基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療2型糖尿病有效成分及作用機(jī)制

王慶學(xué) 吳雍真 李 倩 杜海洋 劉春艷 柴藝匯

【摘 要】 目的：探討黃芪治療2型糖尿?。═2DM）的有效成分及潛在靶點(diǎn)。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺數(shù)據(jù)庫（TCMSP）篩選黃芪的有效成分，并收集對應(yīng)的作用靶點(diǎn);使用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取T2DM相關(guān)靶點(diǎn)，并篩選黃芪有效成分與T2DM的交集靶點(diǎn)，采用Cytoscape v3.7.2軟件和String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”及蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析;通過DAVID數(shù)據(jù)庫對核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋和KEGG通路富集分析。結(jié)果：篩選出黃芪有效成分20個，與T2DM交集靶點(diǎn)57個?！八幬?活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)中Degree排前5的成分為槲皮素、山萘酚、異鼠李素、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮。GO功能注釋與KEGG通路富集分析共得到116個GO注釋，46條KEGG通路，按P值大小，篩選出靠前20個GO注釋和KEGG富集通路。結(jié)論：結(jié)果顯示黃芪治療T2DM的主要有效成分與潛在作用機(jī)制具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路等特點(diǎn)，為后續(xù)深入探討其具體機(jī)制提供思路和基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 網(wǎng)絡(luò)藥理;黃芪;2型糖尿病;有效成分;靶點(diǎn)1

【中圖分類號】R285 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2020）15-0040-07

Abstract：Objective To explore the effective components and potential targets of Astragalus in the treatment of Type 2 diabetes mellitus（T2DM）.Method Screening of active ingredients in Astragalus membranaceus with TCMSP database and collection of corresponding targets. Use GeneCards and OMIM database to obtain T2DM related targets， and select intersection targets of active ingredients of Astragalus and T2DM，Cytoscape v3.7.2 software and String database were used to construct and analyze “drug-active ingredient-target protein-disease” and protein-protein interaction （PPI） network;Gene ontology（GO） annotation and KEGG pathway enrichment analysis of core targets were performed through the DAVID database. Results 20 effective components of Astragalus were screened， and 57 targets were intersected by T2DM.The top 5 components of Degree in the “Drug-Active Ingredients-Target Proteins-Disease” network are quercetin， kaempferol， isorhamnetin， formononetin，Calycosin.GO and KEGG pathway enrichment analysis obtained a total of 116 GO enrichment results， 46 KEGG signaling pathways.Conclusions The results show that the main active ingredients and potential mechanisms of astragalus treatment of T2DM have the characteristics of Multi-component，multiple targets， multiple pathways， etc.， which provides ideas and foundation for further discussion of its specific mechanism.

Keywords：Network Pharmacology;Astragalus Membranaceus;Type 2 Diabetes Mellitus;Active Ingredients;Target

2型糖尿?。═ype 2 Diabetes Mellitus;T2DM）是由于胰島素抵抗與胰島β細(xì)胞功能失常導(dǎo)致碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪代謝異常，以高血糖為特征的代謝性疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國糖尿病患者數(shù)量位居世界首位，僅在2015年就約有130萬人因糖尿病及其并發(fā)癥死亡，且其中60歲以下占總死亡人數(shù)40.8%，呈逐漸低齡化的趨勢，并且國際糖尿病聯(lián)盟預(yù)測，到2040年我國將有1.51億糖尿病患者[2]?，F(xiàn)階段臨床上對T2DM的治療主要為口服傳統(tǒng)降糖藥、注射胰島素等為主，雖可一定程度控制病情，但很難從根本上治愈T2DM[3]。因此，對T2DM的防治急需研發(fā)出安全高效的新方法。T2DM歸屬中醫(yī)“消渴”范疇，與西醫(yī)相比中醫(yī)重視辨證論治、內(nèi)外并重，不僅療效良好、副作用低，還可有效緩解并發(fā)癥的發(fā)生，提高患者的生活質(zhì)量。

中藥黃芪（Astragali Radix） 已有2000多年的藥用史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽、斂瘡生肌、利尿消腫、固表止汗、補(bǔ)益腎氣等功效[4-5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗感染、糖尿病、心血管疾病等方面具有重要作用[6]。 通過對臨床上治療T2DM有效的中醫(yī)藥方劑進(jìn)行收集、整理、分析發(fā)現(xiàn)黃芪用藥頻次較高，為治療T2DM的常用藥[7]。研究顯示，黃芪甲苷可通過調(diào)節(jié)糖脂代謝、炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗等方面防治糖尿病[8]，同時臨床觀察也顯示中藥黃芪對T2DM的防治顯示出良好的療效[9]。黃芪防治T2DM具有多成分、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，故藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制難以明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可多方位揭示藥物治療疾病的潛在作用機(jī)制，涉及多個學(xué)科的技術(shù)與知識。已有研究表明，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥的作用機(jī)制符合中醫(yī)藥整體作用特點(diǎn)，方法準(zhǔn)確可靠[10]。鑒于此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選藥物的活性成分及黃芪防治T2DM的潛在靶點(diǎn)，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)，對靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，探討其潛在作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 篩選黃芪有效活性成分與T2DM靶蛋白 通過TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫搜集黃芪的化學(xué)成分;以口服生物利用度（OB）≥30，藥物相似度（DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，篩選黃芪有效活性成分，并查詢有效活性成分相對應(yīng)的靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫（[BF]https：//www.genecards.org/）[BFQ]、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）獲得T2DM相關(guān)靶點(diǎn)。所得化合物的靶點(diǎn)與T2DM靶點(diǎn)取交集，使用Cytoscape v3.7.2軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶蛋白-疾病可視化聯(lián)系。

1.2 構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將交集得到靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)（PPI）互作網(wǎng)絡(luò)。將Degree從大至小排序，以前30為標(biāo)準(zhǔn)篩選核心靶點(diǎn)。

1.3 GO功能富集分析和KEGG富集分析 將1.2篩選出的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov），以人類為研究對象進(jìn)行GO（gene ontology）注釋和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，將P值設(shè)為小于0.01。其中GO分析包括生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）。

2 結(jié)果

2.1 黃芪有效成分及靶蛋白分析 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“黃芪”獲得成分87個，通過相關(guān)條件篩選得到黃芪有效成分20個（如表1所示），并查詢獲得有效活性成分相對應(yīng)的靶點(diǎn)，剔除4個未查詢到靶點(diǎn)的活性成分，結(jié)果顯示16個活性成分共對應(yīng)210個靶點(diǎn)。在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“Type 2 diabetes mellitus”，篩選得到相應(yīng)靶點(diǎn)后取并集，刪除重復(fù)項(xiàng)后獲得T2DM相關(guān)靶點(diǎn)。將篩選獲得的有效活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)與T2DM相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得57個靶點(diǎn)分別對應(yīng)13個活性成分。Degree排前5的有效活性成分為槲皮素（quercetin）、山萘酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、刺芒柄花素（formononetin）、毛蕊異黃酮（Calycosin），這些可能為黃芪治療T2DM的關(guān)鍵有效成分（如表2所示）。利用Cytoscape軟件建立“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)（如圖1所示）。

2.2 構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將重合的57個靶點(diǎn)導(dǎo)入String作PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)共有57個節(jié)點(diǎn)，512條邊（如圖2所示），根據(jù)Degree大小排列，取前30篩選為核心靶點(diǎn)（如圖3所示）。將核心靶點(diǎn)對應(yīng)的有效成分與2.1所得的5個可能為黃芪治療T2DM的有效成分取交集，結(jié)果顯示交集與之前5個有效成分相同，故推測，槲皮素、山萘酚、異鼠李素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮可能是黃芪治療T2DM的關(guān)鍵有效成分。

2.3 基因功能與通路富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對黃芪治療T2DM的30個潛在作用的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分析，根據(jù)P<0.01，共得到116個GO注釋，46條KEGG通路。按P值大小，篩選出前20個GO注釋（如圖4所示），表中GO注釋12個與BP有關(guān)，7個與MF有關(guān)，1個與CC有關(guān)，GO注釋大多與BP和MF相關(guān)，如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合、基因表達(dá)正調(diào)控、RNA聚合酶II啟動子對轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等。

KEGG結(jié)果顯示，30個核心靶點(diǎn)共富集在46條通路上，主要集中在癌癥信號通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、病毒性心肌炎、低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）信號通路、人嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型感染、軍團(tuán)菌病、p53信號通路、催乳素信號通路、雌激素信號通路等。P值排前20條通路（如圖5所示）。

3 討論

3.1 黃芪發(fā)揮作用的關(guān)鍵有效成分 近年來，眾多實(shí)驗(yàn)及臨床觀察均證實(shí)黃芪對T2DM具有良好的療效，但對其有效成分與機(jī)制尚不明確。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示黃芪13個活性成分對應(yīng)T2DM的57個靶點(diǎn)，并通過分析獲得黃芪治療T2DM的關(guān)鍵活性成分可能為槲皮素、山萘酚、異鼠李素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮，其中，作用最強(qiáng)的兩個化合物均被報道有明顯降糖作用。槲皮素又名槲皮黃素，屬于黃酮類化合物，廣泛存在于植物的果實(shí)、花和葉中，具有調(diào)節(jié)血脂和血糖和清除氧自由基、抗腫瘤、抗炎等作用[11]。研究顯示，槲皮素可降低T2DM模型大鼠血糖，并有效減輕其外周胰島素抵抗，并且槲皮素也可改善被高糖抑制的神經(jīng)細(xì)胞增殖活性，減少氧化應(yīng)激損傷[12]。山奈酚又名百蕊草素Ⅲ，屬于黃酮類化合物，具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗氧化等功效。近年研究表明山奈酚在T2DM及并發(fā)癥的防治中具有很大的應(yīng)用前景。山奈酚具有保護(hù)胰島β細(xì)胞功能、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)血糖血脂的作用，并且對T2DM的并發(fā)癥也具有保護(hù)作用[13]。其余三個關(guān)鍵活性成分與T2DM相關(guān)報道較少，故推測這幾種活性成分與T2DM的研究較少，本研究可為后期深入探討黃芪治療T2DM的有效成分提供理論參考。

3.2 黃芪治療op的核心靶點(diǎn) 對黃芪治療T2DM所涉及的57個靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建并分析，結(jié)果顯示Degree排前30的靶點(diǎn)（圖3）為血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（CASP）3、白介素-6（IL-6）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）等，并推測這些靶點(diǎn)可能在黃芪治療T2DM中發(fā)揮關(guān)鍵作用。VEGF為內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原，具有強(qiáng)大的促血管形成能力和促血管通透效應(yīng)，對維持微循環(huán)系統(tǒng)功能正常有重要作用，而VEGFA則被認(rèn)為是傳統(tǒng)意義上的VEGF。糖尿病狀態(tài)下，糖基化終末產(chǎn)物及各種細(xì)胞因子的增多、蛋白激酶C的活化等因素均可導(dǎo)致腎臟VEGF的表達(dá)升高[14]。在對T2DM全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)VEGFA基因上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9369425與T2DM存在相關(guān)性[15]。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，在免疫、炎癥中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。T2DM患者長期處于低度炎癥的狀態(tài)下，IL-6多存在異常升高。研究顯示，黃芪多糖可調(diào)節(jié)T2DM大鼠IL-6水平，保護(hù)胰島β細(xì)胞，改善機(jī)體糖代謝狀態(tài)[16]。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號系統(tǒng)，普遍存在于多種生物。MAPK與T2DM關(guān)系密切，MAPK的激活可促進(jìn)外周胰島素抵抗，抑制胰島素的合成與分泌，增加胰島細(xì)胞的凋亡。

3.3 主要富集通路 GO功能富集分析結(jié)果顯示，黃芪可能在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合、基因表達(dá)正調(diào)控、RNA聚合酶II啟動子對轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等過程中起作用，發(fā)揮起防治T2DM的功效。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示黃芪可能調(diào)控癌癥信號通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、病毒性心肌炎、低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）信號通路、人嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型感染、軍團(tuán)菌病、p53信號通路、催乳素信號通路、雌激素信號通路等防治T2DM。這些通路都較為復(fù)雜，包括多個下游通路。例如顯著性最高的癌癥信號通路包括、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號通路、Wnt信號通路、MAPK信號通路等[17]。PPAR是調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá)的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。研究顯示，PPAR在T2DM中具有重要作用，其可增強(qiáng)機(jī)體對胰島素的敏感性、調(diào)節(jié)體內(nèi)糖代謝平衡等[18]。Wnt信號通路是調(diào)控器官生長和分化的重要通路之一，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Wnt信號通路在糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用已受到廣泛關(guān)注，也有研究證實(shí)，Wnt信號通路多個組成成分參與胰島β細(xì)胞的增殖、葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌等[19]。MAPK是一組細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其可磷酸化靶蛋白來調(diào)控信號通路，抑制肝臟對糖的輸出、降低脂肪生成和三酰甘油合成，從而發(fā)揮能量代謝功能。并且MAPK可通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體-4的表達(dá)，促進(jìn)糖的吸收與利用，增加胰島素敏感性和改善胰島素抵抗[20]。此外，雌激素、TNF與胰島素具有密切關(guān)系，雌激素可影響胰島素敏感性，并且其水平降低可減弱雌激素抑制TNF釋放的作用，TNF-α抑制脂肪、肌肉細(xì)胞胰島素受體在胰島素刺激后自體硫酸化能力，并顯著降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[21]。

綜上所述，本研究初步驗(yàn)證和預(yù)測黃芪治療T2DM的有效成分與分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)結(jié)果呈現(xiàn)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特性，可為后續(xù)深入研究其具體機(jī)制提供思路和基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-06-07 編輯：程鵬飛）