廣西家蠶原種微粒子病防控體系與效果分析

浦月霞，李楓燁，湯慶坤，蘭艷妮，黃揚(yáng)玉，冉艷萍，吳靜顏，葉建蔚，潘志新

（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站，南寧市530007）

微孢子蟲(chóng)是一類專性寄生于細(xì)胞內(nèi)的單細(xì)胞真核微生物，在自然界中廣泛存在。微孢子蟲(chóng)寄主廣泛，影響宿主的生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致宿主死亡。家蠶微粒子孢子蟲(chóng)（Nosema bombycis，N.b）是最早被認(rèn)識(shí)的微孢子蟲(chóng)，它能夠感染家蠶引發(fā)家蠶微粒子病。家蠶微粒子病有食下傳染和胚種傳染兩條傳染途徑，是蠶業(yè)生產(chǎn)上具有毀滅性的病害，因此，家蠶微孢子蟲(chóng)被列為蠶種生產(chǎn)唯一法定檢疫對(duì)象。

做好原種微粒子病防控工作不僅能保證本級(jí)蠶種繁育的質(zhì)量，還能為下一級(jí)蠶種繁育提供良好的種質(zhì)資源，杜絕胚種傳染。廣西屬熱帶、亞熱帶季風(fēng)氣候，氣溫高，雨量充沛，桑樹(shù)生長(zhǎng)旺盛，全年可多批次養(yǎng)蠶，養(yǎng)蠶時(shí)期長(zhǎng)，但蠶座密集、批次重疊，有利于家蠶微粒子病的垂直傳播和水平傳播。熱帶、亞熱帶高溫多濕氣候也有利于野外昆蟲(chóng)的生存和繁殖，引起野外昆蟲(chóng)間攜帶的微孢子蟲(chóng)交叉?zhèn)魅窘o家蠶。2000年，隨著國(guó)家“東桑西移”政策調(diào)整，廣西蠶桑產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，原種生產(chǎn)量迅速增加，至2004年，原種生產(chǎn)量達(dá)到96 835張，是1999年生產(chǎn)量24 757張的4倍，產(chǎn)量迅速擴(kuò)張，長(zhǎng)期超負(fù)荷生產(chǎn)，給微粒子病防控帶來(lái)困難和挑戰(zhàn)。受氣候環(huán)境、桑園病蟲(chóng)害多、超負(fù)荷生產(chǎn)等多種因素的影響，2004年上半年，廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣站原種場(chǎng)微粒子病暴發(fā)，飼養(yǎng)的多個(gè)原種批次因微粒子病檢驗(yàn)不合格被淘汰。原種場(chǎng)立即制定并貫徹執(zhí)行防控微粒子病的措施，采取全齡桑葉消毒措施，從很大程度上控制了微粒子病的暴發(fā)。經(jīng)過(guò)十幾年的實(shí)踐摸索，不斷補(bǔ)充完善各類技術(shù)措施，于2015年總結(jié)形成了一套原種微粒子病防控體系并應(yīng)用于生產(chǎn)，取得了較好的效果，每年為廣西全區(qū)蠶種場(chǎng)提供足量合格的原種，為廣西蠶業(yè)高速發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

1 廣西家蠶原種微粒子病防控體系建設(shè)

1.1 做好母蛾檢查和補(bǔ)正檢查，切斷胚種傳染途徑

做好原原種母蛾檢查。對(duì)每張?jiān)N單蛾袋蛾，蛾袋上編寫蠶種編號(hào)及產(chǎn)卵母蛾號(hào)，袋蛾時(shí)與蠶種一一對(duì)應(yīng)，統(tǒng)一送廣西蠶種質(zhì)量檢驗(yàn)檢疫站集中檢疫。原原種母蛾檢驗(yàn)采用初檢和復(fù)檢相結(jié)合的方法。初檢采用14蛾集團(tuán)檢驗(yàn)，程序?yàn)椴鸲辍心ァ^(guò)濾→離心→取樣→鏡檢→記錄。經(jīng)初檢后，無(wú)毒母蛾液再經(jīng)復(fù)檢[1]，即把每4個(gè)集團(tuán)的磨蛾液收集在一起，離心后點(diǎn)板再做顯微鏡檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有微粒子孢子再回查確認(rèn)有毒的樣本，對(duì)號(hào)淘汰發(fā)現(xiàn)有微粒子的原原種，從源頭切斷胚種傳染途徑。

補(bǔ)正檢查。收蟻后對(duì)每張?jiān)N的卵殼及收蟻剩下的蟻蠶按飼育區(qū)編號(hào)，送廣西蠶種質(zhì)量檢驗(yàn)檢疫站進(jìn)行補(bǔ)正檢查，補(bǔ)正母蛾檢查的缺漏。及時(shí)淘汰補(bǔ)正檢查發(fā)現(xiàn)微粒子孢子的飼育區(qū)。

1.2 分區(qū)飼養(yǎng)，做好五選工作

催青時(shí)，將14個(gè)卵形好，產(chǎn)附好，不良卵少的卵圈編上原始蠶種號(hào)，集中一張作為一個(gè)飼育區(qū)，收蟻時(shí)對(duì)飼育區(qū)編號(hào)，并記錄原始蠶種號(hào)，以便溯源。飼育及上蔟期間嚴(yán)格分區(qū)，不能混區(qū)。制種時(shí)分段制種，把4個(gè)飼育區(qū)作為1個(gè)制種段。做好卵期、蠶期、種繭期、蛹期、蛾期的選擇工作，淘汰不良卵多的卵圈，淘汰弱小蠶、發(fā)育遲緩蠶、有胡椒斑和焦腳蠶，淘汰種繭期死籠率高于良繁標(biāo)準(zhǔn)的飼育區(qū)或飼育批，淘汰大肚蛾、禿翅蛾等不健康母蛾。

1.3 周圍環(huán)境和蠶室蠶具消毒

養(yǎng)蠶前先對(duì)蠶室、制種室周圍雜草、排水溝進(jìn)行清理，再統(tǒng)一用高壓清洗機(jī)對(duì)周邊草地、晾曬場(chǎng)、路面進(jìn)行消毒、清洗，營(yíng)造潔凈的養(yǎng)蠶環(huán)境。養(yǎng)蠶期間，每天對(duì)運(yùn)送蠶沙經(jīng)過(guò)的路面進(jìn)行消毒。

蠶室制種室的消毒。養(yǎng)蠶前對(duì)蠶室、洗葉車間、上蔟室、制種室、冷庫(kù)等與養(yǎng)蠶制種有關(guān)的房屋及設(shè)備、用具進(jìn)行徹底消毒、清洗，經(jīng)過(guò)“兩消一洗一熏蒸”，殺滅病原物。蠶期每天用有效氯濃度為1%的漂白精溶液對(duì)蠶室、貯葉室地面及喂蠶用具進(jìn)行消毒。養(yǎng)蠶結(jié)束后對(duì)用過(guò)的房屋設(shè)備進(jìn)行徹底消毒、清洗。

蠶沙無(wú)害化處理。運(yùn)蠶沙走蠶沙專用道，不與運(yùn)桑葉道路交叉，每天對(duì)蠶沙袋消毒清洗晾曬。養(yǎng)蠶期間將蠶沙集中傾倒在蠶沙池，加發(fā)酵菌堆漚發(fā)酵作無(wú)害化處理，使病原菌在高溫條件下失活。

1.4 桑葉消毒

2002年起，對(duì)小蠶期桑葉進(jìn)行消毒清洗，2004年6月開(kāi)始進(jìn)行全齡桑葉消毒，人工浸泡和漂洗桑葉，2005年安裝電滑輪起降裝置，桑葉裝框后由電滑輪放進(jìn)浸泡池和漂洗池。人工消毒清洗桑葉費(fèi)工費(fèi)時(shí)，但桑葉被消毒藥液浸泡充分，消毒徹底，防微效果好。2008年應(yīng)用首套機(jī)械自動(dòng)化桑葉全程消毒清洗系統(tǒng)進(jìn)行桑葉消毒[2-3]，經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)，至今已開(kāi)發(fā)應(yīng)用第三代自動(dòng)化桑葉消毒清洗設(shè)備，每小時(shí)可為原種繁育提供消毒潔凈桑葉300 kg，從飼料源頭阻斷食下傳染途徑。

桑葉消毒藥物使用漂白精，消毒藥液濃度為含有效氯0.35%～0.40%，消毒時(shí)間為10 min，每隔1 h測(cè)一次消毒液濃度，濃度降低及時(shí)補(bǔ)充母液，遇雨水葉或露水葉時(shí)適當(dāng)加大濃度。每消毒1 500 kg桑葉換一次消毒藥液，進(jìn)葉速度以300 kg/h為上限。每天對(duì)桑葉處理車間場(chǎng)地、晾葉室、桑葉保鮮冷庫(kù)及其用具進(jìn)行消毒清洗。

1.5 桑葉統(tǒng)一低溫保鮮和集中配送

經(jīng)消毒處理后的潔凈桑葉統(tǒng)一存放在洗葉車間的儲(chǔ)葉室或低溫冷庫(kù)保鮮。桑葉統(tǒng)一低溫保鮮不但可保持桑葉的新鮮度，還可避免發(fā)生因各自在蠶室內(nèi)保管桑葉，受除沙操作等影響引起桑葉二次污染的問(wèn)題。桑葉儲(chǔ)葉室安裝空調(diào)，利用制冷功能降低室內(nèi)溫度，對(duì)桑葉進(jìn)行儲(chǔ)存保鮮，為防止桑葉水份流失，在桑葉表面覆蓋塑料薄膜。低溫冷庫(kù)保存桑葉可將桑葉裝塑料框堆疊存放，冷庫(kù)溫度不低于5℃，塑料筐堆疊層數(shù)不超過(guò)3層，每疊之間留出空隙通風(fēng)。

桑葉的統(tǒng)一配送根據(jù)各棟蠶室的計(jì)劃用葉量，每次喂蠶前，由專人將消毒清洗晾干的潔凈桑葉裝好框后直接送到蠶室，蠶室飼養(yǎng)人員直接卸下即可喂蠶，減少中間環(huán)節(jié)，減少桑葉受二次污染的幾率。

1.6 桑園管理，防野外昆蟲(chóng)微孢子感染家蠶

建立桑園害蟲(chóng)預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)系統(tǒng)，根據(jù)歷年桑園害蟲(chóng)發(fā)生歷史資料、發(fā)病規(guī)律及病情，及時(shí)噴農(nóng)藥消滅桑螟、斜紋夜蛾、桑尺蠖等野外昆蟲(chóng)，防止野外昆蟲(chóng)攜帶的微孢子蟲(chóng)感染家蠶，造成交叉?zhèn)魅?。冬天用農(nóng)藥封園，清掃桑園枯枝落葉，撒施石灰，降低越冬害蟲(chóng)基數(shù)。桑枝集中作粉碎處理或外運(yùn)。降低桑樹(shù)種植密度，以每667 m2栽植1 000株為參考，采葉批批清，保持桑園通風(fēng)透氣。不采泥葉、蟲(chóng)口葉。

1.7 預(yù)知檢查

每個(gè)齡期將遲眠蠶、弱小蠶按飼育區(qū)送檢，發(fā)現(xiàn)胡椒斑、焦腳蠶及時(shí)送檢，將蔟中不結(jié)繭蠶，種繭期不化蛹、病態(tài)蛹，蛾期大肚蛾、禿翅蛾送檢，將雄蛹加溫促進(jìn)提前發(fā)蛾后送檢。送檢后如發(fā)現(xiàn)有微粒子孢子的樣本，整區(qū)淘汰。對(duì)懷疑有微粒子的樣本，若在蠶期，直接淘汰該樣本所在飼育區(qū)；若在蛹期，該區(qū)單獨(dú)作為一段制種送檢。

1.8 動(dòng)態(tài)監(jiān)控養(yǎng)蠶環(huán)境

環(huán)境抽樣檢查[4]，可全方位動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)控病原微孢子蟲(chóng)病原在環(huán)境中的存在與分布情況，掌握微孢子蟲(chóng)的發(fā)生與消長(zhǎng)規(guī)律，使消毒工作更具靶向性，各項(xiàng)技術(shù)措施落實(shí)有據(jù)可依。消毒后對(duì)大環(huán)境再重新抽樣，可檢查消毒的質(zhì)量和效果。

養(yǎng)蠶消毒前對(duì)蠶室、桑園及養(yǎng)蠶周圍環(huán)境進(jìn)行抽樣送檢。蠶室主要抽取地面、墻面、角落、下水道口的塵土、養(yǎng)蠶殘留物。制種室抽取蛾毛、粉塵。蠶具主要抽取蠶架的背面、底部，竹桿的表面及內(nèi)部的灰塵和殘留的蠶繭、浮絲，蠶匾的蛀屑、殘留的蠶沙。桑園抽取不同地塊不同位置的泥土、蟲(chóng)口葉、泥葉、下腳葉。周圍環(huán)境包括辦公區(qū)、家屬區(qū)、公共場(chǎng)所所有的房屋、道路、綠地、水溝，主要抽取粉塵、泥土、草等。養(yǎng)蠶制種期間，環(huán)境抽樣每月2次。

2 廣西原種微粒子病發(fā)生情況及防控效果

2000年之前，原種生產(chǎn)量小，原種繁育幾乎無(wú)微粒子病發(fā)生，以2000年為例，全年飼養(yǎng)9批，繁育原種41 248張，其中只有春4批蠶種有1 040張蠶種微粒子病超標(biāo)淘汰，全年原種合格率達(dá)到97.48%。2000年原種繁育數(shù)量及微粒子病淘汰數(shù)量見(jiàn)圖1。

2004年，全年繁育原種96 835張，因微粒子病淘汰原種26 567張，全年淘汰率27.44%。特別是2004年春期，微粒子病大暴發(fā)，每批都有不同數(shù)量蠶種因微粒子病而淘汰，有的批次甚至整批淘汰。春期淘汰率高達(dá)46.59%。2004年6月，原種場(chǎng)制定系列防控微粒子病的技術(shù)措施，嘗試對(duì)桑葉進(jìn)行全齡消毒，經(jīng)過(guò)多批次實(shí)踐，微粒子病防控效果呈現(xiàn)，病毒率明顯降低，合格蠶種數(shù)量增加。秋期多批次原種全部合格，秋期蠶種淘汰率降到6.53%，2004年原種繁育數(shù)量及微粒子病淘汰數(shù)量見(jiàn)圖2。

應(yīng)用廣西原種微粒子病防控體系后，原種微粒子病得到有效控制，蠶種合格率大幅度增加，以2018年為例，全年繁育原種172 785張，因微粒子病而淘汰原種8 398張，原種合格率達(dá)到95.14%。2018年原種繁育數(shù)量及微粒子病淘汰數(shù)量見(jiàn)圖3。

3 存在問(wèn)題與建議

3.1 存在問(wèn)題

廣西原種微粒子病防控措施經(jīng)過(guò)十幾年的實(shí)踐，不斷補(bǔ)充完善各項(xiàng)技術(shù)措施，充實(shí)具體內(nèi)容，取得了很好的效果。但有的批次防微效果不是很理想，會(huì)出現(xiàn)整段或整批超毒的現(xiàn)象。不同的年份不同季節(jié)間、不同批次之間、同批次不同品種間防微效果差異大。

3.2 建議

3.2.1 藥物治療 通過(guò)化學(xué)藥物治療微粒子病早有報(bào)道。1993年劉仕賢[5]以多菌靈為主劑，與增強(qiáng)粘附、促進(jìn)滲透的輔劑組成的“防微靈”可治療家蠶微粒子病。1997年沈中元[6]報(bào)道“克微1號(hào)”對(duì)家蠶微粒子病具有治療作用，給藥濃度超過(guò)0.05%時(shí)，可以達(dá)到完全治愈的效果。2000年貢成良[7]將苯并咪唑環(huán)類的TAAL用乳化劑801復(fù)配后，復(fù)配TAAL（0.5 mg/mLTAAL+0.5%乳化劑）以0.5～1.0 mg/mL的1次/日、8 h/次藥物添食，可顯著降低母蛾帶毒率。2000年魯興萌[8]報(bào)道丙硫苯咪唑?qū)倚Q微粒子病有治療作用，但有一定局限性。微孢子蟲(chóng)感染濃度過(guò)高或食下孢子到治療間隔時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，效果不明顯。2000年沈中元[9]報(bào)道添毒一定濃度的N.b孢子液后，添食250～500 mg/kg以上濃度的“微毒靈”均能取得良好的治療效果，孢子濃度增加時(shí)，“微毒靈”的治療效果受到明顯影響。2016年黃旭華[10]報(bào)道利用阿苯達(dá)唑溶液浸泡桑葉或以藥粉直接噴灑蠶座上桑葉的方式均可以達(dá)到治療家蠶微粒子病的效果，兩種方式的使用濃度分別為1 000 mg/L和1.0 g/kg。多個(gè)報(bào)道都認(rèn)為藥物對(duì)微粒子病有較好的治療效果，但也存在一定的局限性，如受孢子濃度及治療時(shí)期等影響，而且這些藥物在生產(chǎn)中應(yīng)用不廣。今后的原種繁育中，可以引進(jìn)這些藥物進(jìn)行試驗(yàn)比較，研究防微效果及對(duì)后代蠶種的影響。

3.2.2 桑葉消毒效果 桑葉消毒對(duì)蠶種生產(chǎn)防治微粒子病效果明顯[11-14]，但在原種生產(chǎn)中有的批次還是超毒。分析認(rèn)為，消毒效果還受桑葉含水量、野外昆蟲(chóng)密度及消毒機(jī)器設(shè)計(jì)的局限性等因素影響。雨天，桑葉潮濕，葉片之間粘合度高，即使有人工在喂葉平臺(tái)對(duì)桑葉進(jìn)行抖松，但還是不能保證每張葉片分離開(kāi)，正反面都浸泡在消毒液中。野外昆蟲(chóng)多發(fā)的季節(jié)，如果野外昆蟲(chóng)感染微粒子病，病蟲(chóng)尸體在消毒后清洗的過(guò)程中破碎，粘附到桑葉上，后續(xù)只經(jīng)過(guò)脫水和晾干程序，沒(méi)有再進(jìn)行消毒，仍會(huì)造成桑葉二次污染，影響消毒效果。現(xiàn)在研發(fā)使用的自動(dòng)化桑葉全程消毒清洗系統(tǒng)是利用傳輸帶在消毒水中傳送桑葉進(jìn)行消毒，可能會(huì)存在有些桑葉或者野外昆蟲(chóng)沒(méi)達(dá)到預(yù)期設(shè)定的消毒效果就到達(dá)終點(diǎn)。后續(xù)應(yīng)在消毒前保持桑葉表面干燥、改變消毒程序、改進(jìn)消毒機(jī)器等方面進(jìn)行研究。如進(jìn)行熱風(fēng)烘干桑葉后再經(jīng)過(guò)機(jī)器消毒，把二級(jí)清洗程序的后一級(jí)清洗改成二氧化氯消毒，傳輸帶傳送桑葉進(jìn)入消毒水的程序改為模擬人工浸泡桑葉，在消毒水停留一定時(shí)間，保證消殺病原效果。

3.2.3 家蠶品種對(duì)微粒子病的抗性差異 2003年沈中元[15]對(duì)138個(gè)保存家蠶品種進(jìn)行了微粒子病抗性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)在同一系統(tǒng)中，中系品種除了個(gè)別品種表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，大部分品種處在一般水平，品種之間抗性差異不顯著，而日系品種之間抗性差異表現(xiàn)顯著，有的品種抗性差20倍，且表現(xiàn)較強(qiáng)抗性水平的品種數(shù)也明顯多于中系品種。在不同系統(tǒng)之間，處在抗性較強(qiáng)水平的品種中，歐洲系統(tǒng)品種占多數(shù)，其次是日系和中系品種，而抗性弱的多數(shù)為多化性品種。2011年邢東旭[16]對(duì)50個(gè)品種資源做微粒子病抗性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)二化性中系和二化性日系品種間沒(méi)有顯著性差異，而多化性品種與二化性中系和二化性日系間均存在顯著性差異，多化性品種抗性總體高于二化性中系和二化性日系品種。廣西原種生產(chǎn)中經(jīng)常出現(xiàn)日系比中系更易感病，與文獻(xiàn)所述情況不一致，說(shuō)明微粒子病發(fā)生還與錯(cuò)綜復(fù)雜的外界因素有關(guān)。研究不同品種之間對(duì)微粒子的抗性差異，可為抗微粒子病家蠶品種的育成提供參考，而抗微粒子病品種的出現(xiàn)，可有效降低家蠶微粒子病的發(fā)生率。

3.2.4 微粒子病檢測(cè)技術(shù) 微粒子病傳統(tǒng)檢測(cè)方法是用肉眼通過(guò)顯微鏡觀察Nb孢子形態(tài)進(jìn)行判斷，此方法比較費(fèi)時(shí)，靈敏度低，誤差率高，存在較多人為因素影響。微粒子病檢測(cè)技術(shù)還有分子生物學(xué)技術(shù)、蛋白質(zhì)水平的免疫學(xué)檢測(cè)方法等。分子生物學(xué)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。如多重PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，但所需儀器特殊、操作繁瑣。免疫學(xué)方法具有可行性強(qiáng)、靈敏度高、快速等優(yōu)點(diǎn)，如免疫熒光抗體法、電化學(xué)免疫傳感器檢疫法，但存在非特異性反應(yīng)和交叉反應(yīng)。因此這些檢測(cè)方法在生產(chǎn)中應(yīng)用受限，走向?qū)嵱没€有一定距離。隨著家蠶微孢子蟲(chóng)功能基因的深入研究，相信今后將會(huì)研究出快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效并具有生產(chǎn)實(shí)用性的家蠶微孢子蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)。