多黏類芽孢桿菌微生物絮凝劑的制備及其性能試驗(yàn)研究

李夢(mèng)茜，龍潔云，蔡承儒，張振旺

(1.河池學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 宜州 546300；2.湖北科技學(xué)院 醫(yī)藥研究院，湖北 咸寧 437100)

無機(jī)絮凝劑、有機(jī)高分子絮凝劑和天然絮凝劑等都在工業(yè)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。聚丙烯酰胺等有機(jī)高分子絮凝劑價(jià)格低廉且絮凝效果較好，但其中有些不容易降解，有些降解后的單體可能對(duì)環(huán)境有不利影響。微生物絮凝劑具有生物降解性，且降解中間體對(duì)環(huán)境無害[1]。蛋白質(zhì)絮凝劑[2-3]、多糖絮凝劑[4-12]、糖蛋白絮凝劑[13-20]，以及由枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的聚谷氨酸[21-25]和黃單胞菌生產(chǎn)的黃原膠[26-27]等均具有絮凝活性，可以作為無害生物聚合物絮凝劑。試驗(yàn)分離出一株芽孢桿菌L2019-1，其可以產(chǎn)生生物高分子絮凝劑，研究了該微生物絮凝劑的絮凝活性，確定了其化學(xué)組成。

1 試驗(yàn)部分

1.1 芽孢桿菌L2019-1的篩選

采用瓊脂平板培養(yǎng)法，以高嶺土懸浮液為絮凝對(duì)象，以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，從宜州污水處理廠污泥樣品中分離出一株芽孢桿菌L2019-1。觀察菌落形態(tài)、顯微細(xì)胞形態(tài)，分析菌株的生理生化特征，測(cè)定16S rRNA序列，確定芽孢桿菌L2019-1的種屬類別。

1.2 微生物絮凝劑的制備

在30 ℃、120 r/min攪拌條件下，將芽孢桿菌L2019-1置于含1%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母提取物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(pH=7.0)中，于搖床中振蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)后，用NaOH溶液將發(fā)酵液pH提高到11.5，攪拌20 min，使細(xì)胞表面絮凝劑溶出；然后在12 000 r/min條件下將黏稠發(fā)酵液離心15 min，之后在上清液中加入2倍體積的冷乙醇沉淀絮凝劑，于8 000 r/min條件下離心10 min后收集絮凝劑并溶于蒸餾水中。經(jīng)過3次乙醇沉淀后在蒸餾水中透析和凍干，得到微生物絮凝劑粗品。絮凝劑粗品中含有蛋白質(zhì)，采用Sevag法去除后，得到較純的微生物絮凝劑。

1.3 絮凝活性測(cè)定

用高嶺土懸浮液對(duì)微生物絮凝劑純品測(cè)定絮凝活性。將0.2 mL微生物絮凝劑溶液、9.4 mL質(zhì)量濃度4 g/L高嶺土懸浮液和0.4 mL的CaCl2溶液加入到離心管中，混合后用渦流混合器攪拌混合并靜置10 min。從離心管上層取0.2 mL上清液，加入到96孔板中，在550 nm(B)波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用同樣方式對(duì)不含絮凝劑的溶液進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，測(cè)定550 nm(A)波長(zhǎng)處的吸光度。絮凝活性計(jì)算公式為

式中：μ—絮凝率，%；A—對(duì)照上清液吸光度；B—加入絮凝劑后上清液吸光度。

用同樣方法考察絮凝劑在活性炭、纖維素和酵母懸浮液中(550 nm處的吸光度調(diào)為1.4)的絮凝活性。酵母懸浮液用面包酵母制備。

1.4 微生物絮凝劑的成分分析

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量。以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)，采用硫酸咔唑法測(cè)定糖醛酸含量。以氨基葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用Morgan-Elson法測(cè)定氨基糖含量。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)。

采用高效液相色譜法測(cè)定絮凝劑純品的單糖組成：凍干樣品2 mg在濃度3 mol/L鹽酸溶液中,于100 ℃下水解4 h，氮吹儀吹干。水解后干燥得到的單糖樣品中加入濃度為0.5 mol/L的1-苯 基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液和濃度為0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL，混合充分后，于70 ℃水浴中反應(yīng)30 min。之后冷卻至室溫，加入0.3 mol/L鹽酸溶液0.5 mL，混合充分后再加入0.5 mL氯仿，劇烈振蕩萃取。離心分相后用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行分析。絮凝劑分子質(zhì)量采用凝膠層析法測(cè)定，用日本島津色譜柱，流速為1.0 mL/min，以濃度為0.1 mol/L的NaCl溶液為溶劑，以藍(lán)色葡聚糖分子質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選與鑒定

經(jīng)固體平板劃線分離，從污泥中分離出的菌株為芽孢桿菌L2019-1。菌液對(duì)高嶺土懸濁液的絮凝率為72%，且絮凝性穩(wěn)定。

2.2 L2019-1菌株的形態(tài)與理化特征

L2019-1菌在LB固體培養(yǎng)基上呈乳白色圓形半透明菌落，表面光滑，呈橢圓桿狀，有黏性(圖1)。采用VITEK全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)分析其理化性質(zhì)，結(jié)果見表1?？梢钥闯觯琇2019-1菌株形態(tài)和理化特征與芽孢桿菌屬較為一致。

a—菌落形態(tài)；b—顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)(放大1 000倍)。圖1 菌株L2019-1的形態(tài)

表1 菌株L2019-1的生化特征

2.3 16S rRNA序列分析

對(duì)L2019-1菌株提取總DNA后進(jìn)行測(cè)序，16S rRNA測(cè)序結(jié)果采用BLAST程序與NCBI數(shù)據(jù)庫中信息進(jìn)行同源性比對(duì)，構(gòu)建出系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示。依據(jù)比對(duì)結(jié)果，L2019-1菌株屬于多黏類芽孢桿菌。

圖2 L2019-1菌株的16S rRNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 絮凝劑的絮凝性能

2.4.1 在高嶺土懸浮液中的絮凝性能

在高嶺土懸浮液中，此微生物絮凝劑的絮凝活性受其濃度、助凝劑陽離子、反應(yīng)溫度及懸浮液pH的影響。試驗(yàn)條件下，絮凝劑最佳絮凝活性時(shí)的質(zhì)量濃度為30 mg/L左右(如圖3所示)。

圖3 絮凝劑濃度對(duì)絮凝率的影響

高嶺土懸浮液中加入陽離子對(duì)微生物絮凝劑的絮凝活性有一定影響。以AlCl3·6H2O、FeCl3·6H2O、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、NaCl和KCl為陽離子源，圖4為微生物絮凝劑在含1 mmol/L陽離子的高嶺土懸浮液中的絮凝活性?？梢钥闯觯篈13+、Fe3+、Ca2+對(duì)絮凝劑的絮凝活性有明顯刺激作用，能顯著提高絮凝活性。

圖4 陽離子種類對(duì)絮凝劑絮凝率的影響

在含有A13+、Fe3+、Ca2+的高嶺土懸浮液中，陽離子質(zhì)量濃度對(duì)絮凝劑絮凝率的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 陽離子濃度對(duì)絮凝劑絮凝率的影響

由圖5看出：絮凝劑的絮凝活性隨Ca2+濃度升高而提高；Fe3+、Al3+濃度分別為0.8、0.2 mmol/L時(shí)，絮凝劑的絮凝率最佳。由于A13+在低濃度下效果明顯，因此，推斷Al3+是增強(qiáng)絮凝劑絮凝活性的合適陽離子。推測(cè)A13+、Fe3+、Ca2+通過中和穩(wěn)定碳的剩余負(fù)電荷而促進(jìn)絮凝作用。懸浮液中加入陽離子是誘導(dǎo)微生物絮凝劑有效絮凝活性的充分條件。試驗(yàn)結(jié)果與紅潮紅球菌和杯狀假堿菌所制備微生物絮凝劑需添加Ca2+和Al3+才具有較高絮凝活性的要求相一致[28-29]。

體系pH、溫度對(duì)絮凝劑絮凝率的影響試驗(yàn)結(jié)果分別如圖6、7所示。

圖6 體系pH對(duì)絮凝劑絮凝率的影響

圖7 溫度對(duì)絮凝劑絮凝率的影響

由圖6、7看出：體系pH=6.0條件下，含0.2 mmol/L Al3+的高嶺土懸浮液中，絮凝活性最高；最佳絮凝溫度為20～30 ℃。

2.4.2 在活性炭懸浮液中的絮凝活性

活性炭懸浮液中絮凝劑質(zhì)量濃度對(duì)絮凝率的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。可以看出，該絮凝劑對(duì)活性炭懸浮液的最佳絮凝質(zhì)量濃度為20～30 mg/L?？梢哉J(rèn)為，該絮凝劑適用于含碳無機(jī)廢水，如煤泥水的固液分離和凈化。

圖8 活性炭懸浮液中絮凝劑質(zhì)量濃度對(duì)絮凝率的影響

2.4.3 在纖維素、酵母懸浮液中的絮凝活性

酵母和纖維素懸浮液中絮凝劑質(zhì)量濃度對(duì)絮凝率的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖9所示?？梢钥闯?，在纖維素、酵母等有機(jī)懸浮液中，絮凝劑的絮凝活性很好：在纖維素懸浮液中，最佳質(zhì)量濃度為30 mg/L；在酵母懸浮液中，最佳質(zhì)量濃度為40 mg/L。

圖9 酵母和纖維素懸浮液中絮凝劑質(zhì)量濃度對(duì)絮凝率的影響

2.5 絮凝劑的成分

依據(jù)文獻(xiàn)[3]，微生物絮凝劑的主要化學(xué)成分為糖類、多肽、蛋白質(zhì)、核酸和脂類物質(zhì)。

絮凝劑粗品由多糖和少量蛋白質(zhì)組成：根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法，粗品中約含25%蛋白質(zhì)；苯酚-硫酸法測(cè)得其總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74%。

絮凝劑純品為酸性多糖物質(zhì)，由醛酸和中性糖組成。根據(jù)Morgan-Elson法，其不含氨基糖；依據(jù)硫酸咔唑法，其酸性多糖中醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為18%。

絮凝劑純品水解后以高效液相色譜法分析單糖種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。可以看出，其含有9種單糖，以葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸為主。其凝膠色譜顯示只有單峰且分子摩爾質(zhì)量約為2.4×106g/mol。

表2 單糖種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 結(jié)論

用分離得到的多黏類芽孢桿菌L2019-1可制備高分子絮凝劑。此絮凝劑的絮凝活性受體系中陽離子、體系pH、溫度等因素影響。高嶺土懸浮液中，Ga2+、Fe3+、Al3+的存在可促進(jìn)絮凝，最佳pH=6.0，適宜溫度30 ℃。該絮凝劑在無機(jī)和有機(jī)懸浮液中都表現(xiàn)出良好的絮凝活性，所以，有必要繼續(xù)優(yōu)化芽孢桿菌L2019-1的培養(yǎng)條件，以用廉價(jià)方式獲得較高絮凝劑產(chǎn)量。