不同外植體選材對(duì)珙桐愈傷組織誘導(dǎo)的影響

畢海林，黃杏娥，楊文宏，和加衛(wèi)，楊正松，楊洪濤，李 燕*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高山經(jīng)濟(jì)植物研究所，云南 麗江 674199;2.麗江藍(lán)瑪生物科技開發(fā)有限責(zé)任公司，云南 麗江 674199)

珙桐(DavidiainvolucrataBaill.)為藍(lán)果樹科珙桐屬落葉喬木，被譽(yù)為“中國的鴿子樹”，又稱“鴿子花樹”“水梨子”，野生種只生長在中國西南的四川省和中部的湖北省和周邊地區(qū)。珙桐已被列為國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物，為中國特有的單屬植物，屬孑遺植物，也是全世界著名的觀賞植物。珙桐種子休眠期長、發(fā)芽率低、繁殖困難。因此，開展珙桐的組織培養(yǎng)技術(shù)研究可加快其繁殖速度，對(duì)保存優(yōu)良種質(zhì)資源及其合理開發(fā)利用具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。目前，有較多有關(guān)珙桐組織培養(yǎng)的文獻(xiàn)報(bào)道，畢世榮[1]、夏晗[2]、羅世家[3]、金曉玲[4]、楊鋒利[5]、余阿梅[6]、鄒利娟[7]、郭文久[8]等均對(duì)珙桐進(jìn)行了組織培養(yǎng)的研究報(bào)道，其中珙桐愈傷組織誘導(dǎo)已基本沒有問題，有的研究報(bào)道表明，誘導(dǎo)的愈傷組織能分化出芽形成完整植株，但是外植體選材與褐化問題還沒有得到徹底解決。因此，本文擬通過不同的外植體選材來摸索珙桐組織培養(yǎng)最適合的外植體。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為麗江市高山所辦公區(qū)珙桐1月初冬芽及6月初腋芽、6月底麗江市高山所辦公區(qū)及迪慶州維西縣未成熟珙桐果實(shí)、11月底麗江市內(nèi)高山所辦公區(qū)成熟果實(shí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體選擇及其消毒方法 (1)將冬芽及腋芽用5%洗滌劑液洗滌，流水沖洗2 h，移至無菌操作臺(tái)上，用70%酒精消毒30 s，用無菌水洗3次；再用0.1%升汞溶液消毒10 min，用無菌水洗5次，將腋芽剝?nèi)ネ鈱訋灼?，將?nèi)部芽體接種在初代培養(yǎng)基上，每瓶接1個(gè)外植體，觀察腋芽初代培養(yǎng)生長情況及統(tǒng)計(jì)污染率。

(2)將未成熟果實(shí)用5%洗滌劑液洗滌，流水沖洗2 h，移至無菌操作臺(tái)上，用70%酒精消毒30 s，再用0.2%升汞溶液消毒15 min，用無菌水洗3次，將未成熟果實(shí)用鑷子及手術(shù)刀剝?nèi)?nèi)部胚乳及胚，成熟度稍高的直接剝?nèi)∪ヅ呷榈呐撸墒於鹊涂床磺迮叩倪x擇帶胚乳的胚，剝?nèi)『蠼臃N在初代培養(yǎng)基上，每瓶接1個(gè)外植體，觀察胚及胚乳在初代培養(yǎng)基上的生長變化情況及統(tǒng)計(jì)污染率。

(3)將成熟果實(shí)除去果皮，將堅(jiān)硬種子砸開，取出內(nèi)部胚乳及胚，用水浸泡24 h后，移至無菌操作臺(tái)上，用70%酒精消毒30 s，再用0.1%升汞溶液消毒6 min，用無菌水洗5次，將胚及胚乳接種在初代培養(yǎng)基上，每瓶接1個(gè)外植體，觀察胚及胚乳在初代培養(yǎng)基上的生長變化情況及統(tǒng)計(jì)污染率。

1.2.2 誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基的篩選 以MS、WPM、N6為基本培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基中蔗糖為3%、瓊脂粉為6 g/L，添加不同濃度的多種激素，培養(yǎng)基pH值為5.8，溫度為(25±2)℃，光源為日光燈，光照強(qiáng)度為1500～2000 lx,光照時(shí)間為12 h/d。培養(yǎng)過程中觀察各培養(yǎng)基中培養(yǎng)物的表現(xiàn)，45 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率及芽分化的情況。

1.2.2.1 初代培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 (1)以冬芽及腋芽為外植體，采用以下啟動(dòng)培養(yǎng)基：

①M(fèi)S+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA

②MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1 g/L AC+0.3 g/L PVP

③MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3 g/L結(jié)冷膠+0.3 g/L PVP

④WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA

⑤WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1 g/L AC+0.3 g/L PVP

⑥WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3 g/L結(jié)冷膠+0.3 g/L PVP

⑦N6+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA

⑧N6+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1 g/L AC+0.3 g/L PVP

⑨N6+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3 g/L結(jié)冷膠+0.3 g/L PVP

(2)以未成熟種子和成熟種子帶胚乳的胚及去胚乳的胚為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，采用以下愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：

Ⅰ.MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 2,4-D

Ⅱ.MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

Ⅲ.MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 2,4-D+1 g/L AC+0.3 g/L PVP

Ⅳ.MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3 g/L結(jié)冷膠+0.3 g/L PVP

Ⅴ.WPM+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 2,4-D

Ⅵ.WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

Ⅶ.WPM+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 2,4-D+1 g/L AC+0.3 g/L PVP

Ⅷ.WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3 g/L結(jié)冷膠+0.3 g/L PVP

Ⅸ.N6+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 2,4-D

Ⅹ.N6+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

Ⅺ.N6+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 2,4-D+1 g/L AC+0.3 g/L PVP

Ⅻ.N6+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3 g/L結(jié)冷膠+0.3 g/L PVP

1.2.2.2 繼代培養(yǎng)愈傷組織芽分化培養(yǎng)基篩選 將初代培養(yǎng)形成的愈傷組織接種在以下培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織變化情況：

A.WPM+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA

B.WPM+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+1 g/L AC

C.WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

D.WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1 g/L AC

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素及抗氧化劑對(duì)珙桐冬芽及腋芽初代培養(yǎng)的影響

由表1和圖1可以看出，以冬芽為外植體，消毒后剝?nèi)ネ鈱影臃N的材料在各種培養(yǎng)基中均不明顯褐化；而夏天選取的外植體腋芽在不加抗氧化劑活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、結(jié)冷膠的培養(yǎng)基中外植體褐化嚴(yán)重，影響愈傷組織的形成；其中加活性炭、聚乙烯吡咯烷酮的培養(yǎng)基中外植體褐化較輕，而加聚乙烯吡咯烷酮、結(jié)冷膠的培養(yǎng)基中外植體褐化不明顯，培養(yǎng)基顏色稍微均勻變深。由此可見，抗氧化劑活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、結(jié)冷膠對(duì)珙桐腋芽初代培養(yǎng)具有顯著的抗氧化作用，其中聚乙烯吡咯烷酮和結(jié)冷膠共同作用可有效遏制外植體的褐化，結(jié)冷膠能有效分散氧化后的褐色醌類物質(zhì)，有效降低外植體因褐化引起的壞死率。在3類培養(yǎng)基中，冬芽和腋芽的外植體培養(yǎng)表現(xiàn)沒有明顯的區(qū)別。

表1 不同激素及抗氧化劑對(duì)珙桐冬芽腋芽初代培養(yǎng)的影響

A.冬芽初代培養(yǎng)情況；B.添加抗氧化劑PVP和結(jié)冷膠的培養(yǎng)基中冬芽的初代培養(yǎng)情況；C.腋芽初代培養(yǎng)情況；D.添加抗氧化劑PVP和結(jié)冷膠的培養(yǎng)基中腋芽的初代培養(yǎng)情況。

2.2 不同激素及抗氧化劑對(duì)珙桐未成熟種子和成熟種子帶胚乳的胚及去胚乳的胚初代培養(yǎng)的影響

由表2、圖2、圖3可以看出，選取珙桐未成熟種子去胚乳的胚直接作為外植體，在添加3種細(xì)胞分裂素6-BA、KT、ZT及較高濃度的生長素2,4-D的3類培養(yǎng)基中，幼胚在培養(yǎng)基中均很快變綠膨大，膨大的胚邊緣形成黃白色愈傷組織，且有的培養(yǎng)基中愈傷組織上還有點(diǎn)狀疑似芽點(diǎn)，而且無論加不加抗氧化劑PVP即聚乙烯吡咯烷酮和結(jié)冷膠，胚在整個(gè)培養(yǎng)過程中均絲毫不褐化；細(xì)微差別在于，WPM培養(yǎng)基中伸展的幼胚表面形成的愈傷組織較多，其上的點(diǎn)狀疑似芽點(diǎn)也較多。只添加細(xì)胞分裂素6-BA和較低濃度的生長素NAA的3類培養(yǎng)基中，幼胚的子葉均在7 d左右開始伸展，胚根逐漸伸長形成2～3條根，整個(gè)胚不褐化，最終均可形成完整小植株；這3類培養(yǎng)基差別不明顯。

表2 不同激素及抗氧化劑對(duì)未成熟種子和成熟種子帶胚乳的胚及去胚乳的胚初代培養(yǎng)的影響

A.胚剛開始變綠膨大；B.MS培養(yǎng)基中胚基部形成少量愈傷組織；C.N6培養(yǎng)基中胚基部形成較多愈傷組織；D.WPM培養(yǎng)基中整個(gè)胚表面形成較多愈傷組織；E.WPM培養(yǎng)基中愈傷組織上形成點(diǎn)狀疑似芽點(diǎn)。

A.MS培養(yǎng)基中子葉伸展且胚根伸長形成2～3條根的小植株；B.N6培養(yǎng)基中子葉伸展且胚根伸長形成2～3條根的小植株；C.WPM培養(yǎng)基中子葉伸展且胚根伸長形成2～3條根的小植株。

以珙桐未成熟種子帶胚乳的胚作為外植體，胚乳外表皮暴露在空氣中以后馬上被氧化變褐，以后逐漸變黑壞死，培養(yǎng)基中加了抗氧化劑聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、結(jié)冷膠的外植體嵌入培養(yǎng)基的部分褐化程度較輕，但在以后的培養(yǎng)中也基本上沒有愈傷組織形成，加結(jié)冷膠的培養(yǎng)基中整個(gè)培養(yǎng)基顏色均稍稍加深變褐，說明結(jié)冷膠有分散褐化物質(zhì)并有效降低褐化的作用，但在此培養(yǎng)過程中，褐化程度稍輕的外植體也沒有形成愈傷組織。由此可見，珙桐未成熟種子胚乳中含有酚類物質(zhì)，極易被氧化成醌類物質(zhì)，因此不宜選珙桐未成熟種子帶胚乳的胚作為外植體。

成熟種子種皮極其堅(jiān)硬，取內(nèi)部完整的胚乳及胚極其不容易，以成熟種子的胚乳及胚作為外植體，整個(gè)初代培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物稍稍膨大但變化不明顯，胚基本不伸長，但也不褐化，并且外植體消毒不容易徹底，污染率相對(duì)較高。

綜上所述，珙桐未成熟種子去胚乳的胚是一種極佳的外植體。添加3種細(xì)胞分裂素6-BA、KT、ZT及較高濃度的生長素2,4-D的WPM培養(yǎng)基中伸展的幼胚表面形成的愈傷組織較多，其上的點(diǎn)狀疑似芽點(diǎn)也較多，說明WPM培養(yǎng)基較有利于珙桐未成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)；只添加細(xì)胞分裂素6-BA和較低濃度生長素NAA的3類培養(yǎng)基幼胚均可形成完整小植株，且3類培養(yǎng)基差別不明顯。

2.3 繼代培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)分化

將珙桐未成熟種子去胚乳胚初代培養(yǎng)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)接在分化培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織分化情況。4種培養(yǎng)基上10 d左右均出現(xiàn)少量淡綠色點(diǎn)狀突起，有芽分化的跡象。但繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，淡綠色點(diǎn)狀突起變化不明顯，并沒有分化成芽。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)選取6種外植體即珙桐冬芽、腋芽、未成熟種子去胚乳及帶胚乳的胚、成熟種子去胚乳及帶胚乳的胚，對(duì)珙桐愈傷組織誘導(dǎo)及分化進(jìn)行了研究。

以珙桐腋芽為外植體時(shí)，培養(yǎng)基中添加的抗氧化劑聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、結(jié)冷膠對(duì)珙桐腋芽初代培養(yǎng)具有顯著的抑制褐化作用，其中聚乙烯吡咯烷酮和結(jié)冷膠共同作用可有效抑制外植體的褐化，結(jié)冷膠能有效分散氧化后的褐色醌類物質(zhì)，有效降低外植體因褐化引起的壞死率；而以珙桐冬芽為外植體時(shí)，無論培養(yǎng)基中是否添加抗氧化劑聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、結(jié)冷膠，所接種的外植體在各培養(yǎng)基中均不明顯褐化。因此，在其他植物組織培養(yǎng)時(shí)，若所選取的外植體在初代培養(yǎng)中容易褐化，可采用聚乙烯吡咯烷酮、活性炭和結(jié)冷膠來嘗試降低褐化的影響。

以珙桐未成熟種子去胚乳的幼胚為外植體時(shí)，無論培養(yǎng)基中是否添加抗氧化劑聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、結(jié)冷膠，幼胚在培養(yǎng)基中均不褐化，其能在培養(yǎng)基中變綠膨大，表面形成愈傷組織或者發(fā)育成完整小植株；而以珙桐未成熟種子帶胚乳的幼胚為外植體時(shí)，胚乳馬上被氧化變褐，最終變黑，由此推測胚乳中含有酚類物質(zhì)，極易被氧化成醌類物質(zhì)，因此不宜選珙桐未成熟種子帶胚乳的胚作為外植體，而應(yīng)該去除胚乳，直接以內(nèi)部的幼胚為外植體。當(dāng)幼胚發(fā)育成珙桐小植株后，可在繼代培養(yǎng)階段通過小植株莖段長高伸長來進(jìn)行珙桐試管苗的擴(kuò)繁。

以珙桐成熟種子去胚乳的胚和帶胚乳的胚為外植體時(shí)，成熟種子種皮極其堅(jiān)硬，取內(nèi)部完整的胚乳及胚極其不容易，并且外植體消毒不容易徹底，污染率相對(duì)較高。雖然培養(yǎng)過程中兩者均不明顯褐化，但整個(gè)初代培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物只是稍稍膨大，變化不明顯。應(yīng)該是此時(shí)種子已經(jīng)休眠，內(nèi)部的成熟胚也已經(jīng)休眠因此在培養(yǎng)基中不萌發(fā)生長。

本試驗(yàn)結(jié)果表明：珙桐未成熟種子去胚乳的幼胚是珙桐極佳的外植體，因其初代培養(yǎng)時(shí)毫不褐化；添加3種細(xì)胞分裂素6-BA、KT、ZT及較高濃度的生長素2,4-D的條件下幼胚分化形成愈傷組織；添加細(xì)胞分裂素6-BA和較低濃度的生長素NAA的條件下幼胚發(fā)育成珙桐完整小植株。繼代培養(yǎng)階段小植株莖段增殖和愈傷組織芽誘導(dǎo)分化的激素配比則有待進(jìn)一步摸索。