gè)問題。

與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01；與I/R組比較，#P<0.05；n=10圖4 缺血再灌注心肌組織中Trx1、AMPK磷酸化水平的比較Fig.4 Comparison of Trx1，AMPK phosphorylation levels in ischemia/reperfused myocardial tissues

研究表明缺血再灌注后由線粒體產(chǎn)生的大量ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一。ROS通過細(xì)胞膜和細(xì)胞器脂質(zhì)過氧化、氧化DNA、激活基質(zhì)金屬蛋白酶和鈣蛋白酶等多種途徑直接損傷細(xì)胞[4]。另外，細(xì)胞內(nèi)氧化還原應(yīng)激促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯后的氧化修飾，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，心肌細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，心功能嚴(yán)重受損，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的不可逆的心臟器質(zhì)性損傷。

正常生理情況下，ROS造成的氧化應(yīng)激通常被硫氧還蛋白(Trx)和谷胱甘肽等所清除[5]。Trx1是Trx家族調(diào)節(jié)心臟氧化應(yīng)激水平的主要亞型，在心臟中大量表達(dá)。Trx1通過硫醇-二硫鍵交換反應(yīng)還原被ROS氧化的蛋白，從而還原被氧化的關(guān)鍵蛋白分子，維持細(xì)胞氧化還原水平的穩(wěn)態(tài)[6]。另外，Trx1是激活A(yù)MPK活化過程中必不可少的關(guān)鍵因子。在心肌缺血再灌注過程中，AMPK活化(磷酸化)可以調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪酸代謝、線粒體功能、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬和凋亡等等，在心肌缺血等應(yīng)激條件下發(fā)揮著保護(hù)作用[7]。Trx1通過與AMPK之間的氧化還原反應(yīng)，維持AMPK的活性，同時(shí)AMPK活性的增強(qiáng)也可以促進(jìn)Trx1的活性，增強(qiáng)其調(diào)節(jié)氧化還原的能力[8]。然而，過量的ROS會(huì)引發(fā)Trx1的降解，造成細(xì)胞清除ROS能力下降，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的增加，從而加重細(xì)胞損傷[9]。我們的研究也證實(shí)了心肌缺血再灌注后細(xì)胞氧化應(yīng)激增加，同時(shí)Trx1蛋白水平顯著降低，提示心肌缺血再灌注過程產(chǎn)生的氧化應(yīng)激導(dǎo)致Trx1水平下降。因此，提高缺血心肌中的Trx1水平對(duì)減輕心肌缺血再灌注產(chǎn)生的氧化應(yīng)激尤為重要。

近年來，一系列研究證實(shí)右美托咪定在多個(gè)動(dòng)物模型，包括急性腎損傷、腦缺血損傷及肝缺血損傷模型中顯著減輕了氧化應(yīng)激水平[10-12]。我們前期研究也同樣顯示，右美托咪定可以減輕大鼠心肌缺血再灌注中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，然而右美托咪定減輕氧化應(yīng)激的機(jī)制尚不明確。在本研究中，我們采用右美托咪定預(yù)處理后，缺血再灌注損傷導(dǎo)致的血流動(dòng)力學(xué)紊亂能夠顯著改善。為探索其可能的分子機(jī)制，我們對(duì)氧化應(yīng)激和Trx1信號(hào)通路進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)缺血心肌中Trx1水平得到顯著恢復(fù)，從而有效降低了缺血再灌注心肌組織的ROS水平，減輕了心肌缺血再灌注損傷中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，同時(shí)右美托咪定增加的Trx1進(jìn)一步提高了缺血心肌中AMPK磷酸化水平，增強(qiáng)了AMPK通路對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用。通過上述機(jī)制，右美托咪定減少了缺血再灌注后心肌細(xì)胞的凋亡，達(dá)到了顯著的心肌保護(hù)作用。

綜上所述，我們認(rèn)為右美托咪定降低了心肌缺血再灌注過程中的氧化應(yīng)激，減少了細(xì)胞凋亡，對(duì)缺血再灌注心肌有著顯著的保護(hù)作用。該保護(hù)作用可能是通過Trx1/AMPK通路實(shí)現(xiàn)。然而心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)信號(hào)通路，本研究只對(duì)Trx1/AMPK通路進(jìn)行了初步探討，深入研究右美托咪定對(duì)其他通路蛋白或分子的影響，對(duì)明確右美托咪定保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制有重要意義。