玉竹黃酮提取純化及體外抗氧化研究

李素紅，江明珠，姜曉坤,2，李天嬌,2，李鳳林,2，程碧君,2*

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學院食品工程學院，吉林吉林 132101；2.吉林省釀造技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林吉林 132101）

玉竹又稱尾聲、鈴鐺菜、竹根七、田草根等，為百合科黃精屬多年生草本植物，廣泛分布于我國北方、東部和中部，其中吉林、陜西等省均有大面積人工種植。新鮮的玉竹根部是淺黃色或淺白色，干燥后為棕黃色或深棕色。玉竹是一種藥食同源植物，干燥的根莖是我國常用的中藥材之一，具有潤燥、養(yǎng)陰、除煩祛暑、止渴等作用。玉竹中的活性物質(zhì)主要有多糖、黃酮、皂苷、生物堿等，現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，玉竹及其提取物有抗衰老、抗氧化、降血脂、降血糖、改善心血管疾病等多種功效[1-2]。因此近年來玉竹研究成為熱點。

黃酮類化合物是某一類具有相同或相似化學結(jié)構(gòu)和活性物質(zhì)的天然化合物的統(tǒng)稱，自然界中分布廣泛，在蔬菜、水果的根莖葉中均有存在[3]。黃酮類化合物也是一類天然色素，在植物中有一定的含量[4]。黃酮類化合物具有保護心血管、抗炎以及保肝的功效，還具有抗氧化性，能夠抑制細胞的退化、衰老[5]。因此，對黃酮類化合物的研究成為國內(nèi)外天然藥物開發(fā)和研究的熱點，但目前玉竹黃酮提取及純化方面的文獻報道很少。本試驗以玉竹為研究對象，采用超聲波輔助法提取黃酮，經(jīng)過單因素和正交試驗，得出最佳提取工藝；在此基礎(chǔ)上，采用D-101 大孔樹脂對玉竹粗黃酮進行純化，主要以黃酮吸附速率和解吸速率作為純化的指標；采用清除自由基試驗來判定純化后玉竹黃酮的抗氧化性，為玉竹黃酮的大規(guī)模開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原料與試劑

三年生圓葉玉竹，由吉林農(nóng)業(yè)科技學院食品工程學院基地提供；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、鹽酸、水楊酸、VC、FeSO4由食品工程學院理化實驗室提供；98%蘆丁標準品（153-18-4）購自圖林實驗耗材（南昌）；DPPH、Tris-HCl 緩沖溶液購自沃瑞達斯實驗試劑耗材（南京）；大孔樹脂購自凱威化工專供店（杭州）；鄰苯三酚，購自安吉達實驗科技公司（青島）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

F-008S 超聲波清洗器，蘇州邁弘電器有限公司；V-T5/PC 紫外可見分光光度計，屹譜儀器制造有限公司；BO-150P2 粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；FA1004 電子分析天平，寧波市江東歐億檢測儀器有限公司；TG18-WS 離心機，長沙湘銳離心機有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玉竹黃酮的提取及測定

（1）玉竹黃酮的提取

新鮮玉竹切成薄片、放入60 ℃烘箱，烘干至恒質(zhì)量，取出用粉碎機粉碎，過60 目篩備用。稱取玉竹粉末，分別放置在不同的錐形瓶中，選用不同的乙醇濃度、料液比和超聲時間，在超聲波清洗器中提取。提取完成后，置于離心機中離心，澄清后取上清液。

（2）標準曲線的繪制

在50 mL 容量瓶加入10 mg 蘆丁標準品，再加入50%乙醇至刻度線，將蘆丁對照品溶液的濃度配置為0.2 mg/mL[6]。取6 個50 mL 容量瓶，標號為A～F，A 號容量瓶做空白對照，其他依次加入蘆丁溶液2、4、6、8、10 mL，每個容量瓶中加入0.4 mL NaNO2（5%）溶液，混勻，放在實驗臺上靜置6 min 后，加入0.4 mL Al(NO3)3（10%）溶液，混勻，繼續(xù)靜置6 min，在每個容量瓶中加入4 mL NaOH（4%）溶液，并用50%乙醇定容，混勻，繼續(xù)放置15 min，在波長512 nm 處測吸光度，制作標準曲線[7]。

（3）玉竹黃酮總含量的測定

玉竹黃酮質(zhì)量及得率的計算公式見式（1）（2）。

式中，c-提取液黃酮的濃度，mol/L；V1-提取液的總體積，mL；V2-制備供試液溶液定容體積，mL；V3-量取用于制備供試液溶液體積，mL；m0-總黃酮質(zhì)量，mg；m1-玉竹粉的質(zhì)量，g。

（4）單因素試驗

稱5.0 g 玉竹粉末，放置在錐形瓶中，分別設(shè)計不同試驗因素：乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%），液料比（5:1、10:1、15:1、20:1、25:1，mL/g），超聲時間（10、20、30、40、50 min），超聲功率（40、60、80、100、120 W），分析各因素對玉竹黃酮提取率的影響，在此基礎(chǔ)上，采用正交試驗優(yōu)化提取工藝。

（5）正交試驗

根據(jù)單因素得出最佳結(jié)果，進行四因素三水平的正交試驗；根據(jù)玉竹黃酮的提取率確定最佳提取條件。正交試驗設(shè)計見表1。

表1 超聲法提取玉竹黃酮正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal design of ultrasonic extraction of flavonoids from Polygonatum odoratum

1.2.2 玉竹黃酮的純化

（1）樹脂的預處理

根據(jù)鐘方麗等[8]的純化工藝，確定采取D-101 型大孔樹脂進行純化。將準確稱量的大孔樹脂加入錐形瓶中，并加入95%乙醇浸泡4 h，倒出浸泡液，再用純凈水清洗，要求洗出液澄清無混濁，且呈中性后備用。

吸附率、解析率的計算公式見式（3）（4）。

式中，c0-吸附之前的濃度，mol/L；c1-吸附之后的濃度，mol/L；c2-解析之后的濃度，mol/L。

（2）試驗設(shè)計

取備用玉竹黃酮溶液，分別設(shè)計不同試驗因素：吸附pH（6、7、8、9、10），吸附時間（1、2、3、4、5 h），吸附液料比（5:1、10:1、15:1、20:1、25:1，mL/g），不同乙醇用量（10、15、20、25、30 mL），對玉竹黃酮進行純化，按上述方法測定吸光度，通過對玉竹黃酮吸附率和解析率的影響來確定最佳的純化條件。

1.3 體外抗氧化研究

1.3.1 清除DPPH 自由基

稱量7.96 mg DPPH 放在100 mL 容量瓶里，再加入50%乙醇至刻度線，配成濃度為0.2 mo1/L 的DPPH 溶液，放置在黑暗的地方保存（0～4 ℃）。向5 支干凈試管中加入5 mL 事先準備好的不同濃度梯度的玉竹黃酮溶液，依次加入5 mL DPPH 溶液，混合均勻后放置在黑暗中30 min，測定吸光度為A1；另取5 支試管分別加入5 mL、50%乙醇溶液，分別向試管中加入不同濃度的玉竹黃酮溶液5 mL，混合均勻后放置在黑暗中30 min，測吸光度為A2，再拿1 支試管，放入5 mL DPPH 溶液和5 mL、50%乙醇溶液，混勻后放置在黑暗中30 min，測定吸光度為A0[9-10]。以相同濃度的VC 代替玉竹黃酮溶液進行對照試驗。清除率的計算公式見式（5）。

1.3.2 清除超氧陰離子自由基

取5 支潔凈試管放在25 ℃恒溫水浴鍋里，加入4.5 mL Tris-HCl 緩沖溶液（0.05 mol/L、pH=8.0），水浴20 min，然后加入不同濃度的玉竹溶液2 mL 及鄰苯三酚1 mL（30 mmol/L），混勻，水浴8 min，再加入12 mol/L 鹽酸2滴，10 min 后在320 nm 測吸光度A1；另取5 支試管按上述的方法操作，將Tris-HCl 緩沖溶液換成蒸餾水，其余的條件不變，在320 nm 測吸光度A2；再另取1 支試管將玉竹溶液換成蒸餾水，其余條件不變，測定吸光度為A0[11-12]。以相同濃度的VC 代替玉竹黃酮溶液進行對照試驗，清除率的計算公式見式（6）。

1.3.3 清除羥基自由基

吸取不同濃度的玉竹溶液2 mL，分別加入5 支干凈的試管，然后依次加入6 mmol/L FeSO42 mL，0.3%H2O22 mL，混勻放置10 min，加入2 mL 6 mmol/L 水楊酸，混勻后在30 ℃恒溫水浴鍋中靜置30 min，測定吸光度為A1，另取5 支試管將H2O2換成蒸餾水，則其余條件不變，測定吸光度為A2，再另取1 支試管將玉竹溶液換成蒸餾水，則其余條件不變，測定吸光度為A0[13]。以相同濃度的VC 代替玉竹黃酮溶液進行對照試驗。清除率的計算公式見式（7）。

2 結(jié)果與分析

2.1 制作標準曲線

以蘆丁對照品溶液的吸光度值為縱坐標，質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.0503X-0.038 9，R2=0.997 9。結(jié)果表明，蘆丁在范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 提取玉竹黃酮

2.2.1 不同濃度乙醇對玉竹黃酮提取率的影響

由圖1 可以看出，玉竹中黃酮的提取率隨著乙醇濃度的增加先增加后減少，當乙醇濃度為40%時，玉竹黃酮提取率最高，為0.616 2%。

2.2.2 不同液料比對玉竹黃酮提取率的影響

由圖2 可知，隨著液料比的增加，玉竹黃酮提取率先增加后減少，當液料比為10:1（mL/g）時，黃酮的提取率最高，為0.458 2%。

2.2.3 不同超聲時間對玉竹黃酮提取率的影響

由圖3 可以看出，黃酮的提取率隨著超聲時間的增加先升高后急劇下降。當超聲時間為40 min 時，玉竹黃酮的提取率最高，為0.445 2%

2.2.4 不同超聲功率對玉竹黃酮提取率的影響

由圖4 可以看出，黃酮的提取率隨著超聲功率的增加先上升后下降，當超聲功率為80 W 時，提取率最高，為0.598 3%。

2.2.5 玉竹黃酮超聲波輔助提取的正交試驗結(jié)果

從表2 得出，影響玉竹黃酮提取率的因素為D＞A＞B＞C，即超聲功率影響最大，超聲時間影響最小；提取最佳條件是A3B1C3D2，即乙醇濃度為45%，液料比為7:1（mL/g），超聲時間為45 min，超聲功率80 W，提取率為0.517 4%。

表2 超聲法提取玉竹黃酮正交試驗結(jié)果表Table 2 Orthogonal test for extraction of flavonoids from Polygonatum odoratum by ultrasonic method

2.3 玉竹黃酮的純化試驗

2.3.1 不同pH 對玉竹黃酮吸附率的影響

由圖5 可以看出，吸附液中pH＜8 時，玉竹中黃酮的吸附率隨著pH 的增加而持續(xù)提高；當pH＞8 時，黃酮的吸附率隨pH 的增加而急劇下降。因此，綜合考慮選擇pH8 較佳。

2.3.2 不同吸附時間對玉竹黃酮吸附率的影響

由圖6 可以看出，吸附時間為3 h 時，玉竹黃酮的吸附率隨時間的增加而持續(xù)提高；當時間大于3 h 時，黃酮的吸附率隨著時間的增加而急劇下降。因此，綜合考慮吸附時間選擇3 h。

2.3.3 不同液料比對玉竹黃酮吸附率的影響

由圖7 可以看出，當液料比小于15:1（mL/g）時，玉竹中黃酮的吸附率隨著吸附液料比的增加而持續(xù)提高；當吸附液料比大于15:1（mL/g）時，黃酮的吸附率隨著吸附液料比的增加而急劇下降。因此，綜合考慮液料比選擇15:1（mL/g）。

2.3.4 不同乙醇用量對玉竹黃酮解析率的影響

由圖8 可以看出，解析液中乙醇用量小于20 mL時，玉竹中黃酮的解析率隨著乙醇用量的增加而持續(xù)提高；當乙醇用量大于20 mL 時，黃酮的解析率隨著乙醇用量的增加而急劇下降。因此，綜合考慮乙醇用量選擇20 mL。

2.4 玉竹黃酮體外抗氧化試驗

2.4.1 DPPH 自由基清除能力測定

由圖9 可知，在玉竹黃酮的不同濃度條件下，清除率呈現(xiàn)良好的上升狀態(tài)，并無拐點出現(xiàn)。與VC 相比，玉竹黃酮清除DPPH 的效果稍好。由此可知，玉竹黃酮有較強的清除DPPH 自由基的能力。

2.4.2 超氧陰離子自由基清除能力測定

由圖10 可知，在玉竹黃酮的不同濃度條件下，清除率呈現(xiàn)良好的上升狀態(tài)，并無拐點出現(xiàn)。與VC 相比，玉竹黃酮清除超氧陰離子的效果要好?？梢姡裰顸S酮對超氧陰離子自由基有較好的清除能力。

2.4.3 羥基自由基清除能力測定

從圖11 可知，在玉竹黃酮不同濃度的條件下，清除率呈現(xiàn)良好的上升狀態(tài)，并無拐點出現(xiàn)。與VC 相比，玉竹黃酮VC 清除羥基自由基的效果要稍好。由此可知，玉竹黃酮溶液對羥基自由基具有較好的清除能力。

3 結(jié)論

本試驗選用玉竹為原材料，使用超聲波輔助法提取玉竹黃酮，試驗得出最佳工藝條件為乙醇濃度45%，料液比7:1（mL/g），超聲時間45 min，超聲功率80 W，此條件下黃酮提取率達到0.517 4%。采取D-101 大孔樹脂純化粗玉竹黃酮溶液，最優(yōu)純化工藝為pH 8，吸附時間3 h，吸附料液比15:1（mL/g），乙醇用量20 mL。通過對玉竹黃酮抗氧化能力的測定，得出玉竹黃酮溶液具有抗氧化的能力，這為玉竹黃酮的抗氧化性試驗提供了指導，為抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供了技術(shù)依據(jù)，也為當?shù)赜裰褓Y源的合理開發(fā)提供了一條有效的途徑。